朱云霞 趙昕 張綺思 張海方

（江蘇大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，鎮(zhèn)江 212013）

質(zhì)粒是染色體外能夠進行自主復(fù)制的遺傳單位，廣泛存在于許多生物中，習(xí)慣上用來專指細菌、酵母菌和放線菌等生物中染色體以外的DNA 分子，它們能為宿主提供一些額外的功能，如抗藥性和毒力等，絕大多數(shù)的細菌質(zhì)粒都是閉合環(huán)狀DNA 分子。1979 年，在產(chǎn)抗生素的土壤微生物——婁徹鏈霉菌中發(fā)現(xiàn)了第一例原核生物線性質(zhì)粒［1］，到目前為止，已在數(shù)十種鏈霉菌中發(fā)現(xiàn)了線性質(zhì)粒，其分子大小在12-640 kb 之間［2］。1985 年，在疏螺旋體中發(fā)現(xiàn)了另一大類線性質(zhì)粒［3］。近來有研究表明，細球菌屬也有大線性質(zhì)粒存在，這些紅球菌的大線性質(zhì)粒缺陷株對紅霉素的抗性明顯減弱［4］。線性質(zhì)粒的發(fā)現(xiàn)糾正了所有細菌質(zhì)粒都是環(huán)狀結(jié)構(gòu)這一傳統(tǒng)觀點。線性質(zhì)粒作為一種特殊的質(zhì)粒分子，成為近年來基礎(chǔ)微生物學(xué)研究的一個新熱點。關(guān)于線性質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)、復(fù)制、遺傳和生物學(xué)功能等方面雖然已有了一定的研究，特別是近幾年在其復(fù)制的分子機制研究方面有了長足的進步，但距離科學(xué)開發(fā)和利用線性質(zhì)粒還很遠。

1 質(zhì)粒復(fù)制的一般概述

質(zhì)粒的復(fù)制和染色體的復(fù)制一樣也可以分為起始、延伸和終止3 個階段。其中復(fù)制的起始最為重要，主要包括復(fù)制起始點（oriV）的識別和復(fù)制起始復(fù)合物的裝配［5］。復(fù)制起始位點一般都有一富A-T 區(qū)和多個重復(fù)序列（重復(fù)子）和DnaA 結(jié)合位點，質(zhì)粒編碼的復(fù)制起始蛋白Rep 和宿主細胞的復(fù)制起始蛋白如DnaA 等能以有序的方式與oriV 的重復(fù)子結(jié)合，從而促使雙螺旋熔解形成開鏈復(fù)合體啟動復(fù)制［5］。每個細胞中的質(zhì)粒數(shù)即質(zhì)粒的拷貝數(shù)在細胞里從單一到數(shù)千都有可能，質(zhì)粒的拷貝數(shù)是受到多種機制嚴(yán)格控制的，是質(zhì)粒本身的一種復(fù)制特性體現(xiàn)［5］。環(huán)狀質(zhì)粒的復(fù)制以θ 復(fù)制方式和滾環(huán)復(fù)制方式為主。θ 復(fù)制被認為是革蘭陰性菌中質(zhì)粒復(fù)制的主要方式，而滾環(huán)復(fù)制被認為是革蘭陽性菌中質(zhì)粒復(fù)制的主要方式。

2 線性質(zhì)粒的復(fù)制

原核生物線性質(zhì)粒的復(fù)制及其環(huán)狀類似物的復(fù)制過程基本相同，而線性質(zhì)粒則必需解決如何復(fù)制DNA 的3'最末端這個問題。因此，線性質(zhì)粒的末端對其復(fù)制和穩(wěn)定存在是必需的。原核生物線性質(zhì)粒根據(jù)其末端結(jié)構(gòu)的不同主要有兩大類，一類其末端為共價閉合的發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)；另一類其末端共價結(jié)合了蛋白質(zhì)（末端蛋白）［6］。帶有發(fā)夾末端的線性質(zhì)粒雖然是雙鏈線性分子，但其中一條鏈的5'和3'端分別與另一條鏈的3'和5'端直接連在一起；帶有末端蛋白的線性質(zhì)粒含有末端反向重復(fù)序列和末端蛋白。鑒于線性質(zhì)粒的這些特殊的結(jié)構(gòu)特征，線性質(zhì)粒的復(fù)制在保留環(huán)狀質(zhì)粒復(fù)制過程中的基本規(guī)則外增添了許多自己的復(fù)制特點，如復(fù)制起始點的序列特征差異和線性質(zhì)粒的獨特的5'末端復(fù)制機制等［7］。

