邢文婷， 張李峰， 衛(wèi)東鋒， 程衛(wèi)東，4*， 杜 娟

（1.蘭州大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究所， 甘肅 蘭州 730000； 2.蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)研究所， 甘肅 蘭州730000； 3.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)臨床基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所， 北京 100700； 4.南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院， 廣東 廣州 510515； 5.甘肅中醫(yī)學(xué)院護(hù)理學(xué)院， 甘肅 蘭州 730000）

紅芪替代補(bǔ)中益氣湯中的黃芪對(duì)老齡小鼠脾T淋巴細(xì)胞的影響

邢文婷1， 張李峰2， 衛(wèi)東鋒3， 程衛(wèi)東1，4*， 杜 娟5

（1.蘭州大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究所， 甘肅 蘭州 730000； 2.蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)研究所， 甘肅 蘭州730000； 3.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)臨床基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所， 北京 100700； 4.南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院， 廣東 廣州 510515； 5.甘肅中醫(yī)學(xué)院護(hù)理學(xué)院， 甘肅 蘭州 730000）

目的 比較含紅芪與含黃芪的補(bǔ)中益氣湯含藥血清對(duì)老齡小鼠脾 T淋巴細(xì)胞作用的影響。 方法 通過 MTT法檢測(cè)含紅芪和含黃芪的補(bǔ)中益氣湯含藥血清對(duì)老齡鼠脾淋巴細(xì)胞的刺激增殖作用，確定最佳稀釋濃度和作用時(shí)間；比較含紅芪和含黃芪的補(bǔ)中益氣湯含藥血清對(duì)脾 T淋巴細(xì)胞的增殖能力、 T淋巴細(xì)胞亞群百分比及細(xì)胞培養(yǎng)上清中 IL-2 的水平。 結(jié)果 當(dāng)含藥血清質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 40%， 時(shí)間為 48 h 時(shí)， 補(bǔ)中益氣湯含藥血清對(duì)老齡小鼠脾淋巴的促增殖作用最佳。含紅芪與含黃芪的補(bǔ)中益氣湯含藥血清均可改善老齡鼠脾 T淋巴細(xì)胞的增殖、 T細(xì)胞亞群中 CD28+T淋巴細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞培養(yǎng)上清中 IL-2 的水平。 含紅芪的補(bǔ)中益氣湯在提高老齡小鼠 T淋巴細(xì)胞的增殖能力和 IL-2 的分泌方面優(yōu)于含黃芪補(bǔ)中益氣湯 （P＜0.01）。 結(jié)論 含紅芪與含黃芪的補(bǔ)中益氣湯均可通過調(diào)節(jié) T淋巴細(xì)胞起到一定的抗免疫老化的作用， 且含紅芪的補(bǔ)中益氣湯在促進(jìn)脾細(xì)胞增殖和分泌 IL-2 方面優(yōu)于含黃芪的補(bǔ)中益氣湯， 具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

紅芪；黃芪；補(bǔ)中益氣湯；老齡小鼠脾T淋巴細(xì)胞；抗免疫老化

紅芪與黃芪同科異屬，是甘肅優(yōu)質(zhì)道地藥材［1］。紅芪和黃芪的性味、 功效與主治基本相同，自古二者不分，在我國(guó)西北地區(qū)尤甚［2］。 但目前黃芪野生資源幾近枯竭，引種黃芪形態(tài)變異，混雜現(xiàn)象嚴(yán)重［3］， 無(wú)法滿足中藥材市場(chǎng)對(duì)中藥黃芪的需求量。因此合理開發(fā)中藥紅芪資源以彌補(bǔ)黃芪資源的緊缺，具有一定的科學(xué)和實(shí)際意義。研究表明紅芪和黃芪雖在成 分上有一定差異［4-5］， 但 均具有免疫調(diào)節(jié) 作 用［6-7］， 而 且 作 用 十 分 相 似［8-9］， 說 明紅芪在免疫功能方面替換黃芪具有可行性。

