李向陽， 屠萬倩

（1.河南省食品藥品檢驗所， 河南 鄭州 450003； 2.河南省中醫(yī)藥研究院， 河南 鄭州 450004）

RP-HPLC法同時測定不同產(chǎn)地金銀花中木犀草苷和 6 種有機酸

李向陽1， 屠萬倩2*

（1.河南省食品藥品檢驗所， 河南 鄭州 450003； 2.河南省中醫(yī)藥研究院， 河南 鄭州 450004）

目的 建立反相高效液相色譜法測定不同產(chǎn)地金銀花中木犀草苷、綠原酸、隱綠原酸、新綠原酸和異綠原酸A、 B、 C的方法。 方法 Phenomenex ODSC18色譜柱 (4.6 mm×250 mm， 5 μm)， 以乙腈 (A)-0.4%磷酸 (B) 為流動相， 梯度洗脫 (0 ～10 m in， 5%→9%A； 10 ～30 min， 9%A； 30 ～60 min， 9% →30%A； 60 ～80 min， 30%A) ，體積流量 1.0 mL/min， 最大吸收波長下檢測 (木犀草苷在 350 nm， 隱綠原酸、 綠原酸和新綠原酸在 327 nm， 異綠原酸 A、 B、 C在 330 nm)。 結(jié)果 7 種待測成分分離度良好； 各成分質(zhì)量濃度與峰面積在測定范圍內(nèi)均呈良好線性關(guān)系(r≥0.999 0)， 木犀草苷、 綠原酸、 隱綠原酸、 新綠原酸和異綠原酸 A、 B、 C的平均回收率 (RSD) 分別為 99.52% (2.56%)、 97.93%(2.19%)、 96.12%(1.19%)、 102.50%(1.63%)、 97.57%(1.60%)、 97.12%(2.64%)、100.32%(2.89%)。 結(jié)論 該方法簡便、 準(zhǔn)確、 重復(fù)性好， 可用于金銀花的質(zhì)量控制。

金銀花； 木犀草苷； 有機酸； RP-HPLC

金銀 花 為 忍 冬 科 植 物 忍 冬 Lonicera japonica 的花蕾， 具有清熱解毒、 疏散風(fēng)熱的功效［1］。 金銀花在我國河南、河北、山東等多地分布廣泛，其中河南金銀花種植歷史悠久、產(chǎn)量較大，是金銀花的道地產(chǎn)地和主產(chǎn)區(qū)，河南密縣主產(chǎn)的金銀花被習(xí)稱為密銀花或南 銀花［2-3］。 近年來， 隨金銀花 的市場需求量增大，新產(chǎn)區(qū)不斷發(fā)展，山東沂蒙山區(qū)(包括平邑、費縣等地) 已成為除河南封丘、 新密等傳統(tǒng)產(chǎn)區(qū)外新興的金銀花的重點生產(chǎn)基地，河南、山東兩省主產(chǎn)的金銀花產(chǎn)銷量可達全國的近70%，成為國內(nèi)金銀花的主要來源［4］。

金銀花中主要含有黃酮及苷類、環(huán)烯醚萜苷類和有機酸類成分［5］。 金銀花中的黃酮類成分主要有木犀草素、 木犀草苷 (木犀草素-7-O-葡萄糖苷)等， 有機酸類成分主要除綠原酸 (5-O-咖啡?；鼘幩? 外， 還含有 4，5-O-二咖啡酰基奎寧酸 (異綠原酸 C)、 3，4-O-二咖啡?；鼘幩?( 異綠原酸B)、 3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸 (異綠原酸 A)、 1，3-O-二咖啡酰基奎寧酸 (洋薊素)、 4-咖啡?；鼘幩?(隱綠原酸)、5-咖啡?；鼘幩?( 新綠原酸) 等咖啡酰基奎寧酸［6-7］。 根據(jù)其化學(xué)結(jié) 構(gòu)， 綠原酸與隱綠原酸、新綠原酸結(jié)構(gòu)較為相似，異綠原酸 A、B、 C為同分異構(gòu)化合物。 據(jù)報道，從金銀花中提取檢測的綠原酸、木犀草苷、異綠原酸A、B、C等多種成分具有清除自由基、 抗氧化作用［8］。

