呂曉萌 胡彤 俞婷 崔艷華

抗菌肽最早發(fā)現(xiàn)于惜古比天蠶蛹中，隨著研究的深入，人們在動植物、微生物及人體內(nèi)都發(fā)現(xiàn)了抗菌肽的存在。目前為止已有上百種抗菌肽的結(jié)構(gòu)被測定?？咕姆肿恿恳话爿^小，含有20-60個氨基酸殘基，呈現(xiàn)明顯的陽離子特性，具有兩親性，在較高、較低的pH值條件下都有較強的活性，且較強的熱穩(wěn)定性［1］。獲得抗菌肽一般通過3種途徑：分離純化天然抗菌肽、化學合成和基因工程技術(shù)生產(chǎn)抗菌肽。天然存在的抗菌肽通常產(chǎn)量低，無法大量提??；化學合成費用昂貴。因此基因工程技術(shù)是目前一種較有效獲得抗菌肽的方法［2］。目前多種抗菌肽已在細菌、酵母、植物等系統(tǒng)中成功重組表達。本文著重闡述抗菌肽在大腸桿菌、乳酸菌中重組表達的研究進展。

1 抗菌肽在大腸桿菌中的表達

大腸桿菌由于其生長速度快、遺傳背景清晰、有大量可利用的商業(yè)表達載體、易操作、費用相對低，對蛋白質(zhì)的耐受力強等［2］優(yōu)點而備受研究者的青睞，尤其是其特有的多種質(zhì)粒、重組融合伴侶以及突變菌株更增強其成為宿主的可能性［3］。因此成為抗菌肽表達的首選宿主。

1.1 表達策略

1.1.1 密碼子偏愛性改造 由于大腸桿菌基因組缺乏識別某些密碼子的tRNA，導致大腸桿菌對密碼子的使用有相當程度的偏愛性，同一密碼子家族只有很少密碼子被反復使用。因此來自真核生物基因的表達會受到影響。通?？梢詫⒚艽a子設(shè)計成宿主偏愛的密碼子序列可以提高表達水平。Li等［4］將人β-防御素基因在大腸桿菌中表達時的密碼子改造為大腸桿菌偏愛的基因，從而獲得高效融合表達，融合蛋白占細菌總蛋白的50％以上，是野生型基因表達量的9倍。除改造外源基因外，也可以選擇合適的表達菌株。Rosetta系列宿主菌是BL21衍生菌，其可以補充密碼子CCC、AUA及GGA的tRNAs，從而克服了大腸桿菌的偏好性對外源基因表達的影響［5］。

研究者研究了人體防御素-5（HBD5）和防御素-6（HBD6）在大腸桿菌中的重組表達。防御素-5和防御素-6基因進行了密碼子優(yōu)化，每個基因分別與一個硫氧還蛋白A構(gòu)建成表達載體，轉(zhuǎn)化到Escherichia coli BL21（DE3）菌株并且在MBL培養(yǎng)基中培養(yǎng)，結(jié)果得到高體積產(chǎn)率的HBD5和HBD6融合蛋白，分別為1.49g/L和1.57g/L。純HBD5和HBD6的回收率分別為38％和35％。兩種表達蛋白對大腸桿菌均有抗菌活性［6］。

Wang等［7］首次提出通過基因工程的方法將人類α-防御素 6（HD6）在大腸桿菌中高效生產(chǎn)。HD6主要在人體消化道內(nèi)的上皮細胞中表達，在黏膜免疫中發(fā)揮重要作用。編碼成熟HD6的mHD6序列根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好性進行了優(yōu)化。將優(yōu)化后的序列omHD6克隆到表達載體pET32a（+）上，該表達載體含有硫氧還蛋白（TrxA）。在這種優(yōu)化表達的情況下，融合蛋白TrxA-omHD6可溶性較高（＞60％），產(chǎn)量大約為1.69g/L，重組mHD6（rmHD6）的理論產(chǎn)量大約為0.38g/L。經(jīng)過一系列分離純化rmHD6，體外試驗表明，rmHD6對單純的皰疹病毒-2具有較強的抑菌作用。

Wang等［8］根據(jù)大腸桿菌密碼子的偏好性合成了buforin II的模擬物buforin IIb，將其克隆到載體pET32a中，獲得了重組質(zhì)粒pET32a-buforinIIb。轉(zhuǎn)化大腸桿菌，獲得了重組buforin IIb。經(jīng)純化后得到純度＞99％的活力為3.1mg/L的重組buforin IIb，其活力與化學合成的buforin IIb相似。