中醫(yī)防治疾病的主要臨床應(yīng)用形式是以君、臣、佐、使組方為特征的中藥復(fù)方，并不是單味藥的累加［10］， 因此有必要研究作用于復(fù)方中的紅芪和黃芪可否替換。以黃芪為君藥的補(bǔ)中益氣湯提高免疫力的 功 效 也 已 得 到 驗(yàn) 證［11-13］， 且 紅 芪補(bǔ) 中 益氣湯與原方一樣具有免疫調(diào)節(jié)功能，用紅芪對(duì)T淋巴細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用優(yōu)于用黃芪［14］。 隨著人口老齡化的日趨加重，對(duì)衰老的研究也相應(yīng)增多。研究表明衰老過程中， 機(jī)體免疫系統(tǒng)最早最易受損［15］，且衰老和T淋巴細(xì)胞的關(guān)系已成為免疫老化學(xué)說研究的核心內(nèi)容［16］。

在前期工作中，實(shí)驗(yàn)組已證實(shí)復(fù)方玉屏風(fēng)散用黃芪在免疫調(diào)節(jié)作用和抗免疫老化方面與用紅芪具有相似性［17］。 為探討在其他復(fù)方中紅、 黃芪的可替換性，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步以相同劑量的紅芪代替黃芪，比較含紅芪與含黃芪補(bǔ)中益氣湯含藥血清對(duì)自然衰老小鼠脾T淋巴細(xì)胞的影響，研究其抗免疫老化作用。為開發(fā)紅芪的藥用價(jià)值提供可靠的理論依據(jù)，并為研究紅芪補(bǔ)中益氣湯和黃芪補(bǔ)中益氣湯抗免疫老化作用提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物 經(jīng)典補(bǔ)中益氣湯由炙黃芪、 黨參、炙甘草、 白術(shù) （炒）、 當(dāng)歸、 升麻、 柴胡、 陳皮組成，以同劑量紅芪代替黃芪，配伍成含紅芪的補(bǔ)中益氣湯。上述所用藥材均購(gòu)自蘭州市藥材市場(chǎng)，由蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院程衛(wèi)東教授鑒定合格，所用藥物劑量參照 《中國(guó)藥典》 2010 年版［18］， 并根據(jù)體表面積［19］換算得出小鼠的灌胃劑量為 4 g生藥 /（kg·d）。 將兩組藥材各加適量水浸泡0.5 ～1 h，煎兩次 （1.5 h， 1 h）， 混合濾液， 濃縮至 1 g生藥/mL， 4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 動(dòng)物 青齡健康昆明種小鼠 120 只， 體質(zhì)量18 ～22 g， 雌雄各半； 18 月齡健康昆明種老齡小鼠40 只， 體質(zhì)量 45 ～50 g， 雌雄各半， 上述小鼠均由蘭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格號(hào)：SKXK（甘） 201106-0014。

1.3 試劑 胎牛滅活血清 （杭州四季青生物工程材料有限公司）； 改良 RPMI-1640 培養(yǎng)基 （賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司）； EZ-SepTMMOUSE IX淋巴細(xì)胞分離液 （深圳達(dá)科為生物技術(shù)有限公司）； MTT（美國(guó) Sigma公司）； ConA （ 美國(guó) Sigma公司）； SDS （ 天津化學(xué)試劑一廠）； FITC-抗小鼠CD3、 PE-抗小鼠 CD28 單克隆抗體 （ Biolegend 公司）； IL-2 酶聯(lián)免疫吸附 （ ELISA） 試劑盒 （ 深圳達(dá)科為生物技術(shù)有限公司）。

1.4 儀器 A06061422 超凈臺(tái) （蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）； CO2培養(yǎng)箱 （日本 SANYO公司）；低溫冰箱 （日本 SANYO公司）；倒置顯微鏡 （德國(guó) OLYMPUS 公司）； TDL-40B型和 TGL-16G型離心機(jī) （上海安亭科學(xué)儀器廠）； 全自動(dòng)酶標(biāo)儀 （美國(guó) BIO-RAD 公 司）；流 式 細(xì) 胞 儀 （美 國(guó) 貝 克 曼COULTER公司）。