在現(xiàn)行 2010 年 版 《 中 國 藥典》中， 采 用HPLC法分別測定金銀花中綠原酸和木犀草苷的量， 除利用先進的儀器分析技術(shù) (如 HPLC-DAD/ ESI-MS 聯(lián)用測定金銀花中 24 種黃酮、 環(huán)烯醚萜苷類和皂苷類成分) 的研究報道［9］外， 目前國內(nèi)金銀花的質(zhì)量研究文獻報道多集中在綠原酸和木犀草苷的定量 測 定 及 指 紋 圖 譜 上［10-13］。 考 慮 到有 機 酸為金銀花中的重要活性成分，且組成較復(fù)雜，采用較常見的反相高效液相色譜-二極管陣列檢測器(HPLC-DAD)， 本實驗同時測定河南和山東主產(chǎn)的金銀花藥材中木犀草苷、綠原酸、隱綠原酸、新綠原酸和異綠原酸 A、 B、 C， 有助于全面評價金銀花藥材質(zhì)量。

1 儀器試劑與藥品

1.1 儀器 美國 Waters高效液相色譜儀 (2695 溶劑管理系統(tǒng)， 2996 二極管陣列檢測器， 美國 Waters柱溫箱， Empower2 工作站)； ASS150 超聲波提取器 (濟寧科特超聲電子有限責(zé)任公司 GT-350W)； LIBROR-160DPT萬 分之一分析天平 ( 日本島津)； AE240 十萬分之一分析天平 (瑞士 METTLER公司)。

1.2 試劑與藥品 金銀花樣品分別購自河南封丘、河南新密、河南鄭州、山東平邑、山東臨沂等金銀花主產(chǎn)區(qū)，經(jīng)河南省食品藥品檢驗所雷留成副主任藥師鑒定， 均 為 忍 冬科 植 物 忍冬 L.japonica 的 花蕾。綠原酸對照品 (中國藥品生物制品檢定所，含量測定用， 批號 110753-200413)， 木犀草苷對照品 (中國藥品生物制品檢定所， 含量測定用，批號 111720-200604)， 隱綠原酸、 新綠原酸、異綠原酸A、 異綠原酸 B和異綠原酸 C對照品 (購自天津馬克生物技術(shù)有限公司)，甲醇、乙腈為色譜純 (德國 Merck 公司)， 水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色 譜 條 件 Phenomenex ODS C18色 譜 柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)； 柱溫 40 ℃； 流動相為乙腈-0.4%磷酸水溶液系統(tǒng)， 梯度洗脫 (0 ～10 min， 5% → 9%A； 10 ～30 min， 9%A； 30 ～60 min， 9%→30%A； 60 ～80 min， 30%A)； 體積流量 1.0mL/min；進樣量 10 μL； 綠原酸、隱綠原酸和新綠原酸檢測波長 327 nm，木犀草苷 350 nm，異綠原酸 A、 異綠原酸 B和異綠原酸 C 330 nm。在此條件下，色譜圖見圖1。

圖1 對照品 （A） 與金銀花樣品 （B）HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram s of reference substances （ A） and sam p le of Lonicerae japonicae Flos（ B）

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取木犀草苷、 隱綠原酸、綠原酸、新綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸 A和異綠原酸 C對照品， 加 70%乙醇制成每 1 mL分別含木犀草苷 37.0 μg、隱綠原酸 48.0 μg、綠原酸 0.836 mg、 新綠原酸 48.8 μg、 異綠原酸 B 19.5 μg、 異綠原酸 A 0.254 mg和異綠原酸 C 55.6 μg的混合溶液， 作為對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取本品 2.0 g， 精密稱定， 置具塞三角瓶中， 精密加入 70%乙醇 25 mL，稱定質(zhì)量， 超聲處理1 h， 取出， 放冷， 再稱定質(zhì)量， 用 70%乙醇補足損失的質(zhì)量， 搖勻， 濾過，續(xù)濾液用 0.45 μm微孔濾膜濾過， 即得。