2.1 線性質(zhì)粒的復(fù)制起始區(qū)

復(fù)制的起始是整個質(zhì)粒復(fù)制的關(guān)鍵所在，因此線性質(zhì)粒復(fù)制起始區(qū)的鑒定是研究某一線性質(zhì)粒的復(fù)制機制的第一步。大量關(guān)于線性質(zhì)粒復(fù)制起始區(qū)的鑒定等研究工作主要集中在鏈霉菌的線性質(zhì)粒上。研究表明，大部分鏈霉菌線性質(zhì)粒的復(fù)制起始區(qū)一般都只有一個，位于線性質(zhì)粒的中部區(qū)域，其與環(huán)裝質(zhì)粒一樣也有一富A-T 區(qū)和一些重復(fù)序列，但與環(huán)狀質(zhì)粒的復(fù)制起始區(qū)的序列特征會有所不同［8］。然而，2010 年，Zhang 等［9］在鏈霉菌屬線性質(zhì)粒pFRL1 中發(fā)現(xiàn)了兩個復(fù)制起始區(qū)，一個位于質(zhì)粒中心部位；另一個靠近質(zhì)粒的一個末端，這兩個復(fù)制起始區(qū)在復(fù)制起始過程中可能存在某種協(xié)作作用。因此，線性質(zhì)粒的復(fù)制起始區(qū)可以只有一個，也可以有兩個或兩個以上，當(dāng)有兩個或兩個以上的起始區(qū)時，它們可以在不同情況下執(zhí)行各自的功能，這種機制還有待進一步研究。

不同物種遺傳物質(zhì)的復(fù)制起始區(qū)通常都具有相似性和保守性，如在復(fù)制起始區(qū)和終止區(qū)GC 含量會發(fā)生明顯轉(zhuǎn)折，因此對于線性質(zhì)粒復(fù)制起始區(qū)的鑒定，可以利用序列比對分析和GC 含量偏移分析（GC skew）等生物信息學(xué)手段進行預(yù)測，然后設(shè)計試驗加以驗證［10，11］。

2.2 線性質(zhì)粒的復(fù)制模型

2.2.1 具有共價閉合發(fā)夾末端的線性質(zhì)粒復(fù)制模型 具有共價閉合發(fā)夾末端的線性質(zhì)粒并不多見，主要見于疏螺旋體中的線性質(zhì)粒。此外，只發(fā)現(xiàn)N15 原噬菌體質(zhì)粒及奧克西托克克雷白桿菌的一個約50 kb 的線性質(zhì)粒pKO2，以及小腸結(jié)腸炎耶爾森菌噬菌體質(zhì)粒PY54［12-15］。這種以閉合發(fā)夾為末端的線性復(fù)制子的可能的復(fù)制方式有以下4 種［16-19］：（1）復(fù)制從內(nèi)部起始區(qū)開始并沿著兩個方向延伸至發(fā)夾末端，產(chǎn)生一個環(huán)狀的二聚體，此二聚體帶有連在一起的端粒序列，形成了反向重復(fù)區(qū)域，此反向重復(fù)區(qū)經(jīng)端粒解離酶作用使得環(huán)狀二聚體被切開，隨后兩條雙鏈的末端又形成了共價閉合末端，復(fù)制得以完成；（2）復(fù)制起始于閉合的發(fā)夾末端，隨著復(fù)制叉的移動形成了與第一種復(fù)制方式中相同的環(huán)狀二聚體，后面的復(fù)制過程與第一種相同；（3）共價閉合的線性分子經(jīng)特異性酶切后產(chǎn)生于兩端產(chǎn)生對稱的切口，使兩條閉合的鏈被分開，形成線性不相連的雙鏈結(jié)構(gòu)，隨后此雙鏈結(jié)構(gòu)被環(huán)化，利用DNA 聚合酶補齊缺口形成一個完整的環(huán)狀分子，此環(huán)狀分子由內(nèi)部起始雙向復(fù)制形成子代環(huán)狀分子，再經(jīng)特異性酶切回復(fù)線性結(jié)構(gòu)，相應(yīng)末端相連，形成兩個共價閉合的線性分子，完成復(fù)制；（4）與第三種方式相似，共價閉合的線性分子首先經(jīng)特異性酶切產(chǎn)生缺口形成黏末端的雙鏈分子，接著短缺的3'末端由DNA 聚合酶按模板鏈補齊，隨后每條鏈的末端發(fā)生重構(gòu)形成折回結(jié)構(gòu)，為子鏈復(fù)制提供了3'-OH，在DNA 聚合酶的作用下復(fù)制叉不斷前移，最后形成兩個共價閉合的線性分子。