2 方法

2.1 含藥血清的制備 取 120 只健康昆明種小鼠隨機(jī)分為3組：紅芪補(bǔ)中益氣湯 （含紅芪的補(bǔ)中益氣湯水提物）、 黃芪補(bǔ)中益氣湯 （含黃芪的補(bǔ)中益氣湯水提物） 和空白血清組 （生理鹽水組）， 每組 40 只。 中藥組分別給予 4 g生藥/（kg·d）， 空白血清組給予 0.9%生理鹽水， 3 組灌胃量均為0.4mL/（20 g·d）， 每日 1 次，連續(xù) 15 d； 末次給藥后 1 h （灌胃前禁食， 自由飲水 12 h）［20］， 摘眼球取血， 待全血凝固后， 3 500 r/min 離心 15 min，收集血清，同組混合， 56 ℃、 30 min 水浴滅活后，用孔徑為 0.22 μm的濾器除菌分裝， -80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液的制備 老齡和青齡小鼠頸脫臼處死，超凈臺(tái)下無(wú)菌取其脾臟。嚴(yán)格按照EZ—SepTM小鼠淋巴細(xì)胞分離液的說明書提取脾淋巴細(xì)胞，制備老齡鼠和青齡鼠脾淋巴細(xì)胞懸液備用。

2.3 脾淋巴細(xì)胞增殖活性的測(cè)定［21］用完全 RPMI-1640 培養(yǎng)液稀釋上述 “2.1” 項(xiàng)制備好的紅芪補(bǔ)中益氣湯、黃芪補(bǔ)中益氣湯和空白血清組含藥血清， 使 含 藥 血 清 的 質(zhì) 量 分 數(shù) 分 別 為 1.25%、2.5%、 5%、10%、 20%、 40%、 80%。 調(diào)整上述“2.2”項(xiàng)制備的老齡鼠脾淋巴細(xì)胞懸液的細(xì)胞密度為 1 ×105個(gè)/mL， 加入 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板， 每孔100 μL， 再加入 3 組不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的含藥血清各100 μL， 每個(gè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)設(shè) 12 個(gè)復(fù)孔。同時(shí)設(shè)老齡組 （不加含藥血清老齡鼠脾淋巴細(xì)胞） 和青齡組（青齡鼠脾淋巴細(xì)胞）。 另設(shè)不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)含藥血清和只加完全 RPMI-1640 培養(yǎng)液的空白孔。 分別培養(yǎng)24 h、48 h 和 72 h 后， 加入終質(zhì)量濃度為 5 mg/mL的 MTT 20 μL， 孵育 4 h， 加入 100 μL 10%的 SDS， 吹打混勻， 37 ℃過夜， 于酶標(biāo)儀 570 nm處測(cè) OD值， 空白孔校正調(diào)零， 結(jié)果以 OD值表示。 根據(jù) MTT的結(jié)果選擇含藥血清的最佳稀釋質(zhì)量分?jǐn)?shù)和培養(yǎng)時(shí)間，與老齡小鼠脾淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)用于下述實(shí)驗(yàn)。

2.4 對(duì) ConA誘導(dǎo)的老齡小鼠脾 T淋巴細(xì)胞體外增殖的測(cè)定［22］取 “2.2”項(xiàng)制備出的老齡鼠脾淋巴細(xì)胞懸液， 細(xì)胞密度調(diào)整為 2 ×105個(gè)/mL， 加入 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板， 每孔 50 μL； 并分別加入“2.3” 項(xiàng)所確定的紅芪補(bǔ)中益氣湯、 黃芪補(bǔ)中益氣湯和空白血清組最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)含藥血清，每孔50 μL。老齡組和青齡組脾細(xì)胞懸液每孔 50 μL。每組樣本 8 個(gè)復(fù)孔， 其中 4 孔加 ConA 100 μL， 4孔不加 ConA。 設(shè)每組最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)含藥血清和只加 完 全 RPMI-1640 培 養(yǎng) 液 的 空 白 孔。 按 上 述“2.3”項(xiàng)所確定的最佳培養(yǎng)時(shí)間培養(yǎng) 48 h 后， 各孔加 MTT 20 μL（終質(zhì)量濃度為 5 mg/mL）， 孵育4 h， 加 100 μL 10%的 SDS， 吹打混勻， 37 ℃過夜， 于酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀 570 nm處測(cè) OD值， 空白孔校正調(diào)零，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用 OD值表示。最后按以下公式計(jì)算剌激指數(shù)： 刺激指數(shù) =ConA誘導(dǎo)孔 OD均值/無(wú) ConA孔 OD均值。