2.4 供試品溶液的制備方法研究

2.4.1 提取溶劑的選擇 取金銀花樣品 3 份， 各2.0 g， 精密稱定， 分別精密加入甲醇、 70%乙醇和 50%乙醇 25 m L， 稱定質(zhì)量， 超聲處理 1 h， 制成供試品溶液，測定供試品中木犀草苷、隱綠原酸、綠原酸、新綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A和異綠原酸C的量， 結(jié)果見表1。

表 1 提取溶劑的選擇 （mg·g-1）Tab.1 Selection of extraction solvents（ mg·g-1）

2.4.2 提取方式的比較 取金銀花樣品 6 份，各2.0 g， 精密稱定， 精密加入 70%乙醇 25 mL， 稱定質(zhì)量， 分別加熱回流 30 min、 1 h、 2 h、 超聲處理 30 min、 1 h、 2 h， 制成供試品溶液， 測定供試品中木犀草苷、隱綠原酸、綠原酸、新綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸 A和異綠原酸 C的量， 結(jié)果見表2。

表 2 提取方式的比較 （mg·g-1）Tab.2 Com parison of extraction methods（ mg·g-1）

2.5 線性關(guān)系考察 精密吸取 “2.2” 項下的對照品溶液 2、 5、 10、 15、20、 25 μL，分別注入液相色譜儀，測定。以峰面積對質(zhì)量濃度進行線性回歸， 回歸方程線性范圍及相關(guān)系數(shù)， 見表3。

表3 回歸方程、線性關(guān)系及相關(guān)系數(shù)Tab.3 Regression equations， linear ranges and correlation coefficients

2.6 檢測限和定量限的測定 取混合對照品溶液，按濃度稀釋法進樣分析 (分別按 10、 100、 1000、10 000 倍稀釋)， 測定色譜系統(tǒng)基線噪音。 以信噪比 3 ∶1 為檢測限， 信噪比 10 ∶l為定量限。 經(jīng)檢測， 木犀草苷檢測限為 0.9 ng， 定量限為 3.7 ng；隱綠原酸檢測限為 1.2 ng， 定量限為 4.8 ng； 綠原酸檢測限為 0.2 ng， 定量限為 0.8 ng； 新綠原酸檢測限為 0.1 ng， 定量限為0.5 ng； 異綠原酸 B檢測限為0.1 ng， 定量限為 0.2 ng； 異綠原酸 A檢測限為 1.3 ng， 定量限為 5.1 ng； 異綠原酸 C檢測限為0.7 ng，定量限為 2.8 ng。

2.7 精密度試驗 吸取同一供試品溶液 10 μL，注入高效液相色譜儀，連續(xù)重復(fù)進樣6次，測定各待測成分的峰面積并計算 RSD， 結(jié)果木犀草苷、隱綠原酸、綠原酸、新綠原酸、異綠原酸 B、 異綠原酸 A和異綠原酸 C的 RSD分別為 1.38%、2.62%、 1.07%、 2.42%、 2.57%、 1.28% 和1.85%。 結(jié)果表明， 本方法精密度較好。

2.8 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液， 分別于 0、2、 4、6、 8、 10 h 注入液相色譜儀， 測定各待測成分的峰面積并計算 RSD值， 結(jié)果木犀草苷、 隱綠原酸、綠原酸、新綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A和異綠原酸 C的 RSD分別為 2.05%、 2.86%、1.74%、 2.33%、 2.06%、1.71% 和 2.00%。 表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.9 重復(fù)性試驗 取同一批金銀花藥材， 平行制備 6 份供試品溶液， 按 “2.3”項下方法制備成供試品溶液，按上述色譜條件進行 HPLC分析。 根據(jù)所得待測成分的峰面積計算其在樣品中的含有量。結(jié)果顯示:木犀草苷、隱綠原酸、綠原酸、新綠原酸、異綠原酸 B、 異綠原酸 A和異綠原酸 C的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.523、 0.434、 19.610、 0.366、0.161、 7.305 和 0.966 mg/g， RSD 值 分 別 為1.48%、 2.97%、 1.64%、 1.98%、 2.69%、2.52%和 2.83%， 表明該方法重復(fù)性較好。

