雷秀清 李力 黃建忠

（福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 工業(yè)微生物教育部工程研究中心 福建省現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)工程研究中心，福州 350108）

微生物能夠產(chǎn)生多種具有生物活性的天然次級(jí)代謝產(chǎn)物，已發(fā)現(xiàn)的大部分的活性天然次級(jí)代謝產(chǎn)物來(lái)自放線菌。放線菌次級(jí)代謝產(chǎn)物從結(jié)構(gòu)上分為：β-內(nèi)酰胺類、多肽類、糖肽類、核苷類及聚酮類化合物等［1-5］，這些物質(zhì)具有抗細(xì)菌、抗真菌、抗腫瘤、殺蟲(chóng)、免疫抑制劑和免疫激活劑等的功效，被廣泛地應(yīng)用于醫(yī)藥業(yè)、農(nóng)業(yè)、獸業(yè)、食品工業(yè)等領(lǐng)域［6］。其中，研究較多的是聚酮類化合物，主要包括大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類和多烯類等［7，8］。聚酮類化合物是聚酮合成酶（Polyketide synthase，PKS）催化形成的，其合成途徑與脂肪酸長(zhǎng)鏈的合成相類似，催化合成聚酮相應(yīng)化合物主體骨架結(jié)構(gòu)的酶為聚酮合成酶［9］。根據(jù)聚酮合成酶的結(jié)構(gòu)和作用模式的不同分為3 類：Ⅰ型 PKS，Ⅱ型 PKS 和Ⅲ型 PKS。Ⅰ型 PKS 又可分為模塊式和迭代式，模塊式即每個(gè)模塊的蛋白有不同的結(jié)構(gòu)域，且結(jié)構(gòu)域的激活位點(diǎn)只使用一次，主要參與細(xì)菌聚酮的合成，而迭代式即一個(gè)蛋白一個(gè)結(jié)構(gòu)域，且這個(gè)結(jié)構(gòu)域可以被重復(fù)使用，主要在真菌中［10］；Ⅱ型 PKS 是具有不同催化功能的酶復(fù)合體，重復(fù)催化多次反應(yīng)來(lái)合成聚酮化合物，這類聚酮合酶主要在細(xì)菌類中［11］；Ⅲ型 PKS與前兩者不同的是不依賴ACP 直接利用酮基合成酶（ketosynthase，KS）催化泛酰輔酶A 之間的縮合，重復(fù)利用KS 催化合成一系列結(jié)構(gòu)復(fù)雜的聚酮類化合物，主要在真菌中［12］。

伴隨著多耐藥性、強(qiáng)耐藥性病原菌的不斷出現(xiàn)，從自然界中分離到的菌株活性產(chǎn)物產(chǎn)量不高，不足以滿足實(shí)際需求。如何尋找新藥以及提高微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)量成為首要任務(wù)。傳統(tǒng)的“誘變-篩選”到更具目的性方向性的基因技術(shù)，第二代和第三代DNA 測(cè)序技術(shù)帶來(lái)的技術(shù)革新，成為解決上述問(wèn)題的重要手段。已發(fā)表的菌株基因組序列分析結(jié)果顯示，基因組中存在大量沉默或者隱性的次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成基因簇，即這些基因簇在試驗(yàn)條件下未得到表達(dá)或者表達(dá)量低［13，14］。通過(guò)基因技術(shù)改造菌株使低產(chǎn)菌株變高產(chǎn)，以及激活沉默的生物合成基因簇，為尋找新藥和提高次級(jí)代謝產(chǎn)物提供相應(yīng)技術(shù)的參考。

本文結(jié)合目前提高次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的方法、新抗生素的研究成果，尤其是聚酮化合物方面的研究，主要在調(diào)節(jié)基因及基因簇的表達(dá)、核糖體相關(guān)蛋白基因的突變和異源表達(dá)等3 個(gè)方面進(jìn)行概述。

1 調(diào)節(jié)基因及基因簇的表達(dá)