2.5 對(duì)老齡小鼠脾淋巴細(xì)胞 CD3 和 CD28 分子表達(dá)的測(cè)定 取上述 “2.2”項(xiàng)制備的老齡鼠脾淋巴細(xì)胞懸液， 調(diào)整細(xì)胞密度為 2 ×107個(gè)/mL， 加入24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板， 每孔 500 μL， 并 分別加入“2.3”項(xiàng)確定的紅芪補(bǔ)中益氣湯、 黃芪補(bǔ)中益氣湯和空白血清組最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)含藥血清， 每孔 500 μL， 老齡組和青齡組脾細(xì)胞懸液每孔 500 μL， 五組樣本均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。 培養(yǎng)48 h后， 收集細(xì)胞至2 mL離心管， 離心，將培養(yǎng)上清保留， -20 ℃保存?zhèn)溆谩?0.01 mol/L PBS 洗滌細(xì)胞沉淀， 1 mol/L PBS 重懸， 調(diào)整細(xì)胞數(shù)約為 1 ×107個(gè)/mL。 取各組細(xì)胞懸液 100 μL， 分別加 FITC-抗小鼠 CD3 1 μL，PE-抗小鼠 CD28 2.5 μL，輕輕混合，4 ℃避光孵育30 min，PBS 洗 1 次細(xì)胞， 2 500 r/min 離心 5 min，棄上清， 細(xì)胞沉淀中加 500 μL PBS， 混勻， 上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2.6 培養(yǎng)上清 IL-2 的測(cè)定 取 “2.5”項(xiàng)所得培養(yǎng)上清， 酶聯(lián)免疫吸附方法檢測(cè)培養(yǎng)上清 IL-2 的水平，操作步驟嚴(yán)格按說明書進(jìn)行，結(jié)果經(jīng)酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)測(cè)定 OD值，并根據(jù)對(duì)照品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線， 計(jì)算其質(zhì)量濃度， 單位為 pg/mL。

3 結(jié)果

3.1 含藥血清對(duì)脾淋巴細(xì)胞增殖活性的影響 結(jié)果如表1所示，隨著含藥血清質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高和細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，脾細(xì)胞的增殖活性先增加后減少。 在相同的培養(yǎng)時(shí)間下， 40%的含藥血清脾淋巴細(xì)胞增殖活性均高于其他質(zhì)量分?jǐn)?shù)組，與相同質(zhì)量分?jǐn)?shù)空白血清組比較，脾淋巴細(xì)胞增殖活性均顯著增高 （P＜0.01）， 且紅芪補(bǔ)中益氣湯優(yōu)于黃芪補(bǔ)中益氣湯 （P＜0.05）。 同時(shí)， 培養(yǎng) 48 h 的增殖活性優(yōu)于 24 h 和 72 h。 因此將含藥血清定為 40%，培養(yǎng)時(shí)間定為48 h作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的研究條件。

表1 含黃芪和含紅芪補(bǔ)中益氣湯含藥血清與脾細(xì)胞增殖的時(shí)效量效關(guān)系 （， n=10）Tab.1 Time-effect and concentration-response relationship of Buzhong Yiqi Decoction containing Astragali Radix and con taining Hedysari Radix on sp leen cells（， n=10）

表1 含黃芪和含紅芪補(bǔ)中益氣湯含藥血清與脾細(xì)胞增殖的時(shí)效量效關(guān)系 （， n=10）Tab.1 Time-effect and concentration-response relationship of Buzhong Yiqi Decoction containing Astragali Radix and con taining Hedysari Radix on sp leen cells（， n=10）

注： 與青齡組比較，**P＜0.01； 與相同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的空白血清組比較，△△P＜0.01； 與相同血清質(zhì)量分?jǐn)?shù)黃芪補(bǔ)中益氣湯比較，▲P＜0.05