2.10 加樣回收率試驗 取已測定的金銀花藥材(木犀草苷、隱綠原酸、 綠原酸、新綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸 A和異綠原酸 C的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為 0.523、0.434、 19.610、0.366、 0.161、7.305 和 0.966 mg/g)， 取約 1g，精密稱定， 置具塞三角瓶中，分別精密加入木犀草苷、隱綠原酸、綠原酸、新綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A和異綠原酸 C對照品的混合 70%乙醇溶液 (質(zhì)量濃度分別為 0.019 6 mg/mL、 0.019 0 mg/mL、 0.748 mg/mL、 0.016 8 mg/m L、 0.278 mg/mL、 0.045 mg/mL)25 mL， 以下按 “2.3” 項下操作， 平行操作，制得6份加樣供試品溶液。吸取加樣供試品溶液10μL， 注入液相色譜儀，測定木犀草苷、 隱綠原酸、綠原酸、新綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A和異綠原酸C的量。根據(jù)測得量和加入量，計算各待測成分的加樣回收率， 結(jié)果見表4。

表4 加樣回收率試驗結(jié)果Tab.4 Results of recovery tests

2.11 樣品測定 取不同產(chǎn)地的金 銀 花， 按“2.3”項方法制備供試品溶液，測定樣品中木犀草苷、隱綠原酸、綠原酸、新綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸 A和異綠原酸 C的量， 平行測定 3次， 并計算，結(jié)果見表5。

表 5 不同產(chǎn)地金銀花樣品的測定結(jié)果 （mg·g-1， n=3）Tab.5 Con tent determ ination of sam p les from differen t habitats（m g·g-1， n=3）

3 討論

3.1 供試品溶液的制備 在實驗中， 根據(jù)待測成分的理化性質(zhì)，對供試品的提取溶劑 (甲醇、70%乙醇和50%乙醇)、 提取方式 (超聲處理和加熱回流)及提取時間等進行了考察和比較，確定了定量測定的供試品溶液的制備方法為取金銀花2.0 g， 加 25 mL70%乙醇， 超聲提取 1 h。

3.2 流動相的選擇 金銀花中木犀草苷、 綠原酸與異綠原酸類化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)和極性差異較大，難以采用固定的流動相同時測定，多用梯度洗脫方法實現(xiàn)待 測 成 分 的 分 離 和 檢 測［14-15］， 本 實 驗 參 照《中國藥典》 2010 年版一部金銀花藥材項下方法反復(fù)試驗，確定了梯度洗脫程序，使待測成分峰形基本對稱，與相鄰峰可達較好的分離度，不同產(chǎn)地的藥材樣品均能準(zhǔn)確測定。

3.3 測定波長的確定 在實驗中，分別對木犀草苷、隱綠原酸、綠原酸、新綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A和異綠原酸C色譜峰進行吸收光譜掃描， 結(jié)果木犀草苷在 348 nm、 隱綠原酸、綠原酸和新綠原酸等咖啡?；鼘幩犷惓煞稚V峰在 327 nm處、 異綠原酸 B、 異綠原酸 A和異綠原酸 C等二咖啡?；鼘幩嵘V峰在329 nm處有最大吸收，參照 《中國藥典》 2010 年版一部中木犀草苷的測定波長為 350 nm、 綠原酸的測定波長為 327 nm的有關(guān)規(guī)定， 選擇 327 nm作為隱綠原酸、 綠原酸和新綠原酸的測定波長， 350 nm作為木犀草苷的測定波長， 330 nm作為異綠原酸 B、 異綠原酸 A和異綠原酸 C的檢測波長。采用 Waters Empower II色譜工作站的定時波長功能， 分別以 45 min 和 51 min 為檢測波長轉(zhuǎn)換點， 檢測波長依次由 327 nm變?yōu)?50 nm及330 nm， 在同一色譜中同時檢測金銀花中的木犀草苷、隱綠原酸、綠原酸、新綠原酸、 異綠原酸 B、 異綠原酸 A和異綠原酸 C， 提高檢測的靈敏度和準(zhǔn)確性。此法不僅可以用于二極管陣列檢測器，也可用于普通的多波長紫外檢測器，具有普遍適用性，方便快速。

