查日維， 謝曉梅， 楊 沫， 周亞菁， 吳 茜， 王 鍵

（安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院， 現(xiàn)代中藥安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 安徽省 “115” 新安醫(yī)藥研究與開發(fā)產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)， 安徽 合肥 230031）

基于層次分析法的多指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)優(yōu)選宣木瓜提取方法

查日維， 謝曉梅*， 楊 沫， 周亞菁， 吳 茜， 王 鍵

（安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院， 現(xiàn)代中藥安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 安徽省 “115” 新安醫(yī)藥研究與開發(fā)產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)， 安徽 合肥 230031）

目的 優(yōu)選制備宣木瓜生物活性成分提取物的提取方法。方法 比較滲漉提取法、超聲提取法和回流提取法，以齊墩果酸、 熊果酸、 可滴定總有機(jī)酸、 總多酚、 總多糖的量以及提取物收率為考察指標(biāo)， 采用層次分析法 （AHP）確立權(quán)重，以多指標(biāo)綜合評(píng)分法對(duì)提取方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果 3種提取方法所得宣木瓜提取物的收率及各類成分含有量有較大的差異， 最佳提取方法為回流提取法， 一致性檢驗(yàn)結(jié)果 （CR＜0.1） 表明權(quán)重系數(shù)合理有效。 結(jié)論 基于AHP法的多指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)提取方法具有科學(xué)性和準(zhǔn)確性， 研究?jī)?nèi)容可為宣木瓜提取物的制備和質(zhì)量控制提供參考。

宣木瓜；提取方法；層次分析法；多指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)

宣木瓜，又名皺皮木瓜、鐵腳梨，為薔薇科植物貼梗海棠 Chaenomelesspeciosa （ Sweet） Nakai的近成熟果實(shí)； 是安徽道地藥材；有舒筋活絡(luò)、和胃化濕功效，中醫(yī)臨床用于濕痹拘攣、腰膝關(guān)節(jié)酸重疼痛、暑濕吐瀉、轉(zhuǎn)筋攣痛、腳氣水腫［1］。 研究表明， 宣木瓜中富含具有鎮(zhèn)痛抗炎作用的有機(jī)酸類化合物、增強(qiáng)免疫活性及抗氧化作用的三萜類化合物、對(duì)胃腸平滑肌有松弛作用的黃酮類化合物以及具有抗氧化活性作用的多糖類化合物［2-5］。 近年來已有對(duì)木瓜提取物的藥效研究［6-9］， 但鮮見木瓜提取物提取方法評(píng)價(jià)的報(bào)道。中藥提取物是對(duì)藥材的深度加工，具有技術(shù)水平高、產(chǎn)品附加值大， 質(zhì)量易于控制等優(yōu)勢(shì)［10］。 本研究在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上， 采用先用 75%乙醇提取， 殘?jiān)儆盟崛〉姆椒ㄖ苽湫竟咸崛∥铮?通過對(duì)提取物中齊墩果酸 （oleanolic acid， OA） 和熊果酸 （ ursolic acid， UA） 、 可滴定總有機(jī)酸、總多酚、總多糖四類活性成分的定量測(cè)定，比較超聲、回流、滲漉3種常用中藥提取方法，結(jié)合提取物收率，采用 AHP綜合評(píng)判， 優(yōu)選宣木瓜最佳提取方法， 以期為宣木瓜提取物的制備、質(zhì)量控制及后續(xù)研究提供科學(xué)依據(jù)和參考資料。

1 儀器和材料

1.1 儀器 Agilent1260 高 效 液 相 色 譜 儀 （ Agilent公 司）；756MC紫外可見分光光度計(jì) （上海精密科學(xué)儀器有限公司） ； BP221D電子 天 平 （ Sartorius公 司 ） ； KQ-250DB數(shù) 控超聲波清洗器 （ 江蘇省昆山市超聲儀器有限公司） ； Milli-Q實(shí)驗(yàn)室超純水系統(tǒng) （ Merck Millipore公司） ； pH S-3CT型精密酸度計(jì) （上海大普儀器有限公司）； 電磁攪拌器； HHS型電熱恒溫水浴鍋 （上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）。