在自然界中，一株放線菌往往產(chǎn)生多種抗生素，有的產(chǎn)物還存在多條分支代謝途徑，調(diào)節(jié)子存在多級(jí)層調(diào)控，多種代謝產(chǎn)物共同競(jìng)爭(zhēng)同一種前體［15］。放線菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成基因簇成簇串聯(lián)在一起，且絕大多數(shù)的基因簇轉(zhuǎn)錄水平受各種調(diào)節(jié)因子的控制，途徑特異性調(diào)節(jié)子的調(diào)節(jié)最為直接［16］。通過(guò)調(diào)控途徑特異性正調(diào)節(jié)子的過(guò)表達(dá)，負(fù)調(diào)節(jié)子的敲除，基因簇加倍表達(dá)提高次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)量［10］。

1.1 過(guò)表達(dá)正調(diào)節(jié)子

納他霉素也叫匹馬霉素（Pimaricin），是由Streptomyces natalensis 合成的26 元環(huán)多烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，能抑制酵母和霉菌的生長(zhǎng)，廣泛應(yīng)用于食品業(yè)的防腐防霉，延長(zhǎng)貨架期限［5］。Antón 等［17，18］發(fā)現(xiàn)合成Pimaricin 的基因簇中有兩個(gè)正調(diào)節(jié)子PimR 和PimM；Jang 等［19］構(gòu)建pimM 和pimR 過(guò)表達(dá)突變株，發(fā)酵結(jié)果顯示，pimM 過(guò)表達(dá)的突變株在液體培養(yǎng)基中Pimaricin 產(chǎn)量為200 mg/L，野生型和pimR 過(guò)表達(dá)的突變株產(chǎn)量均為80 mg/L，說(shuō)明pimM比pimR 對(duì)納他霉素的產(chǎn)量影響大。這可能是兩個(gè)調(diào)節(jié)子的調(diào)控級(jí)層的不同，pimR 調(diào)控pimM 的表達(dá)，而pimM 調(diào)控整個(gè)pimaricin 基因簇基因的表達(dá)［20］。Streptomyces ambofaciens 產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物已知的有兩種：螺旋霉素（Spiramycin）［21］和紡錘菌素（Congocidine）［22］，利用生物信息學(xué)分析其染色體組結(jié)果發(fā)現(xiàn)，S. ambofaciens 染色體上存在許多隱性的可能合成次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成基因簇，其中有個(gè)大型的Ⅰ型PKS 基因簇推測(cè)可能編碼一個(gè)目前最大的聚酮化合物［14］。Lusia 等［14］對(duì)該基因簇進(jìn)行克隆并進(jìn)行RT-PCR 分析，結(jié)果顯示該基因簇未得到轉(zhuǎn)錄表達(dá)。為激活該基因簇表達(dá)，過(guò)表達(dá)該基因簇內(nèi)一個(gè)可能是轉(zhuǎn)錄激活子的調(diào)節(jié)基因sanmR0484，該基因編碼的蛋白與LAL（ Large ATP binding of the LuxR）家族相似。結(jié)果在發(fā)酵液中檢測(cè)到一類51 元環(huán)的糖基化大環(huán)內(nèi)酯stambomycins A-D，生物活性測(cè)定顯示新的化合物Stambomycins 抗革蘭氏陽(yáng)性菌不抗真菌及革蘭氏陰性菌，比較特別的是還具有抗人體腫瘤細(xì)胞繁殖的生物活性。