1.1.2 串聯(lián)表達 由于抗菌肽的分子量較小，對其表達純化等都會造成一定的負面影響，因此為了解決這一問題，從源頭上提高蛋白質(zhì)的產(chǎn)量，人們采用了基因多拷貝同向串聯(lián)融合表達的策略。例如，成熟的人體內(nèi)的抗菌肽β-防御素-2在串聯(lián)表達的情況下，產(chǎn)量提高 6倍［9］。2007年，沈益等［10］將天然腫瘤壞死因子TNFa的3'端與抗菌肽cecropin-Xm基因串聯(lián)在一起，在菌株BL21中誘導融合表達，融合蛋白經(jīng)純化后用CNBr（Cianogen Bromide）切割，體外活性試驗顯示其具有抗菌性及抗腫瘤活性。同時此策略也有效地避免抗菌肽對宿主菌的毒性。

預(yù)測水源地持續(xù)20年后水位下降值和5年、10年相近(圖3)，觀測井受水源地影響較小(下降值0.11～0.25 m)。預(yù)測地下水位在初期將可能伴隨急劇下降，經(jīng)過地下水的調(diào)蓄，在3～4年里，水源地運行相對穩(wěn)定。

Rao等［11］設(shè)計了肽抗生素hPAB-beta的串聯(lián)重復多聚體，并且分別構(gòu)建了含有1-8個拷貝hPAB-beta基因的重組質(zhì)粒。含有重組pQE-hPAB-beta 1-8重組體的8個基因工程菌能夠分別以包涵體形式表達hPAB-beta多聚體，蛋白表達量達到總蛋白量的2.6％-28％。hPAB-beta 三聚體具有較高的表達水平（27.8％），細胞濕重產(chǎn)量達到3.15±0.45g/L。融合蛋白包涵體溶解于8mol/L的尿素中，經(jīng)過純化后，獲得重組hPAB-beta對微生物臨床菌株的最小抑菌濃度為31-250mg/mL，結(jié)果證明重組hPAB-beta保持了其生物活性。

1.1.3 融合表達 抗菌肽的表達會遇到兩個挑戰(zhàn)：一是由于其分子量小及高陽離子特性，對蛋白酶敏感，易被宿主菌中的蛋白酶降解；二是抗菌肽的抗菌特性對宿主細胞具有潛在的殺傷力［12］。為了避免上述情況的發(fā)生，一般采用以融合蛋白的形式在大腸桿菌中表達抗菌肽基因，即在抗菌肽的N端連接一段蛋白質(zhì)序列，這樣表達出的融合蛋白對宿主細胞無影響且提高了表達水平，最后目標抗菌肽可以通過酶學或化學的裂解劑在融合位點釋放出來［13］。

載體蛋白通常分為兩類：（1）一類是提升溶解性的載體蛋白如谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（Glutathione S-transferase，GST）、 硫 氧 還 蛋 白（Thioredoxin，Trx）、小泛素修飾物（Small ubiquitinlike modifier，SUMO）等。其中麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP）和N-利用物A（NusA）也被用作載體，尤其是在易形成包涵體的蛋白質(zhì)中［2，3］。硫氧還蛋白是當前抗菌肽表達中應(yīng)用最為廣泛的載體蛋白，占已報道融合表達的抗菌肽的20％以上，成功表達了Cecropin CM-4、β-防 御 素 3、Hinnavin II、Indolicidin、Lactoferricin和 Perinerin 等不同來源的抗菌肽［2，3，12］。硫氧還蛋白作為二硫鍵還原酶，可以有效地催化二硫鍵在大腸桿菌細胞質(zhì)中形成，同時其也顯現(xiàn)出類似分子伴侶的活性。以上特性利于二硫鍵的形成和抗菌肽的正確折疊。SUMO是一種與泛素結(jié)構(gòu)相關(guān)但功能不同的小蛋白，約由100個氨基酸組成。SUMO表面親水性，內(nèi)部呈現(xiàn)疏水性，因此其具有高度可溶性。作為融合蛋白伴侶，SUMO可以有效改善目標蛋白的折疊、可溶性及表達量。在體外用SUMO蛋白酶合理的去除SUMO標簽可以方便帶有N末端的目標蛋白的產(chǎn)生。由于其在真核生物中的生理相關(guān)性，因此SUMO可以作為一種合適的在真核生物原核生物中提高蛋白表達的生物技術(shù)工具［14］。近年SUMO已經(jīng)成功用于 Brazzein、Exendin-4、hEGF、Urodilatin、Cecropin CM-4和β-防御素4等抗菌肽的表達［2，12］。（2）另一類是促進聚合的載體蛋白以加速融合蛋白包涵體的形成，如PurF片段、甾酮異構(gòu)酶（Ketosteroid isomerase）、TAF12組蛋白折疊域、類固醇異構(gòu)酶及PAP3.30等［13］。此類載體蛋白利用是基于不溶表達可有效的防護抗菌肽對宿主細胞的毒害，并且保護其免受宿主蛋白酶的降解的認識。該類融合表達蛋白利于快速純化，并且不含半胱氨酸的抗菌肽不需要復性。