不同培養(yǎng)時(shí)間脾細(xì)胞增殖活性24 h 48 h 72 h青齡組分 組 質(zhì)量分?jǐn)?shù)/% 1.062 ±0.108 1.312 ±0.145 1.100 ±0.085老齡組 0.596 ±0.033** 0.682 ±0.075** 0.555 ±0.047**空白血清組 1.25 0.585 ±0.100 0.649 ±0.103 0.569 ±0.079空白血清組 2.5 0.580 ±0.057 0.684 ±0.119 0.611 ±0.073空白血清組 5 0.583 ±0.064 0.669 ±0.095 0.589 ±0.103空白血清組 10 0.609 ±0.070 0.681 ±0.092 0.623 ±0.111空白血清組 20 0.646 ±0.082 0.682 ±0.109 0.630 ±0.075空白血清組 40 0.651 ±0.074 0.737 ±0.040 0.646 ±0.045空白血清組 80 0.695 ±0.096 0.806 ±0.053 0.680 ±0.086黃芪補(bǔ)中益氣湯 1.25 0.584 ±0.078 0.647 ±0.103 0.587 ±0.065黃芪補(bǔ)中益氣湯 2.5 0.573 ±0.085 0.645 ±0.108 0.600 ±0.055黃芪補(bǔ)中益氣湯 5 0.583 ±0.076 0.707 ±0.125 0.589 ±0.068黃芪補(bǔ)中益氣湯 10 0.671 ±0.072 0.727 ±0.116 0.636 ±0.086黃芪補(bǔ)中益氣湯 20 0.754 ±0.071 0.822 ±0.118 0.797 ±0.125黃芪補(bǔ)中益氣湯 40 0.910 ±0.121△△ 0.984 ±0.029△△ 0.903 ±0.061△△黃芪補(bǔ)中益氣湯 80 0.750 ±0.109 0.793 ±0.149 0.786 ±0.130紅芪補(bǔ)中益氣湯 1.25 0.594 ±0.060 0.675 ±0.119 0.666 ±0.068紅芪補(bǔ)中益氣湯 2.5 0.696 ±0.057 0.657 ±0.077 0.651 ±0.071紅芪補(bǔ)中益氣湯 5 0.682 ±0.083 0.727 ±0.144 0.695 ±0.033紅芪補(bǔ)中益氣湯 10 0.741 ±0.129 0.720 ±0.145 0.698 ±0.108紅芪補(bǔ)中益氣湯 20 0.786 ±0.108 0.829 ±0.155 0.757 ±0.081紅芪補(bǔ)中益氣湯 40 0.949 ±0.107△△ 1.071 ±0.102△△▲ 0.946 ±0.045△△紅芪補(bǔ)中益氣湯80 0.770 ±0.077 0.875 ±0.079 0.777 ±0.084

3.2 對(duì) ConA誘導(dǎo)的老齡小鼠脾 T淋巴細(xì)胞體外增殖的影響 結(jié)果如表2所示，與青齡組比較，老齡組脾淋巴細(xì)胞體外自身增殖、 ConA誘導(dǎo)增殖能力和刺激指數(shù)明顯降低 （P＜0.01）。 含紅芪和含黃芪的補(bǔ)中益氣湯含藥血清分別作用于老齡小鼠脾淋巴細(xì)胞，與空白血清組比較，增殖能力和刺激指數(shù)均升高 （P＜0.05）。且含紅芪補(bǔ)中益氣湯效果優(yōu)于含黃芪補(bǔ)中益氣湯 （P＜0.05）。

3.3 對(duì)老齡小鼠脾淋巴細(xì)胞 CD3 和 CD28 分子表達(dá)的影響 結(jié)果如表3所示，與青齡組比較，老齡組 CD3+CD28+T淋巴細(xì)胞亞群減少， CD3+CD28-T淋巴細(xì)胞亞群增多 （P＜0.01）。 含紅芪和含黃芪的補(bǔ)中益氣湯含藥血清作用于老齡小鼠脾淋巴細(xì)胞后， 與空白血清組比較， 脾淋巴細(xì)胞 CD28 分子的表達(dá)發(fā)生改變， CD3+CD28+T淋巴細(xì)胞亞群增多 （P＜0.05）。