1.2 試藥 宣木瓜來源于安徽宣城， 經(jīng)本院彭華勝教授鑒定為貼梗海棠 Chaenomeles sepciosa （ Sweet） Nakai的近成熟果實(shí)； 齊墩果酸 （ 批號(hào)為 110709-200505）、 熊果酸 （批號(hào)為 110742-200516）、 沒食子酸 （批號(hào)為 110831-200302） 對(duì)照品由中國藥品生物制品檢定所提供；鄰苯二甲酸氫鉀為基準(zhǔn)物質(zhì)；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取方法 精密稱取宣木瓜粗粉 5 g， 采用常規(guī)提取條件，按下述方法進(jìn)行提取試驗(yàn)，各方法平行兩份。

2.1.1 超聲提取 加 75%乙醇 60 mL于樣品中， 浸泡 0.5 h， 室溫超聲 1 h， 濾過， 濾渣加 60 mL水浸泡 0.5 h， 室溫超聲1 h， 濾過， 合并濾液， 濃縮， 真空干燥至恒定質(zhì)量。

2.1.2 回流提取 加 75%乙醇 60mL于樣品中， 浸泡 0.5 h， 80 ℃回流 1 h， 濾過， 濾渣加 60mL水浸泡 0.5 h， 100℃回流 1 h， 濾過， 合并濾液， 濃縮， 真空干燥至恒定質(zhì)量。

2.1.3 滲漉提取 加 75%乙醇 180mL于樣品中， 浸泡 24 h， 以 3 mL/min 體積流量滲漉， 濾渣加 180 mL水浸泡 0.5 h， 以 3 mL/min 體積流量滲漉， 合并滲漉液， 濃縮， 真空干燥至恒定質(zhì)量。

2.2 多指標(biāo)成分測(cè)定方法

2.2.1 HPLC法測(cè)定齊墩果酸和熊果酸［11］

2.2.1.1 供試品溶液的制備 分別精密稱取 “2.1” 項(xiàng)下提取方法所制得的提取物 0.35 g， 置具塞錐形瓶中， 精密加甲醇 25mL， 密塞， 稱定質(zhì)量， 超聲處理 （功率 250 W，頻率 40 kHz） 20 min， 放冷， 再稱定質(zhì)量， 用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量， 搖勻， 濾過， 棄去初濾液， 續(xù)濾液過 0.45 μm濾膜，備用。

2.2.1.2 齊墩果酸、 熊果酸對(duì)照品溶液的制備 精稱齊墩果酸對(duì)照品 3.82 mg， 加甲醇溶解， 定容至 10 mL量瓶中，得齊墩果酸貯備液。 精稱熊果酸對(duì)照品4.34mg， 加甲醇溶解， 定容至10mL量瓶中， 得熊果酸貯備液。 分別精密量取各貯備液適量混合， 得每1 mL含齊墩果酸0.191 mg、 熊果酸 0.217 mg。

2.2.1.3 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 用 Shim-packCLCODS （M） 色譜柱 （250 mm×4.6 mm， 5 μm）， 甲醇-水-冰乙酸-三乙胺 （265 ∶35 ∶0.1 ∶0.05） 為流動(dòng)相， 體積流量0.6mL/min； 柱 溫 20 ℃， 檢測(cè) 波 長(zhǎng) 210 nm， 進(jìn)樣 量 20 μL。 齊墩果酸理論塔板數(shù)在16 000以上， 齊墩果酸和熊果酸分離度達(dá) 1.6。 3 種提取方法所得提取物的 HPLC譜圖見圖1。 各提取物中齊墩果酸和熊果酸的量按外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算。

圖1 宣木瓜提取物 HPLC譜圖

2.2.2 電位滴定法測(cè)定總有機(jī)酸［12］

2.2.2.1 供試品溶液的制備 分別精密稱取 “2.1” 項(xiàng)下各提取方法所制得的提取物 0.45 g至錐形瓶中， 精密加水30mL， 超聲 30 min， 冷卻至室溫， 稱重， 加水補(bǔ)足減失的質(zhì)量，抽濾，棄去初濾液，續(xù)濾液備用。

2.2.2.2 測(cè)定方法 精密量取供試品溶液 15 mL， 按電位滴定法 （ 《中國藥典》 2010 年版一部附錄ⅧA）， 用已標(biāo)定濃度的 NaOH標(biāo)準(zhǔn)液 （0.056 8 mol/L） 滴定至終點(diǎn)。 利用Origin 6.0 Professional軟件繪制滴定曲線， 由二級(jí)微商內(nèi)插法計(jì)算滴定終點(diǎn)，以蘋果酸計(jì)，按下式計(jì)算各提取物中可滴定總有機(jī)酸量。