1.1.4 雜合表達 將來源不同的抗菌肽進行雜合表達是當今抗菌肽表達研究的熱點之一。最初雜合抗菌肽由化學合成的方法獲得［15］。最早雜合抗菌肽的1-11氨基酸來自cecropin A，12-37氨基酸來自cecropin D，結(jié)果顯示其抗菌活性是cecropin D的5-55倍［15］。這一結(jié)果，給研究者很大的啟發(fā)。近年來研究者成功在大腸桿菌中表達了一系列不同來源的雜合抗菌肽，如 CA-MA、hin/MSH 和 LFT33等［16-18］。研究者將家蠅的泛素序列克隆到質(zhì)粒pQE30中，構(gòu)建載體pQEUBI。而后將大腸桿菌偏愛的密碼子合成編 碼 CA-MA［cecropinA（1-8）-magainin2（1-12）］的cDNA片段，克隆到載體pQEUBI中，雜合抗菌肽CA-MA與泛素融合表達。融合蛋白以可溶性形式高效表達，占總蛋白的36％。融合蛋白切除泛素后，產(chǎn)生的 CA-MA具有較高抗菌活性［16］。

編碼hinnavin II/α-黑色素細胞刺激素雜合肽hin/MSH克隆到pET32a（+）。雜合肽在大腸桿菌BL21中以融合蛋白形式表達，50％的重組蛋白以可溶形式表達，切除Trx-hin/MSH后，具有廣譜的抗菌活性［17］。

與親本相比，現(xiàn)已表達的雜合抗菌肽均顯示了更為廣譜的抗菌能力和更強的抗菌活性。新型雜合抗菌肽LFT33 由源于牛乳鐵蛋白N端的LfcinB 和昆蟲抗真菌肽thanatin衍生而來。LfcinB和thanatin均具有廣譜的抗菌活性，對革蘭氏陽性菌和陰性菌及真菌具有抑制作用。LFT33整合了LfcinB的1-15氨基酸和thanatin的4-21氨基酸。其cDNA片段以大腸桿菌偏好性密碼子進行化學合成，并構(gòu)建到pET32a（+）載體上，成功在大腸桿菌中融合表達［18］。

1.2 抗菌肽在大腸桿菌中的表達

目前，研究者已經(jīng)利用大腸桿菌為宿主，表達了大量不同來源的抗菌肽。謝芳等［19］利用pGEX-3X作為載體，將牛蛙皮膚抗菌肽ranalexin基因插入載體中，建立表達載體，將表達條件優(yōu)化至IPTG終濃度為1.0mmol/L、誘導時間為5-6h，并確定其對金黃色葡萄球菌有顯著的體外抑制作用。韓宗璽等［20］將雞舌組織中的Gal-9基因與大腸桿菌表達載體結(jié)合后再轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，37℃培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)重組蛋白占菌體總蛋白的40％，且經(jīng)純化后的重組蛋白對生長中期的大腸桿菌和致病性鏈球菌均有抑制作用。Tapia等［21］將雜合基因編碼為Ap-S后轉(zhuǎn)錄到大腸桿菌BL21中，純化后的重組Ap-S被用于抗真菌劑，在菌絲結(jié)構(gòu)中其具有很強的抑制活體營養(yǎng)型和死體營養(yǎng)型真菌的活性。這項技術(shù)可以用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。Wu等［22］將雜合肽MVF-EGFR237-267編碼序列分別克隆到pET-21b和pET-32a中，單獨表達或者與硫氧還蛋白、His6-tag形成融合蛋白的形式表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)單獨形式無法表達，而融合形式可過量表達。這種重組的雜合肽產(chǎn)量較高，且可用于針對二聚表皮生長因子受體的治療性抗菌肽疫苗。

2 抗菌肽在乳酸菌中的表達

乳酸菌是一類可發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生乳酸的細菌的總稱，廣泛應(yīng)用于酸奶、泡菜及其他發(fā)酵食品的生產(chǎn)。部分乳酸菌存在于人類體內(nèi)具有促進營養(yǎng)物質(zhì)吸收，改善人胃腸道功能；抑制有害細菌的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等益生功效［23］。乳酸菌作為世界公認安全（Generally recognized as safe，GRAS）的食品級微生物，與大腸桿菌相比，其更具直接應(yīng)用于食品及臨床領(lǐng)域的潛力［24］。除此以外，將乳酸菌替代大腸桿菌作為基因工程的宿主菌具有很多其他優(yōu)勢，如乳酸菌具有高度可調(diào)控的啟動子系統(tǒng)，在細胞內(nèi)外均可表達外源基因并能將其分泌到胞外培養(yǎng)基中［25］。Christiaens等［26］證實了乳酸菌的染色體組經(jīng)改造后幾乎不分泌蛋白，適合外源基因的表達。

2.1 乳酸菌的表達系統(tǒng)