1.2 敲除負(fù)調(diào)節(jié)因子

基因敲除對(duì)合成次級(jí)代謝產(chǎn)物起到抑制作用的調(diào)節(jié)子，可以提高生物合成基因簇的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)水平，最終目的產(chǎn)物產(chǎn)量得到提高。Streptomyces platensis MA7327 產(chǎn)平板霉素（Platensimycin）［23］和平板素（Platencin）［24］，兩抗生素產(chǎn)量都很低產(chǎn)量只有1-3 mg/L。平板霉素和平板素是可抑制細(xì)菌脂肪酸形成的一類新光譜抑菌抗生素，包括抑制耐甲氧西林金色葡萄球菌等革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌［23］。在合成平板霉素和平板素的基因簇中發(fā)現(xiàn)ptmR1 基因編碼GntR 家族類似的轉(zhuǎn)錄抑制子，基因敲除ptmR1基因，產(chǎn)生的突變株S. platensis SB12001 platencin 產(chǎn)量為255±30 mg/L，突變株S. platensis SB12002 platensimycin 產(chǎn)量為323±29 mg/L。兩突變株產(chǎn)量都顯著提高，比野生型菌株產(chǎn)量高100 倍［25］。

1.3 過(guò)表達(dá)與基因敲除相結(jié)合

力達(dá)霉素C-1027 是Streptomyces globisporus C-1027 產(chǎn)生的一種新型抗腫瘤抗生素，有一個(gè)由聚酮合酶合成的烯二炔結(jié)構(gòu)的九元環(huán)，在醫(yī)學(xué)臨床上C-1027 其抗腫瘤活性比阿霉素高，已進(jìn)入臨床二期試驗(yàn)［26］。C-1027 基因簇中發(fā)現(xiàn)4 個(gè)調(diào)節(jié)子：生物信息學(xué)分析SgcR3 與泰樂(lè)菌素正調(diào)控子TylR 的調(diào)控子類似；SgcR2 屬于AraC/XylS 轉(zhuǎn)錄激活子家族；SgcR1 與StrR 調(diào)節(jié)子類似，StrR 是轉(zhuǎn)錄激活子；SgcR 可能編碼DNA 結(jié)合蛋白，是負(fù)調(diào)節(jié)子。分別過(guò)表達(dá)sgcR3、sgcR2、sgcR1 正調(diào)節(jié)子基因，突變株C-1027 的產(chǎn)量都有顯著提高，野生型C-1027 產(chǎn)量為5.5 mg/L，其中過(guò)表達(dá)sgcR1 基因的突變株C-1027產(chǎn)量最高為19.6±2.2 mg/L［27］?；蚯贸齭gcR 突變株C-1027 產(chǎn)量高達(dá)17.4±1.6 mg/L，在敲除sgcR的突變株的基礎(chǔ)上過(guò)表達(dá)正調(diào)節(jié)因子基因sgcR1，C-1027 的產(chǎn)量進(jìn)一步提高，比野生型高7 倍，達(dá)到37.5±7.7 mg/L［28］。

1.4 加倍基因簇

研究人員［29］在卡那霉素高產(chǎn)菌株的染色體組內(nèi)發(fā)現(xiàn)多拷貝的卡那霉素生物合成基因簇，由此可見(jiàn)加倍次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成基因簇拷貝數(shù)亦可以提高產(chǎn)量。Murakami 等［30］構(gòu)建一個(gè)含有ZouA（編碼TraA 型蛋白，負(fù)責(zé)接合轉(zhuǎn)移），RsA 和RsB（類似于oriT）定點(diǎn)重組系統(tǒng)，能將大片段的基因簇成串的整合到宿主染色體上并表達(dá)。以模式菌株S. coelicolor 的 放 線 紫 紅 素（Actinorhodin，ACT）基因簇ACT 為例用該重組系統(tǒng)增加ACT 拷貝數(shù)，S. coelicolor 突變株基因組分析發(fā)現(xiàn)，基因組中平均整合9 個(gè)拷貝數(shù)的ACT 基因簇，突變株的ACT 的產(chǎn)量為400 mg/L，野生型約為20 mg/L，突變株產(chǎn)量提高20 倍。尼可霉素（Nikkomycins）是核苷類抗生素，具有抗真菌、殺螨蟲(chóng)等生物活性，對(duì)于人類和哺乳動(dòng)物無(wú)毒性，被認(rèn)為是較理想的一種抗生素。Liao等［31］利用Red/ET 整合技術(shù)使nikkomycin 完整基因簇在鏈霉菌Streptomyces ansochromogenes 的染色體組上加倍，發(fā)酵結(jié)果顯示nikkomycin X 和nikkomycin Z的產(chǎn)量都得到不同程度的提高，nikkomycin X 從220 mg/L 提高到880 mg/L，nikkomycin Z 從120 mg/L 提高到210 mg/L。氧四環(huán)素Oxytetracycline 是光譜抗菌抗生素，由Ⅱ型PKS 催化合成，最小PKS 負(fù)責(zé)合成19 碳單位長(zhǎng)鏈。以Streptomyces nimosus M4018和工業(yè)菌株SR16 為例，為提高氧四環(huán)素產(chǎn)量，加倍兩原始菌株染色體上minimal PKS 拷貝數(shù)，突變株MR69 氧四環(huán)素的產(chǎn)量比M4018 增加51.2%，達(dá)369.9 mg/L；突變株SR903 與SR16 相比，氧四環(huán)素產(chǎn)量提高32.9 %，達(dá)到1 309.4 mg/L［32］。

