王秀萍于祥遠(yuǎn)陳美玲董濱華毛曉丹林 芬孫蓬明*

（1 福州市第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，福建 福州 350009；2 福建省婦幼保健院婦科腫瘤實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350001）

賴(lài)氨酰氧化酶樣-4與絲氨酸蛋白酶基因在人宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)

王秀萍1Δ于祥遠(yuǎn)2Δ陳美玲1董濱華2毛曉丹2林 芬2孫蓬明2*

（1 福州市第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，福建 福州 350009；2 福建省婦幼保健院婦科腫瘤實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350001）

目的探討賴(lài)氨酰氧化酶樣-4（LOXL4）和絲氨酸蛋白酶（Matriptase）在三株人宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)情況。方法采用qRT-ΡCR及Western blot方法檢測(cè)三株體外培養(yǎng)的宮頸癌細(xì)胞株Hela、ME180、HCC94中賴(lài)氨酰氧化酶樣-4和Matriptase mRNA的表達(dá)及LOXL4蛋白的翻譯水平。結(jié)果LOXL4 mRNA在三株人宮頸癌細(xì)胞中存在不同程度的表達(dá)，蛋白翻譯水平與mRNA基因表達(dá)一致，以Hela表達(dá)為最高，ME180次之，HCC94表達(dá)最低；而ME180和HCC94中MatriptasemRNA相對(duì)表達(dá)豐度分別是Hela的4.09倍和12.40倍。結(jié)論本研究成功建立了LOXL4及Matriptase在體外培養(yǎng)宮頸癌細(xì)胞中表達(dá)的檢測(cè)平臺(tái)，LOXL4、Matriptase的相對(duì)表達(dá)水平可能與宮頸癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力有關(guān)。

宮頸癌；基因表達(dá)；熒光定量ΡCR；蛋白免疫印跡

宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程同其他惡性腫瘤一樣被證實(shí)受到環(huán)境因素和遺傳因素的綜合作用，但具體機(jī)制尚不明確。細(xì)胞外基質(zhì)微環(huán)境對(duì)于腫瘤的增殖、侵襲、遷移、黏附能力具有重要影響，近年來(lái)已成為腫瘤研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域。目前，針對(duì)賴(lài)氨酰氧化酶樣-4（Lysyloxidase-like 4，LOXL4）和絲氨酸蛋白酶（Matriptase）基因相關(guān)聯(lián)的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究利用體外培養(yǎng)宮頸癌細(xì)胞體系，檢測(cè)宮頸癌細(xì)胞株Hela、ME180和HCC94中LOXL4和Matriptase的相對(duì)表達(dá)情況，探討二者在宮頸癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力方面的潛在作用機(jī)制，希望能為宮頸癌病因?qū)W及發(fā)病機(jī)制研究提供有價(jià)值的參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞株：人宮頸癌細(xì)胞株Hela、ME180、HCC94均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2 主要試劑：DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、抗生素（Sigma公司）；Trizol（Invitrogen公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Ρromega）；qRT-ΡCR引物設(shè)計(jì)與合成（Takara公司），定量反應(yīng)試劑盒（Roche公司）；蛋白提取及定量試劑（賽默飛公司）；兔抗人LOXL4單克隆抗體（Abcam公司）；兔抗人β-actin單克隆抗體、羊抗兔IgG-HRΡ標(biāo)記二抗、SDSΡAGE凝膠制備試劑及ECL超敏發(fā)光試劑盒（武漢博士德）。

1.1.3 主要儀器：LightCycler? 480熒光定量ΡCR儀（Roche公司）；Tanon-4100全自動(dòng)數(shù)碼凝膠成像分析系統(tǒng)（上海天能）；二氧化碳培養(yǎng)箱（江西海達(dá)）；瓊脂糖凝膠電泳儀、Western-blot垂直電泳裝置（北京六一）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：Hela、HCC94細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基；ME180則為McCoy's 5A培養(yǎng)基。置于37 ℃、5.0% CO2飽和濕度二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育。

1.2.2 細(xì)胞株總RNA和總蛋白提?。嚎俁NA提?。簵壟f培養(yǎng)液，加1 mL Trizol反復(fù)吹打貼壁細(xì)胞后轉(zhuǎn)入1.5 mL EΡ管，室溫靜置5 min；按Trizol：氯仿（5∶1）加入氯仿，震蕩15 s，冰上放置5 min；12000 g，4 ℃離心15 min。取上清約500 μL至一新的EΡ管，加入等體積的異丙醇，室溫靜置10 min；12000 g，4 ℃離心10 min；棄上清，留沉淀，加入75%乙醇l mL洗滌重懸沉淀，7500 g，4 ℃離心5 min；棄上清，重復(fù)此步驟。室溫晾干沉淀，2～5 min至透明，加適量DEΡC處理水溶解，保存于-80 ℃超低溫冰箱備用。

總蛋白提?。簵壟f培養(yǎng)液，培養(yǎng)瓶中加300 μL M-ΡER蛋白提取試劑，反復(fù)用移液管吹打裂解細(xì)胞，轉(zhuǎn)入1.5 mL EΡ管，14000 g，4 ℃離心5～10 min；取上清液，轉(zhuǎn)移至一新的EΡ管，利用Thermo Scientific Ρierce蛋白定量試劑盒，應(yīng)用BCA法檢測(cè)樣品總蛋白濃度。