2.1.1 表達宿主 乳酸乳球菌是當前應(yīng)用最為廣泛的乳酸菌重組表達宿主。作為乳酸菌的模式菌，該菌是最早完成全基因組測序的乳酸菌［27］。當前已經(jīng)完成多株乳酸乳球菌的全基因組測序，其中包括當前常用的宿主菌株Lactococcus lactis subsp. cremoris MG1363和NZ9000。上述乳酸菌全基因組序列的解析，為在全基因組水平，獲得該菌基因轉(zhuǎn)錄、代謝調(diào)控信息；明確其遺傳背景；構(gòu)建適宜載體、提高外源基因表達效率，奠定了基礎(chǔ)。分子遺傳操作工具相對完善，使得乳酸乳球菌廣泛用于外源基因的表達。當前已有大量外源基因，其中包括Acidocin A、Enterocin A、Lactacin F和Pediocin PA-1等多種抗菌肽基因在乳酸乳球菌中成功表達［24，28］。

植物乳酸菌（Lactobacillus plantarum）［29-33］、沙克乳桿菌（Lactobacillus sakei）［31-33］、冷明串珠菌（Leuconostoc gelidum）［33］、糞腸球菌（Enterococcus faecalis）［32］和約氏乳桿菌（Lactobacillus johnsonii）［32］等也被用作外源基因的表達載體。

2.1.2 表達系統(tǒng) 表達系統(tǒng)依據(jù)啟動子的不同可分為組成型表達系統(tǒng)和誘導型表達系統(tǒng)。表達載體pMG36e是組成型表達的代表，其具有強啟動子p32，以及來自廣宿主乳球菌質(zhì)粒pWV01的復制子［34］。該質(zhì)粒大小適中，為3.6 kb，便于遺傳操作；且具有紅霉素抗性，利于篩選?？咕膃nterocin P［35］、enterocin A［36］、Sakacin A［37］等由 pMG36e 的衍生質(zhì)粒pMG36c在乳酸乳球菌中均成功表達，可以有效抑制李斯特菌。

組成型表達系統(tǒng)中，連續(xù)的高產(chǎn)量表達會導致細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的積累、聚集，對細胞產(chǎn)生毒害。因此一般選擇誘導型表達系統(tǒng)。其中Nisin調(diào)控的表達系統(tǒng)（Nisin-controlled gene expression system，NICE）是最為常用的誘導型表達系統(tǒng)。NICE系統(tǒng)是基于抗菌肽nisin生物合成的自我調(diào)節(jié)機制而建立，該系統(tǒng)具有精細調(diào)控和高度誘導能力，是當今最為成熟的乳酸菌表達系統(tǒng)［38］。在NICE系統(tǒng)中，定位于細胞膜上組氨酸蛋白激酶NisK感知誘導信號nisin，并且發(fā)生自我磷酸化，接著將磷酸基團轉(zhuǎn)移到細胞內(nèi)的應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白NisR，后者激活nisA啟動子，進而下游基因表達。NICE系統(tǒng)可以通過Lactobacillus、Streptococcus、Enterococcus、Bacillus、Leuconostoc lactis和Lactobacillus helveticus等革蘭氏陽性菌過量表達蛋白，尤其是乳酸乳球菌L. lactis。

抗菌肽Apidaecin以與泛素融合的方式利用NICE系統(tǒng)成功表達，融合蛋白的產(chǎn)量高達宿主整個可溶性蛋白的7.2％；切除融合蛋白泛素后，表現(xiàn)出明顯抗菌活性［39］。分離自Pediococcus acidilactici的IIa型抗菌肽pediocin PA-1對李斯特菌具有很強的抑菌能力。研究者利用NICE系統(tǒng)成功表達了具有抗菌活性的 pediocin PA-1［40］。Renye 等［41］利用nisin誘導表達載體pMSP3535H3，在Streptococcus thermophilus，L. lactis ssp. lactis 和 L. casei等 多 個乳酸菌宿主中表達了抗菌肽pediocin，均對Listeria monocytogenes Scott A具有明顯抑菌活性。

雙組分信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)（Two-component regulatory system，TCS）普遍存在于革蘭氏陽菌的抗菌肽的合成調(diào)控中。因此相繼在沙克乳桿菌（L.sakei）［42］、 腸 球 菌（Enterococcus）［43］、 植 物 乳 酸菌（L. plantarum）［44］等乳酸菌中建立了類似NICE的表達系統(tǒng)。同時基于IIa類抗菌肽sakacin A或者sakacin P的啟動子和調(diào)控基因建立了一系列表達載體pSIP［31，45］。除了NICE誘導型表達載體外，還有pH、乳糖、溫度敏感型誘導系統(tǒng)等誘導表達系統(tǒng)。

2.1.3 信號肽 大多數(shù)由乳酸菌產(chǎn)生的抗菌肽，通過相應(yīng)的ABC型轉(zhuǎn)運系統(tǒng)和其輔助蛋白運輸?shù)郊毎狻６S多分泌型的原核蛋白和少數(shù)的抗菌肽（如enterocin P、hiracinJM79）在N端具有所謂的Sec型信號肽。此類信號肽被信號肽酶所識別，并被切除。成熟蛋白或者肽通過一般分泌系統(tǒng)（General secretory pathway，GSP）或者 Sec-依賴型途徑被運輸?shù)郊毎?，最終導致成熟蛋白或者肽釋放到細胞外。因此分泌蛋白N端的信號肽在外源表達中，可以引導融合的成熟蛋白或者肽進行分泌表達［46，47］。