2 核糖體相關(guān)蛋白基因的誘變

核糖體工程是用于發(fā)掘新產(chǎn)物、激活沉默基因簇表達(dá)的手段，即使核糖體相關(guān)蛋白（包括核糖體蛋白S12 或者RNA 聚合酶）發(fā)生基因突變賦予抗性，微生物基因轉(zhuǎn)錄和翻譯表達(dá)水平得到提高的技術(shù)［13，33］。通常突變發(fā)生在rpoB 基因（編碼RNA 聚合酶β 亞基）和rpsL 基因（編碼核糖體蛋白S12）上［33］。

2.1 rpoB基因突變

S. lividans 66 擁有完整的放線紫紅素（ACT）和靈菌紅素（Undecylprodigiosin，RED）基因簇，通常不產(chǎn)放線紫紅素和靈菌紅素。S. lividans 66 用利福平抗生素進(jìn)行誘變，編碼RNA 聚合酶β 亞基的rpoB基因發(fā)生點(diǎn)突變，產(chǎn)生抗利福平的突變株合成ACT和RED［34］。rpoB 基因發(fā)生點(diǎn)突變后，RNA 聚合酶能模仿與ppGpp 結(jié)合的形式，增加與次級(jí)代謝產(chǎn)物啟動(dòng)子區(qū)域親和力，激活次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成［13］。

2.2 rpsL基因突變

新發(fā)現(xiàn)的一株S. lividans TK24 在正常情況下產(chǎn)大量的ACT，經(jīng)基因分析發(fā)現(xiàn)S. lividans TK24 有鏈霉素（Str）抗性基因的突變，突變點(diǎn)發(fā)生在編碼核糖體蛋白S12 的rpsL 基因上（K88E），激活A(yù)CT 的合成［35］。S. coelicolor 的基因rpsL 發(fā)生突變，突變株K88E ACT 的產(chǎn)量增加［35］。在S. coelicolor A3（2）用積累濃度誘變中發(fā)現(xiàn)，突變株核糖體蛋白S12 有新的突變位點(diǎn)，在核糖體蛋白S12 92 位插入一個(gè)甘氨酸殘基，突變株GI92 賦于paromomycin（巴尤霉素）抗性，在三突變株SGR K88E 基礎(chǔ)上引入GI92 突變，顯著的提高了ACT 的產(chǎn)量（K88E OD640/450=0.8，K88E GI92 OD640/450=1.7）［36］。