2.2.2 具有末端蛋白結(jié)構(gòu)的線性質(zhì)粒復(fù)制模型 具有蛋白帽子末端結(jié)構(gòu)的線性質(zhì)粒主要來自放線菌，其典型的代表是鏈霉菌的線性質(zhì)粒。研究表明，婁徹氏鏈霉菌中的線性質(zhì)粒的復(fù)制是從內(nèi)部起始區(qū)開始向兩端進行的雙向復(fù)制［20，21］。當(dāng)新合成鏈5'末端的RNA 引物被切除后，就在5'末端產(chǎn)生了一個缺口，這一缺口的可能通過以下3 種不同的末端補丁機制來進行填補［22-26］。（1）折回模型。3'前導(dǎo)鏈的突出部分借助多拷貝回文序列與內(nèi)部互補序列堿基配對形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，末端蛋白經(jīng)輔助蛋白招募至此3'末端并識別末端的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，隨后DNA 聚合酶使用末端蛋白作為引物啟動復(fù)制從而填補缺口；（2）重組模型。首先，在完整的父代雙鏈分子末端以末端蛋白為引物合成了與前導(dǎo)鏈的5'端序列相同的DNA 序列，新合成的DNA 序列取代父代雙鏈中前導(dǎo)鏈的5'端，被取代的帶有末端蛋白的父代前導(dǎo)鏈5'端序列隨后與子代懸突的3'端序列堿基互補配對，形成了一個半霍利迪交叉結(jié)構(gòu)，從而通過同源重組完成了鏈置換，最后消除產(chǎn)生的半霍利迪交叉結(jié)構(gòu)；（3）末端發(fā)夾模型。前導(dǎo)鏈3'末端的13 bp長的回文序列折回形成一個小的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，此發(fā)夾結(jié)構(gòu)末端作為引物在DNA 聚合酶的作用下啟動復(fù)制并填補缺口，隨后末端蛋白結(jié)合于發(fā)夾結(jié)構(gòu)的開始處并在此切斷使前導(dǎo)鏈的3'端發(fā)生短缺，最后在DNA 聚合酶的作用下以新合成的完整后隨鏈為模板從5'到3'方向填補好前導(dǎo)鏈3'端的短缺。