4 小結(jié)

在 《中國藥典》 2010 年版一部金銀花項下， 采用 HPLC法分別測定了綠原酸和木犀草苷的量，并規(guī)定金銀花中綠原酸的量不得低于規(guī)定 1.5%(15 mg/g)， 木犀草苷不得低于 0.05%(0.5 mg/g)［1］。在研究過程中，收集了河南和山東等金銀花主產(chǎn)區(qū)的12 份樣品， 實驗結(jié)果表明， 12 份金銀花樣品中綠原酸和木犀草苷的量均符合藥典規(guī)定。

同時，從收集到的樣品測定結(jié)果來看，來自主產(chǎn)地的12份金銀花樣本中木犀草苷、綠原酸和 6種有機酸總量均無顯著性的差異 (RSD值分別為5.89%、 6.46%和 5.40%)，只是在各成分含有量構(gòu)成上有所不同。排除隱綠原酸、新綠原酸和異綠原酸B等含有量較低、測定結(jié)果波動范圍較大的成分，根據(jù)實驗結(jié)果，觀察產(chǎn)地對藥材中化學(xué)成分的影響，結(jié)果提示產(chǎn)自山東的金銀花樣品中總有機酸、 綠原酸和木犀草苷的平均含有量 (28.446、20.219 和 0.567 mg/g) 略高于產(chǎn)自河南的樣品(27.619、18.854 和 0.518 mg/g)，而異綠原酸 A和異綠原酸 C的量則產(chǎn)自河南的樣品 (7.022、8.95 mg/g) 略高于產(chǎn)自山東的樣品 (6.557、 8.35 mg/g)。 有關(guān)金銀花中化學(xué)成分的含有量差異與不同產(chǎn)區(qū)是否存在相關(guān)性，有待今后收集更多樣品進行實驗和比較。

考慮到金銀花中含有多種異綠原酸成分，且異綠原酸A、異綠原酸C等成分在藥材中含有量并不低，僅以綠原酸的量作為質(zhì)控指標(biāo)顯然不夠科學(xué)，建議進行多指標(biāo)成分的定量測定來控制金銀花及其制劑的內(nèi)在質(zhì)量。

［ 1 ］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:2010 年版一部［S］.北京: 中國醫(yī)藥科技出版社， 2010:205-206.

［2］ 周鳳琴，李 佳，冉 蓉，等.我國金銀花主產(chǎn)區(qū)種質(zhì)資源調(diào)查［J］.現(xiàn)代中藥研究與實踐， 2010， 24(3):21-25.

［ 3 ］ 楊俊杰， 李 娟.河南金銀花產(chǎn)地生產(chǎn)狀況調(diào)查［J］.時珍國醫(yī)國藥， 2011， 22(4):974-975.

［4］ 周鳳琴，張永清，張 芳，等.山東金銀花種質(zhì)資源的調(diào)查研究［J］.山東中醫(yī)雜志， 2006， 25(4):268-271.

［ 5 ］ 何 晶.金銀花的化學(xué)成分及藥理作用［J］.天津藥學(xué)，2007， 19(5):66-68.

［6］ 劉 雄，高建德.金銀花質(zhì)量控制、化學(xué)成分及藥理學(xué)研究進展［J］.甘肅中醫(yī)學(xué)院學(xué)報， 2006， 23(4):46-49.

［ 7 ］ 賀 偉.金銀花的化學(xué)成分及藥理作用研究［J］.中國醫(yī)藥導(dǎo)報， 2007， 4(24):8-9.

［ 8 ］ Tang Dan， LiHuiun， Chen Jun， etal.Rapid and simplemethod for screening of natural antioxidants from Chinese herb Flos Lonicerae Japonicae by DPPH-HPLC-DAD-TOF/MS［ J］ .J Sep Sci， 2008， 31(20):3519-3526.