2.3 累加突變

核糖體蛋白的突變不斷增加，可以提高抗生素產(chǎn)量。S. coelicolor 引入3 個(gè)藥物抗性突變SGR 逐步的提高了ACT 的產(chǎn)量［37］。Wang 等［38］在三突變株SGR 基礎(chǔ)上引入突變，其中發(fā)生7 個(gè)和8 個(gè)突變的突變株C7、C8 分別產(chǎn)ACT 0.51 g/L 和0.55 g/L，與野生型S. coelicolor 1147（ACT 產(chǎn)量5.8 mg/L）相比，產(chǎn)量分別提高88 和95 倍。在GYM33 培養(yǎng)基上培養(yǎng)，C7 和C8 分別產(chǎn)ACT 1.63 g/L 和1.22 g/L，與ACT 產(chǎn)量為9 mg/L 的野生型相比，產(chǎn)量分別提高180 倍和136 倍。

3 異源表達(dá)

隨著基因測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，基因組測(cè)序變得方便快捷。已發(fā)表的鏈霉菌基因組序列分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，每株菌不止產(chǎn)一種次級(jí)代謝產(chǎn)物，除了一些主要的抗生素基因簇有表達(dá)之外，還有許多沉默的基因簇未得到表達(dá)，或者轉(zhuǎn)錄水平低未被檢測(cè)到［33］。由于某些野生型本身性質(zhì)的限制以及復(fù)雜的代謝網(wǎng)絡(luò)，中間產(chǎn)物復(fù)雜不穩(wěn)定或者終產(chǎn)物表達(dá)量低，限制了在體內(nèi)研究抗生素合成途徑［39］。構(gòu)建背景清晰的易操作的異源表達(dá)的宿主，有利于發(fā)掘與研究新抗生素。較為常用并容易進(jìn)行基因操作的異源表達(dá)宿主有S. coelicolor、S. avermitilis、S. lividans 等［39-41］。

3.1 Streptomyces coelicolor

S. coelicolor 產(chǎn)多種抗生素其中4 種：由Type II PKS 合成的ACT，由非核糖體多肽合成酶（NRPS）和PKS 雜合作用合成的RED，由NRPS 合成的鈣依賴抗生素（Calcium-dependent antibiotic，CDA）和Type I PKS 合成的coelimycin（CPK）［42］。Gomez-Escribano 等［43］在Streptomyces coelicolor M145 基 礎(chǔ) 上刪除以上4 個(gè)大的基因簇，并對(duì)核糖體蛋白S12 以及RNA 聚合酶β 亞基進(jìn)行定點(diǎn)突變，構(gòu)建了系列異源表達(dá)宿主。來(lái)自S. venezuelae 的氯霉素（Chloramphenicol）生物合成基因簇和來(lái)自S. ambofaciens ATCC23877 的 紡 錘 菌 素（Congocidine） 生 物 合成基因簇及S. coelicolor M145 自身的放線紫紅素（Actinorhodin）生物合成基因簇分別在S. coelicolor系列改造宿主中表達(dá)。HPLC 檢測(cè)發(fā)酵產(chǎn)物，結(jié)果表明在含有一個(gè)rpoB 突變的S. coelicolor M1154 以及含有rpoB 和rpsL 雙突變的S. coelicolor M1152 宿主中表達(dá)的發(fā)酵產(chǎn)物色譜峰比較單一，背景清晰。還有研究人員［44］將S. coelicolor 的線性染色體的兩個(gè)臂、所有的PKS、NRPS 基因以及900 kb 的亞著絲粒端一起敲除，縮小基因組大小，構(gòu)建一系列突變宿主。ACT 基因簇導(dǎo)入不同突變宿主中表達(dá)，篩選能表達(dá)ACT 且產(chǎn)量有提高的異源表達(dá)宿主突變株。只有幾株突變株能表達(dá)ACT，其中突變株ZM10ACT，ZM11ACT 產(chǎn)量比野生型M145T 高，在OD640下檢測(cè)放線紫紅素產(chǎn)量，M145T ACT 的OD640值為0.07，ZM10ACT ACT 的OD640值 為0.3，ZM11ACT ACT 的OD640值為0.15。