為提高外源蛋白的分泌表達，利于蛋白分泌的信號肽被應(yīng)用。當前，來自乳酸乳球菌MG1363主要胞外蛋白Usp45的信號肽被廣泛應(yīng)用，并顯示較好的促進分泌表達的效果［48-50］。Usp45的信號肽由27個氨基酸組成，這27個前導肽殘基序列揭示了信號肽的3重特征：擁有一個帶正電的N末端；一個中央疏水核心及一個C末端裂解區(qū)域［48］。

Sec-依賴型的抗菌肽enterocin P、hiracin JM79的信號肽也被用于外源基因的分泌表達中，尤其是抗菌肽的分泌表達中。Usp45、enterocin P、hiracin JM79的信號肽SPusp45、SPentP和SPhirJM79分別與成熟的enterocin A和免疫蛋白EntiA融合，被克隆在表達載體pNZ8048和 pMSP3545（誘導型啟動子PnisA）和pMG36c（組成型啟動子P32）上，轉(zhuǎn) 化 到 Lactococcus lactis、Enterococcus faecium、E.faecalis、L. sakei和P. acidilactici等不同乳酸菌中。研究發(fā)現(xiàn)enterocinA的表達量、抗菌活性和特異抗菌活性依信號肽、表達載體、宿主不同而存在差異。其中重組L. lactis NZ9000（pNZUAI）和L. lactis NZ9000（pNZHAI）的上清中過量表達的enterocin A，對不同的李斯特菌的抗菌活性是enterocin A原始分泌菌株E. faecium T136的1.2-5.1倍［51］?？梢姡盘栯牡奶砑哟龠M了外源抗菌肽的分泌表達。

2.2 抗菌肽在乳酸菌中的重組表達

周緒霞［52］通過對蜜蜂抗菌肽的結(jié)構(gòu)分析，以乳酸乳球菌為表達載體，實現(xiàn)了蜜蜂抗菌肽在乳酸乳球菌中的分泌表達。李樸等［53］采用PCR方法合成bactenecin7基因及其相關(guān)調(diào)控基因，克隆到載體pMG36e中，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到乳酸菌中后發(fā)現(xiàn)該乳酸菌能分泌表達bactenecin7，并具有抑菌作用。

O’Keeffe等［54］將一段 10.5kb 含有 enterocin A生物合成的所有基因和調(diào)控區(qū)域的片段，克隆到大腸桿菌-乳酸乳球菌穿梭性載體pCI372中。攜帶重組質(zhì)粒pENT03的E. faecalis OG1X轉(zhuǎn)化子，在固體培養(yǎng)基中產(chǎn)生了enterocin A和其誘導因子。在液體培養(yǎng)基中，僅在加入外源的誘導因子后才發(fā)現(xiàn)enterocin A的合成。研究者推測這個結(jié)果是由于缺乏調(diào)節(jié)enterocin A合成的雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)表達。

為了獲得更加廣譜的抗菌能力，研究者嘗試將多個不同抗菌肽在乳酸菌中共同表達，但是效果不盡理想。Martínez等［55］研究了在乳酸乳球菌IL1403中共同表達pediocin PA-1和enterocin A。攜帶有pediocin PA-1的結(jié)構(gòu)基因和免疫基因的pMG36c和攜帶有enterocin A的結(jié)構(gòu)基因和免疫基因的pHB04被共同轉(zhuǎn)化到L. lactis IL1403中。獲得轉(zhuǎn)化子上清中的pediocin PA-1和enterocin A濃度較低，僅為野生型的4％和5％。因此，并不適合共同表達。II型抗菌肽Acidocin A分離自嗜酸乳桿菌TK9201，該菌為生產(chǎn)發(fā)酵乳的發(fā)酵劑［56］。決定Acidocin A生物合成的基因位于一個45kb的質(zhì)粒pLA9201上。一段0.9kb包含Acidocin A結(jié)構(gòu)和免疫的基因片段被克隆到大腸桿菌-乳酸菌穿梭性載體pULA105E中。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到不產(chǎn)acidocin A的突變株TK9201-1中，未能產(chǎn)生Acidocin A。同樣的研究，克隆pLA9201限制片段側(cè)翼的acdA，表明結(jié)構(gòu)基因的上游區(qū)域?qū)cidocin A 合成是必要的［56］。