3.4 對(duì)培養(yǎng)上清 IL-2 的影響 結(jié)果如表 4 所示，與青齡組比較， 老齡組體外分泌 IL-2 的水平明顯減少 （P＜0.01）。 含紅芪和含黃芪的補(bǔ)中益氣湯含藥血清分別與老齡小鼠脾淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)后，與空白血清組比較， 培養(yǎng)上清 IL-2 的水平增多 （ P＜0.01）。 含紅芪補(bǔ)中益氣湯優(yōu)于含黃芪補(bǔ)中益氣湯（P＜0.05）。

表 2 含黃芪和含紅芪補(bǔ)中益氣湯含藥血清對(duì) T淋巴細(xì)胞增殖的影響 （ˉ， n=10）Tab.2 Effect of Buzhong Yiqi Decoction containing Astragali Radix and containing Hedysari Radix on proliferative capacity of T lym phocytes（ ˉ， n=10 ）

表 2 含黃芪和含紅芪補(bǔ)中益氣湯含藥血清對(duì) T淋巴細(xì)胞增殖的影響 （ˉ， n=10）Tab.2 Effect of Buzhong Yiqi Decoction containing Astragali Radix and containing Hedysari Radix on proliferative capacity of T lym phocytes（ ˉ， n=10 ）

注：與青齡組比較，**P＜0.01； 與空白血清組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01； 與黃芪補(bǔ)中益氣湯比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

組 別 劑量/（g·kg-1） 自身增殖 ConA誘導(dǎo)增殖 刺激指數(shù)青齡組 —1.180 ±0.177 1.976 ±0.135 1.702 ±0.199老齡組 — 0.669 ±0.114** 0.687 ±0.110** 1.029 ±0.026**空白血清組 4 0.671 ±0.091 0.702 ±0.086 1.049 ±0.067黃芪補(bǔ)中益氣湯 4 0.795 ±0.020△ 1.010 ±0.040△△ 1.270 ±0.036△紅芪補(bǔ)中益氣湯 4 0.902 ±0.008△△▲ 1.245 ±0.070△△▲▲ 1.380 ±0.075△△▲

表 3 含黃芪和含紅芪補(bǔ)中益氣湯含藥血清對(duì) CD3+、 CD28+脾淋巴細(xì)胞亞群的影響 （， n=10）Tab.3 Effect of Buzhong Yiqi Decoction containing Astragali Radix and containing Hedysari Radix on CD3+and CD28+in sp leen T lym phocyte subgroups（， n=10）

表 3 含黃芪和含紅芪補(bǔ)中益氣湯含藥血清對(duì) CD3+、 CD28+脾淋巴細(xì)胞亞群的影響 （， n=10）Tab.3 Effect of Buzhong Yiqi Decoction containing Astragali Radix and containing Hedysari Radix on CD3+and CD28+in sp leen T lym phocyte subgroups（， n=10）

注： 與青齡組比較，**P＜0.01； 與空白血清組比較，△P＜0.05

組 別 劑量/（g·kg-1） CD3+CD28-/% CD3+CD28+/%青齡組 —3.03 ±0.65 35.07 ±3.58老齡組 — 6.23 ±0.80** 26.12 ±2.03**空白血清組 4 5.97 ±1.11 26.33 ±2.17黃芪補(bǔ)中益氣湯 4 5.36 ±0.40 28.83 ±1.56△紅芪補(bǔ)中益氣湯 4 5.42 ±0.60 29.27 ±2.21△

表4 含黃芪和含紅芪補(bǔ)中益氣湯含藥血清對(duì)脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清 IL-2 水平的影響 （， n=10）Tab.4 Effect of Buzhong Yiqi Decoction containing Astragali Radix and containing Hedysari Radix on IL-2 leve1 of sp leen T lym phocytes（， n=10）