3.2 Streptomyces avermitilis

Streptomyces avermitilis 是可高效表達(dá)阿維菌素的工業(yè)菌株。Komatsu 等［45］為了讓S. avermitilis廣泛應(yīng)用于表達(dá)其他不同結(jié)構(gòu)類型次級(jí)產(chǎn)物基因簇，對(duì)S. avermitilis 基因組進(jìn)行縮小。將超過(guò)1.4 Mb 的內(nèi)源基因通過(guò)同源重組逐步地從S. avermitilis 9.02 Mb 的線性染色體中敲除，產(chǎn)生不同基因缺失突變株。Komatsu 選擇不同結(jié)構(gòu)類型的生物合成基因簇驗(yàn)證S. avermitilis 突變株異源表達(dá)效果。S. avermitilis 野生型基因組中不含有氨基糖苷類抗生素的合成基因簇，Komatsu 等［45］將氨基糖苷類抗生素鏈霉素（Streptomycin）生物合成基因簇與整合質(zhì)粒pKU465cos 連接形成質(zhì)粒pSM1，pSM1 導(dǎo)入S. avermitilis 野生型及缺失最大片段的突變株SUKA4及SUKA5 中表達(dá)，突變株SUKA5（pSM1）的鏈霉素產(chǎn)量為200 μg/mL，比S. avermitilis（pSM1）（<100 μg/mL）及產(chǎn)鏈霉素的野生型S. griseus IFO13350（<50 μg/mL）高。S. avermitilis 基因組中至少有8 個(gè)不同的NRPS 生物合成基因簇，但產(chǎn)物中未檢測(cè)到任何的多肽衍生物。Komatsu 等［45］選擇由S. clavuligerus合成的β 內(nèi)酰胺類抗生素頭霉素（Cephamycin C）的生物合成基因簇在S. avermitilis 突變株中異源表達(dá)驗(yàn)證，S. avermitilis 的突變株可以利用NRPS 合成多肽化合物。結(jié)果接合子SUKA17（pCEF2）在SA 培養(yǎng)基上合成Cephamycin C，但產(chǎn)量比S. clavuligerus低。替換培養(yǎng)基并過(guò)表達(dá)ccaR 基因（負(fù)責(zé)激活Cephamycin C 生物合成基因簇表達(dá)），突變株Cephamycin C 的產(chǎn)量達(dá)130 μg/mL，比野生型S. clavuligerus（50 μg/mL）高。S. avermitilis 能合成工業(yè)水平的聚酮化合物，Komatsu 等［45］選擇S. platensis Mer-11107 合成的大環(huán)內(nèi)酯pladienolide 抗生素基因簇在S. avermitilis 突變株中表達(dá)。結(jié)果突變株SUKA5不表達(dá)pladienolide，過(guò)表達(dá)pladienolide 的轉(zhuǎn)錄激活子pldR 后，突變株合成pladienolide。結(jié)果表明，合成聚酮類化合物有時(shí)還需要結(jié)合調(diào)節(jié)因子的表達(dá)。S. avermitilis 由于缺乏單萜環(huán)化酶且操縱子被IS 插入失活或者刪除，適合表達(dá)外源單萜類基因。Komatsu 等［46］將單萜環(huán)化酶基因與甲基轉(zhuǎn)移酶基因克隆后拼接一起插入到啟動(dòng)子rpsJ（在S. avermitilis中具有強(qiáng)轉(zhuǎn)錄活性的啟動(dòng)子）下游，通過(guò)接合轉(zhuǎn)移到突變株SUKA16 中表達(dá)，突變株合成三倍萜2-methylisoborneol（2-MIB，2-甲基異莰醇）。試驗(yàn)證明S. avermitilis 突變株可以表達(dá)不同類型的次級(jí)代謝產(chǎn)物，包括氨基糖苷類、非核糖體多肽類、聚酮類和萜類化合物。