除了大腸桿菌和乳酸菌，其他細菌也被應(yīng)用于抗菌肽的外源表達。革蘭氏陽性菌枯草芽孢桿菌作為宿主，成功表達了天蠶素A和D雜合肽［57］。李麗等［58］將蜜蜂抗菌肽Abaecin基因插入表達載體pGplat，而后轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌中以表達重組蛋白，結(jié)果表明表達蛋白對大腸桿菌及沙門氏菌均有抑制作用。也有研究表明費氏丙酸桿菌（Propionibacterium freudenreichii）同樣可以作為抗菌肽的表達宿主［58］。Brede 等［59］基于 P. freudenreichii中滾環(huán)復制且攜帶氯霉素抗性的pLME108質(zhì)粒，構(gòu)建了大腸桿菌和P. freudenreichii間的穿梭性載體；并利用此系統(tǒng)成功表達了來自Propionibacterium thoenii的抗菌肽基因。

3 小結(jié)

抗菌肽的重組表達涉及多種表達宿主，其中大腸桿菌因其易培養(yǎng)、費用低、操作方便等特點而成為抗菌肽在原核生物中表達的主要表達宿主。大腸桿菌表達中主要存在抗菌肽分子量小不利于純化，且表達蛋白對宿主產(chǎn)生毒害等問題。在乳酸菌中的重組表達也較為廣泛，且與大腸桿菌相比，更適合應(yīng)用于食品領(lǐng)域，因此具有較大的研究與應(yīng)用潛力。但目前對乳酸菌的遺傳背景了解相對較少，表達系統(tǒng)并不十分完善，存在表達效率低和不穩(wěn)定等問題。因此，建立高效表達、便于后期純化的表達系統(tǒng)，仍是抗菌肽異源表達研究的重點。

［1］Drider D, Rebuffat S. Prokaryotic antimicrobial peptides：from genes to applications［M］. Springer New York Dordrecht Heidelberg London, 2011.

［2］Parachin NS, Mulder KC, Viana AAB, et al. Expression systems for heterologous production of antimicrobial peptides［J］. Peptides,2012, 38（2）：446-456.

［3］Sorensen HP, Mortensen KK. Advanced genetic strategies for recombinant protein expression in Escherichia coli［J］. J Biotechnol, 2005, 115（2）：113-128.

［4］Li P, Xu ZN, Fang XM, et al. Preferential codons enhancing expression level of human beta- defensin-2 in recombinant Escherichia coli［J］. Protein ＆Peptide Letters, 2004, 11（4）：229-344.

［5］Kane JF. Effects of rare codon clusters on high-level expression of heterologous proteins in Escherichia coli［J］. Curr Opin Biotechnol,1995, 6（5）：494-500.

［6］Huang L, Ching CB, Jiang R, et al. Production of bioactive human beta-defensin 5 and 6 in Escherichia coli by soluble fusion expression［J］. Protein Expr Purif, 2008, 61（2）：168-174.

［7］Wang A, Su Y, Wang S, et al. High efficiency preparation of bioactive human alpha-defensin 6 in Escherichia coli Origami（DE3）pLysS by soluble fusion expression［J］. Appl Microbiol Biotechnol, 2010,87（5）：1935-1942.

［8］Wang Q, Zhu F, Xin Y, et al. Expression and purification of antimicrobial peptide buforin IIb in Escherichia coli［J］. Biotechnol Lett, 2011, 33（11）：2121-2126.

［9］Zhong Z, Xu Z, Peng L, et al. Tandem repeat mhBD2 gene enhance the soluble fusion expression of hBD2 in Escherichia coli［J］. Appl Microbiol Biotechnol, 2006, 71（5）：661-667.

［10］沈益, 勞學剛, 耿偉, 等. 抗菌肽cecropin-Xm在大腸埃希菌中的串聯(lián)表達與抑瘤作用［J］. 中國抗生素雜志, 2007, 32（12）：757-761.

［11］Rao X, Hu J, Li S, et al. Design and expression of peptide antibiotic hPAB-beta as tandem multimers in Escherichia coli［J］. Peptides,2005, 26（5）：721-729.

［12］Li YF. Carrier proteins for fusion expression of antimicrobial peptides in Escherichia coli［J］. Biotechnol Appl Biochem, 2009,54（1）：1-9.

［13］Li YF. Recombinant production of antimicrobial peptides in Escherichia coli：a review［J］. Protein Expr Purif, 2011, 80（2）：260-267.

［14］Peroutka IRJ, Orcutt SJ, Strickler JE, et al. SUMO fusion technology for enhanced protein expression and purification in prokaryotes and eukaryotes［J］. Methods Mol Biol, 2011, 705：15-30.

［15］Fink J, Merrifield RB, Boman A, et al. The chemical synthesis of cecropin D and an analog with enhanced antibacterial activity［J］.J Biol Chem, 1989, 264（11）：6260-6267.

［16］Xu XX, Jin FL, Yu XQ, et al. High-level expression of the recombinant hybrid peptide cecropinA（1-8）-magainin2（1-12）with an ubiquitin fusion partner in Escherichia coli［J］. Protein Expr Purif, 2007, 55（1）：175-182.

［17］Bang SK, Kang CS, Han MD, et al. Expression of recombinant hybrid peptide hinnavin II/α-melanocyte-stimulating hormone in Escherichia coli：purification and characterization［J］. J Microbiol, 2010, 48（1）：24-29.