式中： C為氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度 （mol/L）， V為計(jì)量點(diǎn)時(shí)消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積 （mL）， V0為空白時(shí)消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積 （m L）， M為蘋果酸摩爾質(zhì)量（g/mol）， W為提取物質(zhì)量 （g）。

2.2.3 福林-酚比色法測(cè)定總多酚

2.2.3.1 供試品溶液的制備 分別精密稱取 “2.1” 項(xiàng)下提取方法所制得的提取物 0.15 g， 至錐形瓶中， 精密加水30mL， 放置過夜， 超聲 10 min， 濾過， 棄去初濾液， 續(xù)濾液備用。

2.2.3.2 沒食子酸對(duì)照品溶液的制備 精稱沒食子酸對(duì)照品適量，置棕色量瓶中，加水溶解、稀釋至刻度，得每1 m L含沒食子酸 0.322 mg。

2.2.3.3 測(cè)定方法 按 《中國藥典》 2010 年版一部附錄ⅩB總酚測(cè)定法， 精密量取供試品溶液2mL至25 mL量瓶中， 加磷鉬鎢酸 1.0mL、 水 10.0mL， 用 7.5%Na2CO3定容至 25mL， 暗處放置 3 h， 照紫外-可見分光光度法 （ 附錄ⅤA）， 在 400 ～800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描紫外吸收光譜，于最大吸收波長(zhǎng) 763 nm處測(cè)定各樣品吸光度， 利用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算各提取物中總多酚的量。

2.2.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別精密量取沒食子酸對(duì)照品溶液 0.030、 0.070、 0.20、 0.40、 0.80、 1.0 mL至 25 mL量瓶中， 加磷鉬鎢酸 1.0 mL， 再加水至 13 mL， 用 7.5% Na2CO3定容至刻度， 暗處放置 3 h， 以相應(yīng)試劑溶液為空白， 在 763 nm 處 測(cè) 定 吸 光 度。 得 到 回 歸 方 程 為 Y= 114.85X+0.103 1， r=0.999 5， 沒食子酸在 0.386 ～12.9 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

2.2.4 硫酸-苯酚法測(cè)定總多糖［13］

2.2.4.1 供試品溶液的制備 分別精密稱取 “2.1” 項(xiàng)下提取方法所制得的提取物 0.45 g， 至錐形瓶中， 精密加水30 mL， 超聲 30 min， 冷卻至室溫， 稱重， 加水補(bǔ)足減失的質(zhì)量， 抽濾， 棄去初濾液， 精密量取續(xù)濾液 2 mL至 10 mL離心管中， 加無水乙醇 8mL； 離心 （4 000 r/min） 1 h， 棄去上清液， 沉淀加水溶解， 定容至25mL量瓶中， 備用。

2.2.4.2 葡萄糖對(duì)照品溶液的制備 精稱葡萄糖對(duì)照品適量， 置量瓶中， 加水溶解、稀釋至刻度， 得每1 mL含葡萄糖0.099 2 mg。

2.2.4.3 測(cè)定方法 精密量取供試品溶液 1 mL至具塞試管， 加 5%苯酚 1.0 mL， 混勻； 加濃硫酸 6.0 mL， 立即搖勻； 沸水浴加熱 10min， 冷卻至室溫； 照紫外-可見分光光度法 （附錄ⅤA） 在 400 ～800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描紫外吸收光譜， 于最大吸收波長(zhǎng) 485 nm處測(cè)各樣品吸光度， 利用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算各提取物中總多糖的量。

2.2.4.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密量取葡萄糖對(duì)照品溶液0.10、 0.20、 0.40、 0.80、 1.0 mL至具塞試管中， 加水至1.0 mL， 加 5%苯酚 1.0 m L混勻， 加濃硫酸 6.0 mL， 立即搖勻， 沸水浴 10min， 冷卻至室溫， 以相應(yīng)試劑溶液為空白， 在 485 nm處測(cè)吸光度。 得回歸方程 Y=4.260 8X+ 0.114 1， r=0.999 4， 葡萄糖在 9.92 ～99.20 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