表4 含黃芪和含紅芪補(bǔ)中益氣湯含藥血清對(duì)脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清 IL-2 水平的影響 （， n=10）Tab.4 Effect of Buzhong Yiqi Decoction containing Astragali Radix and containing Hedysari Radix on IL-2 leve1 of sp leen T lym phocytes（， n=10）

注：與青齡組比較，**P＜0.01； 與空白血清組比較，△△P＜0.01； 與黃芪補(bǔ)中益氣湯比較，▲P＜0.05

組 別 劑量/（g·kg-1）IL-2/（pg·m L-1）青齡組 —112.64 ±10.02老齡組 — 15.73 ±3.64**空白血清組 4 16.65 ±5.36黃芪補(bǔ)中益氣湯 4 63.78 ±4.66△△紅芪補(bǔ)中益氣湯 4 71.00 ±6.87△△▲

4 結(jié)論

基于目前在免疫調(diào)節(jié)方面，對(duì)紅、黃芪單味藥和在復(fù)方中應(yīng)用的研究以及T淋巴細(xì)胞在抗免疫老化中所起的關(guān)鍵作用，實(shí)驗(yàn)組前期研究表明紅芪替換黃芪應(yīng)用于復(fù)方補(bǔ)中益氣湯在細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)方面具有相似性［14］，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步選擇了以黃芪為君藥的補(bǔ)中益氣湯，用紅芪代替原方中黃芪配伍成含紅芪的補(bǔ)中益氣湯，對(duì)抗免疫老化作用進(jìn)行了體外對(duì)比研究。 實(shí)驗(yàn)選擇中藥血清藥 理學(xué)方 法［23］，用中藥復(fù)方水提物給小鼠灌胃制備含藥血清對(duì)細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)。 通過 MTT法觀察含藥血清作用于老齡鼠脾淋巴細(xì)胞刺激增殖作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明以血清質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 40%的含藥血清培養(yǎng) 48 h 增殖效果最佳，且含紅芪補(bǔ)中益氣湯效果優(yōu)于含黃芪補(bǔ)中益氣湯。

T淋巴細(xì)胞功能變化對(duì)衰老有一定影響，是免疫老化 的突 出 表 現(xiàn)［24-25］。 隨著 年 齡 增長(zhǎng)， 體 外 有絲分裂原刺激后細(xì)胞增殖能力降低［26］， 且 IL-2 的生成減少［27］。 刺激 T淋巴細(xì)胞體外增殖的絲裂原應(yīng)首選 ConA［28］。 本實(shí)驗(yàn)再次用 MTT法觀察含藥血清作用于老齡鼠脾細(xì)胞對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖的反應(yīng)， 結(jié)果表明， 兩方 40%的含藥血清對(duì)老齡小鼠脾細(xì)胞作用48 h， 均能不同程度地提高老齡鼠 T淋巴細(xì)胞自身增殖和 ConA誘導(dǎo)的增殖能力， 刺激指數(shù)也相應(yīng)增加，且紅芪補(bǔ)中益氣湯的作用更好。

伴隨年齡的增長(zhǎng)，T淋巴細(xì)胞功能相關(guān)的許多分子發(fā)生改變， CD28-T細(xì)胞頻率是老年個(gè)體免疫功能不全的關(guān)鍵預(yù) 報(bào)因子［29-30］。 CD28 分子 的減少已作為免疫老化的重要標(biāo)志之一［30］， 在細(xì)胞復(fù)制性衰老的進(jìn)程中起關(guān)鍵作用［31］。 本實(shí)驗(yàn)將含紅芪與含黃芪補(bǔ)中益氣湯含藥血清與老齡小鼠脾淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)后， 發(fā)現(xiàn)加藥老齡鼠脾細(xì)胞 CD3+CD28+T淋巴細(xì)胞數(shù)量較不加藥老齡組增加， CD3+CD28-T淋巴細(xì)胞數(shù)減少， 紅芪補(bǔ)中益氣湯與黃芪補(bǔ)中益氣湯作用相似。