3.3 Streptomyces lividans

殺稻瘟菌素（blasticidin S）是具有強(qiáng)抑制真菌活性的肽核苷類抗生素，由于殺稻瘟菌素產(chǎn)生菌S. griseochromogenes 的遺傳操作難以進(jìn)行，無(wú)法研究殺稻瘟菌素體內(nèi)的生物合成。Li 等［39］將包含有殺稻瘟菌素基因簇（bls）嫁接到Streptomyces lividans HXY16 的染色體上表達(dá)，發(fā)酵結(jié)果，突變株S. lividans LL2 沒(méi)有產(chǎn)生殺稻瘟菌素而產(chǎn)生去氨基羥化殺稻瘟菌素（Deaminohydroxymildiomycin，OHBS）。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，S. lividans 本身存在殺稻瘟菌素脫氨酶（SLBSD），基因敲除S. lividans LL2 中SLBSD 產(chǎn)生突變株S. lividans WJ2 能夠合成完整的殺稻瘟菌素，并可對(duì)殺稻瘟菌素生物合成基因簇關(guān)鍵基因進(jìn)行體內(nèi)功能研究。與殺稻瘟菌素有相似性結(jié)構(gòu)的肽核苷類抗生素米多霉素（Mildiomycin）具有強(qiáng)抑制植物白粉病的生物活性。在發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)Streptoverticillium rimofaciens ZJU5119 除產(chǎn)米多霉素外還產(chǎn)3 種衍生物［2］，在產(chǎn)生菌Streptoverticillium rimofaciens ZJU5119 中做敲除試驗(yàn)不利于分析米多霉素合成途徑。為研究米多霉素的合成途徑，Li 等［47］構(gòu)建Streptoverticillium rimofaciens ZJU5119 基因組文庫(kù)，利用殺稻瘟菌素胞嘧啶核苷單磷酸水解酶基因blsM 設(shè)計(jì)兼并引物，篩選到6 個(gè)cosmid。6 個(gè)cosmid 在Streptomyces lividans 1326 中異源表達(dá)，其中cosmid 14A6 在Streptomyces lividans 1326 中異源表達(dá)合成米多霉素，即cosmid 14A6 包含合成米多霉素所必須的完整基因簇［48］。結(jié)合異源表達(dá)及體外研究確定米多霉素基因簇邊界，并研究milA、milB 及milC 的功能，推測(cè)整個(gè)米多霉素的合成途徑［47，48］。信息學(xué)分析結(jié)合敲除實(shí)驗(yàn)確定了參與米多霉素生物合成的基因，其中milO 基因編碼LuxR 家族轉(zhuǎn)錄因子可能是途徑特異性調(diào)節(jié)因子，milK 基因編碼Major Facilitator Superfamily（MFS）。MilO、milK 可能是正調(diào)節(jié)子基因，過(guò)表達(dá)這兩個(gè)基因可能提高米多霉素的產(chǎn)量［49］。

4 小結(jié)

放線菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物具有重要的藥用價(jià)值，聚酮化合物的多種生物活性及合成規(guī)律性，使其具有巨大的潛在的藥物開(kāi)發(fā)及商業(yè)價(jià)值?，F(xiàn)今抗藥性病原菌的增加，新型細(xì)菌病毒的不斷出現(xiàn)，提高抗生素產(chǎn)量和尋找新藥是人們?cè)谒幬镩_(kāi)發(fā)過(guò)程中的長(zhǎng)期目標(biāo)。利用基因技術(shù)改變生物合成途徑，在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上調(diào)節(jié)基因簇的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，核糖體相關(guān)蛋白的定點(diǎn)突變與隨機(jī)突變相結(jié)合，構(gòu)建異源表達(dá)宿主及外源基因簇的表達(dá)等方法提高目的產(chǎn)物產(chǎn)量。異源表達(dá)以及關(guān)鍵基因的調(diào)節(jié)等方法的研究為組合生物學(xué)奠定基礎(chǔ)，通過(guò)組合生物學(xué)合成一些非天然次級(jí)代謝產(chǎn)物，利用基因技術(shù)改造聚酮化合物的基因簇以產(chǎn)生更多不同的活性化合物，組合生物學(xué)為新藥的研發(fā)提供豐富的資源［50］。

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