［18］Feng X, Liu C, Guo J, et al. Recombinant expression, purification,and antimicrobial activity of a novel hybrid antimicrobial peptide LFT33［J］. Appl Microbiol Biotechnol, 2012, 95（5）：1191-1198.

［19］謝芳, 韓文瑜, 雷連成 , 等 . 牛蛙皮膚抗菌肽Ranalexin 基因的原核表達及其抑菌活性［J］. 浙江大學學報：農(nóng)業(yè)與生命科學版 , 2009, 35（1）：27-32.

［20］韓宗璽, 馬德瑩, 劉勝旺, 等. 重組雞抗菌肽Gallinacin-9的原核表達及其抗菌活性的鑒定［J］. 畜牧獸醫(yī)學報, 2008, 39（10）：1426-1431.

［21］Tapia E, Montes C, Rebufel C, et al. Expression of an optimized Argopecten purpuratus antimicrobial peptide in E. coli and evaluation of the purified recombinant protein by in vitro challenges against important plant fungi［J］. Peptides, 2011, 9（32）：1909-1916.

［22］Wu MZ, Zhao L, Zhu L, et al. Expression and purification of chimeric peptide comprising EGFR B-cell epitope and measles virus fusion protein T-cell epitope in Escherichia coli［J］. Protein Expr Purif, 2013, 1（88）：7-12.

［23］崔艷華, 徐德昌, 曲曉軍. 乳酸菌基因組學研究進展［J］. 生物信息學, 2008, 6（2）：85-89.

［24］Chen R. Bacterial expression systems for recombinant protein production：E. coli and beyond［J］. Biotech Advances, 2012, 30（5）：1102-1107.

［25］Mierau I, Olieman K, Mond J, et al. Optimization of the Lactococcus lactis nisin controlled gene expression system NICE for industrial applications［J］. Microb Cell Fact, 2005, 4：16.

［26］Christiaens H, Leer RJ, Pouwels PH. Cloning and expression of a conjugated bile acid hydrolase gene from Lactobacillus plantarum by using a direct plate assay［J］. Appl Environ Microbiol, 1992,58（12）：3792-3798.

［27］Bolotin A, Wincker P, Mauger S, et al. The complete genome sequence of the lactic acid bacterium Lactococcus lactis ssp. lactis IL1403［J］. Genome Res, 2001, 11（5）：731-753.

［28］Rodríguez JM, Martínez MI, Horn N, et al. Heterologous production of bacteriocins by lactic acid bacteria［J］. Int J Food Microbiol,2003, 80（2）：101-116.

［29］Mathiesen G, Naml?s HM, Ris?en PA, et al.Use of bacteriocin promoters for gene expression in Lactobacillus plantarum C11［J］. J Appl Microbiol, 2004, 96（4）：819-827.

［30］Mathiesen G, Sveen A, Piard JC, et al. Heterologous protein secretion by Lactobacillus plantarum using homologous signal peptides［J］. J Appl Microbiol, 2008, 105（1）：215-226.

［31］S?rvig E, Mathiesen G, Naterstad K, et al. High-level, inducible gene expression in Lactobacillus sakei and Lactobacillus plantarum using versatile expression vectors［J］. Microbiology, 2005, 151,2439-2449.

［32］Klaenhammer T, Altermann E, Arigoni F, et al. Discovering lactic acid bacteria by genomics［J］. Antonie Van Leeuwenhoek, 2002,82（1-4）：29-58.

［33］Peterbauer C, Maischberger T, Haltrich D. Food-grade gene expression in lactic acid bacteria［J］. Biotech J, 2011, 6（9）：1147-1161.

［34］van de Guchte M, van der Vossen JM, Kok J, et al. Construction of a lactococcal expression vector：expression of hen egg white lysozyme in Lactococcus lactis subsp. lactis［J］. Appl Environ Microbiol, 1989, 55（1）：224-228.

［35］Gutiérrez J, Larsen R, Cintas LM, et al. High-level heterologous production and functional expression of the sec-dependent enterocin P from Enterococcus faecium P13 in Lactococcus lactis［J］. Appl Microbiol Biotechnol, 2006, 72（1）：41-51.

［36］Martín M, Gutiérrez J, Criado R, et al. Cloning, production and expression of the bacteriocin enterocin A produced by Enterococcus faecium PLBC21 in Lactococcus lactis［J］. Appl Microbiol Biotechnol, 2007, 76（3）：667-675.

［37］Jiménez JJ, Borrero J, Diep DB, et al. Cloning, production, and functional expression of the bacteriocin sakacin A（SakA）and two SakA-derived chimeras in lactic acid bacteria（LAB）and the yeasts Pichia pastoris and Kluyveromyces lactis［J］. J Ind Microbiol Biotechnol, 2013, 40（9）：977-993.