2.3 AHP法確定多指標(biāo)權(quán)重系數(shù) 層次分析法 （ Analytical Hierarchy Process， AHP）［14］是 將評(píng)價(jià)目標(biāo)分 為 若 干層次和若干指標(biāo)，依照不同權(quán)重進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)的方法。本研究將評(píng)價(jià)體系設(shè)計(jì)為三層， 如圖2。 引入九分位的相對(duì)重要的比例標(biāo)度［15］， 由評(píng)估主體確定各指標(biāo)的相對(duì)重要性， 并將結(jié)果形成判斷矩陣，結(jié)果見表1。

圖2 宣木瓜最佳提取方法層次結(jié)構(gòu)模型

表1 宣木瓜提取方法優(yōu)選指標(biāo)層的矩陣

使用AHP分析軟件進(jìn)行具體計(jì)算， 求得齊墩果酸和熊果酸、總有機(jī)酸、總多酚及總多糖各指標(biāo)權(quán)重系數(shù)為：0.564、 0.263、 0.118 和 0.055。 隨機(jī)一致性比率 CR=CI/ RI， 當(dāng) CR＜0.1 時(shí)， 判斷矩陣具有滿意的一致性及權(quán)重計(jì)算正確性。 本次試驗(yàn)的一致性比率為 CR=0.043 ＜0.1， 表明權(quán)重計(jì)算正確。

2.4 結(jié)果

2.4.1 提取物得率 按 “2.1” 項(xiàng)下不同提取方法制備提取物， 得率見表2。

表2 不同提取方法所得提取物的得率

2.4.2 多指標(biāo)成分測(cè)定結(jié)果 按 “2.2” 項(xiàng)下測(cè)定方法對(duì)提取物進(jìn)行分析檢測(cè)，相同測(cè)定平行兩次，以平均值表示；并采用 AHP法確定的權(quán)重系數(shù)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)， 結(jié)果見表3。

3 結(jié)論與討論

3.1 最佳提取方法的確立 從表 3 中可以看出提取物中可滴定總有機(jī)酸、總多酚含有量高低順序?yàn)椋夯亓鞣ǎ境暦ǎ緷B漉法； 總多糖含有量高低順序?yàn)椋?回流法 ＞滲漉法＞超聲法；齊墩果酸和熊果酸總含有量高低順序?yàn)椋撼暦?＞回流法 ＞滲漉法。 基于 AHP的綜合評(píng)分法得到的評(píng)分高低順序?yàn)椋?回流法＞超聲法＞滲漉法。 由表2可見，3種不同的提取方法提取物得率順序?yàn)椋夯亓鞣ǎ緷B漉法＞超聲法；由此確立宣木瓜的最佳提取方法為回流提取法。

表3 宣木瓜不同提取方法的綜合評(píng)價(jià)

3.2 提取溶劑的選擇 在宣木瓜提取物的制備中， 兼顧傳統(tǒng)中藥的提取溶劑， 參考 《中國藥典》 2010 年版一部關(guān)于中藥成方制劑制備中的飲片提取工藝，在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上， 建立先用 75%乙醇提取， 再用水提取的工藝流程， 以期最大程度保持宣木瓜水溶性和脂溶性有效成分的整體性。

3.3 本實(shí)驗(yàn)對(duì)各指標(biāo)成分的定量測(cè)定方法均采用文獻(xiàn)報(bào)道的成熟方法，其方法學(xué)考察同文獻(xiàn)報(bào)道。在提取物考察指標(biāo)的選擇上，結(jié)合對(duì)宣木瓜傳統(tǒng)的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) “以味酸者為佳” 以及 《中國藥典》 2010 年版一部木瓜質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)含量測(cè)定指標(biāo)成分，選擇齊墩果酸和熊果酸、總有機(jī)酸為考察指標(biāo)；并綜合考慮宣木瓜中酚酸類和黃酮類化合物藥效學(xué)活性及多糖的活性，增加總多酚和多糖作為共同的考察指標(biāo)。

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R284.2

： B

： 1001-1528（2014）03-0643-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.03.047

2013-04-12

國家十二五科技支撐計(jì)劃 （2011BAI04B06） ； 安徽高校省級(jí)自然科學(xué)研究項(xiàng)目 （ KJ2012A188）

查日維 （1989—） ， 女， 碩士生， 研究方向： 中藥質(zhì)量分析。 Tel： （0551） 65169230， E-mail： 351772334@qq.com

*通信作者： 謝曉梅， 女， 教授， 碩士生導(dǎo)師。 Tel： （0551） 65169230， E-mail： xiexiaomei9401@sina.com