3 線性質(zhì)粒pBSSB1 及其復(fù)制機制的研究現(xiàn)狀

近年來，在傷寒沙門菌中也發(fā)現(xiàn)了線性質(zhì)粒pBSSB1，該線性質(zhì)粒是目前為止在腸桿菌科中發(fā)現(xiàn)的唯一線性質(zhì)粒，其介導(dǎo)了H：z66 陽性傷寒沙門菌鞭毛的單向相變換［27，28］。pBSSB1 全長27 kb，共編碼33 個基因，其中包括二相鞭毛素編碼基因fljBz66和fljA 樣基因。本實驗室完成了fljBz66的表達調(diào)節(jié)機制研究和fljA 樣基因?qū)σ幌啾廾鼐幋a基因fliC 的抑制功能鑒定［29-31］。pBSSB1 兩端為1.2 kb 左右的末端反向重復(fù)序列（Terminal inverted repeats，Tirs），Tirs 是鏈霉菌線性質(zhì)粒所具有的結(jié)構(gòu)特征，推測pBSSB1 與鏈霉菌屬的線性質(zhì)粒相似，可能也是具有蛋白帽子末端結(jié)構(gòu)的線性質(zhì)粒。通過對其序列比對分析和GC 含量偏移分析（GC skew），提示在它的第17 號編碼基因的上游存在一個雙向復(fù)制的起始位點［27］。此外，本實驗室的研究表明，細菌基因組編碼的Fis 蛋白可以影響該質(zhì)粒的穩(wěn)定性，推測其可能通過調(diào)控線性質(zhì)粒復(fù)制必需的末端蛋白編碼基因影響pBSSB1 的復(fù)制［32］。但目前為止，關(guān)于線性質(zhì)粒pBSSB1 的復(fù)制機制還不甚清楚，如與質(zhì)粒復(fù)制關(guān)系非常密切的該質(zhì)?？截悢?shù)是否在細菌不同的生長時期有所變化，質(zhì)粒上非常重要的復(fù)制起始點還未通過具體的實驗加以驗證確定，該線性質(zhì)粒所編碼的一系列基因與復(fù)制的關(guān)系等，這些問題都亟待研究解決，從而才能全面揭示該線性質(zhì)粒復(fù)制的分子機制。

4 結(jié)語

雖然線性質(zhì)粒的復(fù)制與環(huán)狀質(zhì)粒的復(fù)制有很多共性，但線性質(zhì)粒復(fù)制有自己的特點。它最大的特點就是需要面對與真核生物染色體復(fù)制相同的問題：如何填補5'末端的缺口。具有蛋白帽子末端結(jié)構(gòu)的線性質(zhì)粒利用末端蛋白作為引物在DNA 聚合酶的作用下啟動復(fù)制填補缺口；具有共價閉合發(fā)夾末端的線性質(zhì)粒利用其閉合的末端避開了會產(chǎn)生缺口這一問題，在復(fù)制結(jié)束時利用端粒解離酶或其他特異性酶切開相連的末端再重新連接，恢復(fù)共價閉合的發(fā)夾末端。本文所提及的解決這一末端填補問題的每一個復(fù)制模型都有其合理性，是否還有其他復(fù)制模型存在還有待于進一步深入的研究加以揭示。

在具有蛋白帽子末端結(jié)構(gòu)的線性質(zhì)粒復(fù)制模型中，末端蛋白發(fā)揮了重要作用。雖然很多線性質(zhì)粒本身具有末端蛋白的編碼基因（tpg），但也有一些小的質(zhì)粒本身沒有tpg，需要借用宿主染色體編碼的末端蛋白來完成復(fù)制。已有研究發(fā)現(xiàn)，一些線性質(zhì)粒本身編碼或宿主染色體編碼的末端輔助蛋白可以招募宿主染色體編碼的末端蛋白，從而完成自身的復(fù)制［33］，這其中的機理還有待研究。同時，線性質(zhì)粒在復(fù)制過程中是否會通過整合到宿主染色體上，利用宿主的資源完成自身復(fù)制后再獨立出來，即線性質(zhì)粒的復(fù)制與宿主染色體復(fù)制之間的聯(lián)系還有待研究。

另外，研究表明有一些鏈霉菌屬的線性質(zhì)粒末端序列缺失后，其兩端可融合并以環(huán)狀形式復(fù)制［9］，因此這些末端序列是維持質(zhì)粒以線性形式復(fù)制的必要元件；既然線性質(zhì)粒在一定情況下可以環(huán)狀形式復(fù)制，這種線性復(fù)制與環(huán)狀復(fù)制的轉(zhuǎn)換是否也會發(fā)生在自然條件下還有待研究。

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