［38］Zhou XX, Li WF, Ma GX, et al. The nisin-controlled gene expression system ：construction, application and improvements［J］.Biotechnol Adv, 2006, 24（3）：285-295.

［39］Sun C, Chen XZ, Huan LD, et al. Fusion expression of a peptide antibiotic-apidaecin gene in Lactococcus lactis［J］. Chin J Biotechnol, 2001, 17（1）：20-23.

［40］Horn N, Fernandez A, Dodd HM, et al. Nisin-controlled production of pediocin PA-1 and colicin V in nisin- and non-nisin-producing Lactococcus lactis strains［J］. Appl Environ Microbiol, 2004, 70（8）：5030-5032.

［41］Renye Jr JA, Somkuti GA, Garabal JI, et al. Heterologous production of pediocin for the control of Listeria monocytogenes in dairy foods［J］. Food Control, 2011, 22（12）：1887-1892.

［42］Axelsson L, Lindstad G, Naterstad K. Development of an inducible gene expression system for Lactobacillus sakei［J］. Lett Appl Microbiol, 2003, 37（2）：115-120.

［43］Hickey RM, Twomey DP, Ross RP, et al. Potential of the enterocin regulatory system to control expression of heterologous genes in Enterococcus［J］. J Appl Microbiol, 2003, 95（2）：390-397.

［44］Mathiesen G, S?rvig E, Blatny J, et al. High-level gene expression in Lactobacillus plantarum using a pheromone-regulated bacteriocin promoter［J］. Lett Appl Microbiol, 2004, 39（2）：137-143.

［45］S?rvig E, Gronqvist S, Naterstad K, et al. Construction of vectors for inducible gene expression in Lactobacillus sakei and L.plantarum［J］. FEMS Microbiol Lett, 2003, 229（1）：119-126.

［46］Driessen AJM, Nouwen N. Protein translocation across the bacterial cytoplasmic membrane［J］. Annu Rev Biochem, 2008, 77：643-667.

［47］Natale P, Brüsser T, Driessen J. Sec- and Tat-mediated protein secretion across the bacterial cytoplasmic membrane：distinct translocases and mechanisms［J］. Biophys Acta, 2008, 1778（9）：1735-1756.

［48］van Asseldonk M, de Vos WM, Simons G. Functional analysis of the Lactococcus lactis usp45 secretion signal in the secretion of a homologous proteinase and a heterologous alpha amylase［J］. Mol Gen Genet, 1993, 240（3）：428-434.

［49］Le Loir Y, Nouaille S, Commissaire J, et al. Signal peptide and propeptide optimization for heterologous protein secretion in Lactococcus lactis［J］.Appl Environ Microbiol, 2001, 67（9）：4119-4127.

［50］Nouaille S, Ribeiro LA, Miyoshi A, et al. Heterologous protein production and delivery systems for Lactococcus lactis［J］. Genet Mol Res, 2003, 2（1）：102-111.

［51］Borrero J, Jiménez JJ, Gútiez L, et al. Protein expression vector and secretion signal peptide optimization to drive the production,secretion, and functional expression of the bacteriocin enterocin A in lactic acid bacteria［J］. J Biotechnol, 2011, 156（1）：76-86.［52］周緒霞. Apidaecin 功能基團及其作用靶位點的分析及其在乳酸乳球菌中的分泌表達［D］. 杭州：浙江大學, 2008.

［53］李樸, 文陽安, 劉靳波, 等. 抗菌肽Bactenecin7重組質(zhì)粒構(gòu)建及其在乳酸菌的分泌表達和活性鑒定［J］.中國生物工程雜志,2009, 29（1）：70-74.

［54］O'Keeffe T, Hill C, Ross RP. Characterization and heterologous expression of the genes encoding enterocin A production, immunity,and regulation in Enterococcus faecium DPC1146［J］. Appl Environ Microb, 1999, 65：1506-1515.

［55］Martínez, JM, Kok J, Sanders JW, et al. Heterologous co-production of enterocin A and pediocin PA-1 by Lactococcus lactis：detection by specific peptide-directed antibodies［J］. Appl Environ Microb,2000, 66：3543-3549.

［56］Kuipers OP, Beerthuyzen MM, de Ruyter PG, et al. Autoregulation of nisin biosynthesis in Lactococcus lactis by signal transduction［J］. J Biol Chem, 1995, 270：27299-27304.

［57］Fink J, Merrifield RB, Boman A, et al. The chemical synthesis of cecropin D and an analog with enhanced antibacterial activity［J］.J Biol Chem, 1989, 264：6260-6267.

［58］李麗, 譙仕彥, 祝發(fā)明, 等. 蜜蜂抗菌肽Abaecin在枯草桿菌中的分泌表達［J］. 畜牧獸醫(yī)學報, 2009, 40（11）：1681-1685.

［59］Brede DA, Faye T, Stierli MP, et al. Heterologous production of antimicrobial peptides in Propionibacterium freudenreichii［J］.Appl Environ Microb, 2005, 71：8077-8084.