［ 9 ］ Chen Jun， Song Yue， Li Ping.Capillary high-performance liquid chromatography withmass spectrometry for simultaneous determination ofmajor flavonoids， iridoid glucosides and saponins in Flos Lonicerae［ J］ .J Chromatogr A， 2007， 1157(1/2): 217-226.

［10］ 李紅霞， 王雪芹， 李振國， 等.不同產(chǎn)地金銀花與山銀花主要成分的含量比較［J］.中國藥房， 2011， 22(31): 2935-2937.

［11］ 周鳳琴， 冉 蓉， 李 佳， 等.山東 10 個不同種質(zhì)金銀花中綠原酸含量及其品質(zhì)評價［J］.山東中醫(yī)雜志， 2007， 26 (7):478-480.

［12］ 馮文宇， 田 吉， 何 兵.濟銀花與川銀花綠原酸含量及提取率實驗研究［J］.中藥材， 2006， 29(1):30-31.

［13］ 容 蓉， 閆 斌， 呂青濤， 等.不同產(chǎn)地金銀花藥材的HPCE指紋圖譜分析［J］.化學(xué)分析計量， 2006， 15(6): 66-68.

［14］ 張 璐， 曾文雪.HPLC-ELSD同時測定山金銀花中綠原酸、 木犀草苷和川續(xù)斷皂苷乙的含量［J］.江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報， 2011， 23(4):40-42.

［15］ 王榮梅， 徐麗華， 林永強.法同時測定銀黃含片中 6 個咖啡?？鼘幩犷惓煞值暮浚?J］.藥物分析雜志， 2012， 32 (1):57-60.

Sim ultaneous determ ination of galuteolin， and six organic acids in Lonicerae Japonicae Flos from different habitats by RP-HPLC

LIXiang-yang1， TUWan-qian2*

(1.Henan Provincial Instituteof Food and Drug Control， Zhengzhou450003， China； 2.Henan Provincial Academy of Traditional ChineseMedicine， Zhengzhou 450004， China)

AIM To establish a RP-HPLC method for simultaneously determining the levels of galuteolin，chlorogenic acid，cryptochlorogenic acid， neochlorogenic acid， isochlorogenic acid A， B， and C in Lonicerae Japonicae Flos from different habitats.M ETHODS A Phenomenex ODSC18column(4.6 mm×250 mm， 5 μm) was used with the mobile phase consisting of acetonitrile(A)-0.4%phosphoric acid(B)in gradient elution mode(0-10 min， 5%A→9%A； 10-30 min，9%A；30-60 min， 9%A→30%A； 60-80 min， 30%A) ，at the flow rate of 1.0 mL/min.The UV detection wavelength was setat themaximum absorption wavelength， 350 nm for galuteolin， 327 nm for chlorogenic acid， cryptochlorogenic acid and neochlorogenic acid， 330 nm for isochlorogenic acid A， B， and C.RESULTS Excellent chromatographic separation was achieved with good linearity (r≥0.999 0)within the studied concerntration ranges.The average recovery rates(RSD)of galuteolin， chlorogenic acid， cryptochlorogenic acid，neochlorogenic acid， isochlorogenic acid A， B， and C were 99.52% (2.56%)， 97.93%(2.19%)， 96.12%(1.19%)， 102.50%(1.63%)， 97.57%(1.60%)， 97.12% (2.64%)， 100.32%(2.89%)， respectively.CONCLUSION Themethod is simple， accurate and reproducible.It can be used for the quality control of Lonicerae Japonicae Flos.

Lonicerae Japonicae Flos； galuteolin； organic acid； RP-HPLC

R284.1

:A

:1001-1528(2014)02-0353-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.02.030

2013-04-07

河南省重點科技攻關(guān)計劃資助項目 (112102310023)

李向陽 (1968—) ， 男， 副 主 任 藥 師， 從 事 中 藥 質(zhì) 量 控 制 研 究 與 藥 品 檢 驗 工 作。 Tel:(0371)63388283， Email:lixia632 @126.com

*通信作者: 屠萬倩 (1970—)， 女， 副研究員， 研究方向: 中藥分析。 Tel:(0371)66331718