IL-2 主要由活化的 CD4 和 CD8 T細(xì)胞產(chǎn)生，是參與免疫應(yīng)答的重要細(xì)胞因子［32］。 隨著年齡的增長(zhǎng)， 機(jī)體 T淋巴 細(xì) 胞 分泌 IL-2 的 能 力明 顯 減弱［33］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)老齡組脾淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)上清中 IL-2 的水平減少， 分別與紅芪和黃芪補(bǔ)中益氣湯含藥血清作用后，老齡小鼠T淋巴細(xì)胞分泌的 IL-2 的能力增強(qiáng)， 且紅芪補(bǔ)中益氣湯作用效果優(yōu)于黃芪補(bǔ)中益氣湯。

綜上所述，紅芪補(bǔ)中益氣湯與黃芪補(bǔ)中益氣湯均可通過調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞在抗免疫老化方面起到一定作用，二者作用相似，且紅芪補(bǔ)中益氣湯在促進(jìn)脾細(xì)胞增殖和分泌 IL-2 方面優(yōu)于黃芪補(bǔ)中益氣湯，因此紅芪代替補(bǔ)中益氣湯中黃芪在抗免疫老化方面具有可行性。本研究為開發(fā)甘肅道地藥材紅芪的藥用價(jià)值及深入研究紅芪與黃芪在復(fù)方中的抗免疫老化機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Substitution of Hedyseri Radix for Astragali Radix in Buzhong Yiqi Decoction results in change of sp leen T lym phocytes of aging m ice

XINGWen-ting1， ZHANG Li-feng2， WEIDong-feng3， CHENGWei-dong1，4*， DU Juan5
（1.Instituteof Integrated Chineseand Western Medicine， Lanzhou University， Lanzhou 730000， China； 2.Immunologic Institute， Schoolof Basic Medical Science， Lanzhou University， Lanzhou 730000， China； 3.Institute of Basic Research in Clinical Medicine， China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700， China； 4.Institute of Traditional Chinese Medicine， Southern Medical University， Guangzhou 510515， China； 5.College of Nursing，Gansu College of Traditional Chinese Medicine， Lanzhou 730000， China）

AIM To study the effect of the substitution of Hedysari Radix for Astragali Radix in Buzhong Yiqi Decoction on spleen T lymphocytes of agingmice.M ETHODS MTTmethod was used to detect the proliferation of the serum from both Hedyseri Radix and AstragaliRadix of Buzhong YiqiDecoction acting on spleen lymphocyte in aged mice， and to determine the optimum incubation time and serum concentrations.The comparison wasmade with the proliferative capacity of T lymphocytes， the percentage of T-lymphocyte subsets and the level of IL-2 in the culture supernatant.RESULTS MTT results showed that 40%of drug concentration with serum training 48 h stimulated proliferation bestby acting on spleen lymphocyte in agedmice.While both could significantly increased T lymphocyte proliferation， the T lymphocyte count of CD28+in T lymphocyte subgroup， and the level of IL-2. Hedysari Radix was superior to Astragali Radix in Buzhong Yiqi Decoction in raising T lymphocyte proliferation and IL-2 leve1.CONCLUSION Buzhong Yiqi Decoction containing Hedysari Radix has a similar role in anti-immunosenescence as Astragali Radix， and Hedysari Radix is statistically better in terms of T cell proliferation and IL-2 leve1.

Hedyseri Radix； Astragali Radix； Buzhong Yiqi Decoction； spleen T lymphocytes of aging mice；anti-immunosenescence

R285.5

： A

： 1001-1528（2014）03-0450-07

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.03.003

2013-06-17

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目 （81373806） ； 2012 年省衛(wèi)生廳中醫(yī)藥科研立項(xiàng)課題 （ GZK-2012-43） ； 蘭州大學(xué)中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助 （ lzujbky-2013-172）

邢文婷 （1988—） ， 女， 碩士生， 從事中西醫(yī)結(jié)合臨床研究。 TeL： 18298331246， E-mail： xingwentinghaha@126.com

*通信作者： 程 衛(wèi)東 （ 1963—） ， 男， 教 授， 博 士， 博士 生 導(dǎo) 師， 從事中 西 醫(yī) 結(jié)合治 療 常 見 病 研 究。 Tel： （ 0931 ） 8915184， E-mail：chengweidong888@sina.com