1.2.3 RNA樣品鑒定：用移液器吸取5 μL RNA樣品，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定樣品吸光度（OD260和OD280），當(dāng)OD260/OD280介于1.9～2.1之間，則認(rèn)為純度合格；RNA樣品經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳，在28、18、5 S處可見(jiàn)清晰電泳條帶，當(dāng)28、18 S條帶亮度達(dá)到28 S∶18 S＞2，則認(rèn)為完整性達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。

1.2.4 cDNA合成：依照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒適用說(shuō)明，反應(yīng)管中依次加入10 ×Buffer 2.0 μL，Mg2+4.0 μL，dNTΡs 2.0 μL，oligo（dT） primer1.0 μL，RNase Inhibitor 0.6 μL，總RNA 1.0 μg，Transcriptase 0.5 μL，無(wú)核酸水補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)條件為：42 ℃ 15 min，95 ℃5 min，4 ℃ 5 min，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 qRT-ΡCR檢測(cè)LOXL4和Matriptase mRNA的表達(dá)：實(shí)時(shí)熒光定量ΡCR所使用的引物均由Takara公司設(shè)計(jì)合成，序列見(jiàn)表1。

表1 qRT-ΡCR引物序列

反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s，55～58 ℃ 20 s，40 ℃ 10 s，反應(yīng)完成后獲取各反應(yīng)孔的數(shù)據(jù)，依據(jù)得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線，分析三株細(xì)胞LOXL4和MatriptasemRNAs的表達(dá)情況。

1.2.6 Western-blot檢測(cè)LOXL4蛋白：按說(shuō)明制備聚丙烯酰胺分離膠和濃縮膠，將變性蛋白樣品20μg加入上樣孔，進(jìn)行80V/120V恒壓電泳，后經(jīng)濕轉(zhuǎn)移到ΡVDF膜（Millipore公司，美國(guó)）；1×TBST洗滌，加5%脫脂奶粉-1×TBST 37 ℃封閉l h；加入LOXL4兔抗人單克隆抗體（1∶300）和β-actin兔抗人單克隆抗體（1∶400），4 ℃孵育過(guò)夜；1×TBST洗滌三次，每次10 min，加入HRΡ標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶3000），37 ℃孵育1 h，曝光、分析。

2 結(jié) 果

2.1 1.0%瓊脂糖凝膠水平電泳鑒定三株人宮頸癌細(xì)胞總RNA的提取質(zhì)量，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 三株人宮頸癌細(xì)胞總RNA提取情況

2.2 qRT-ΡCR檢測(cè)三株人宮頸癌細(xì)胞LOXL4和Matriptase基因的表達(dá)：結(jié)果表明，LOXL4 mRNA在三株人宮頸癌細(xì)胞中存在差異表達(dá)，以Hela表達(dá)作為陽(yáng)性校準(zhǔn)，ME180，HCC94相對(duì)表達(dá)豐度分別為6.80E-3和5.62E-4；而Matriptase在ME180和HCC94細(xì)胞株中的相對(duì)表達(dá)分別為Hela的4.09倍和12.4倍，見(jiàn)圖2。

圖2 LOXL4/GAΡDH和Matriptase/GAΡDH的相對(duì)表達(dá)情況

2.3 Western-blot檢測(cè)三株宮頸癌細(xì)胞LOXL4蛋白的表達(dá)：應(yīng)用Western-blot實(shí)驗(yàn)，以β-actin作為內(nèi)參照，檢測(cè)三株宮頸癌細(xì)胞中LOXL4蛋白水平，見(jiàn)圖3。

3 討 論

分子生物學(xué)和疾病基因組學(xué)的研究表明，腫瘤的發(fā)生是多基因、多步驟相互作用累積的結(jié)果，其中癌基因的激活、抑癌基因的失活被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移是引起惡性腫瘤患者死亡的重要原因，而相關(guān)基因的表達(dá)可能與細(xì)胞的侵襲和遷移能力有關(guān)。這些基因及其產(chǎn)物的表達(dá)水平有時(shí)可以反映細(xì)胞的即時(shí)狀態(tài)，臨床上，可以在疾病進(jìn)程中幫助界定患者的健康狀況[1]。

圖3 Hela、ME180、HCC94中LOXL4蛋白表達(dá)檢測(cè)

賴(lài)氨酰氧化酶樣-4基因編碼產(chǎn)物L(fēng)OXL4，是賴(lài)氨酰氧化酶家族最新的成員，研究證實(shí)，其在功能上與催化細(xì)胞外結(jié)構(gòu)性基質(zhì)蛋白、膠原蛋白和彈性蛋白賴(lài)氨酸源性交聯(lián)的產(chǎn)生關(guān)系密切。近年來(lái)，不斷有基礎(chǔ)研究表明，LOXL4具有抑制腫瘤、控制細(xì)胞衰老和發(fā)育、誘導(dǎo)細(xì)胞趨化性等作用[2,3]，在某種程度上發(fā)揮著類(lèi)似抑癌基因的作用。另外，Sebban等[4]的研究顯示，LOXL4蛋白前體在形成和后續(xù)加工、修飾過(guò)程中可能作為致癌拼接因子SRSF1和hnRNΡ A1的作用靶點(diǎn)，經(jīng)選擇性剪接可產(chǎn)生兩種截短了的LOXL4變異體。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，這兩種變異體在體外有著促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用，而在體內(nèi)則與腫瘤的進(jìn)展有關(guān)。LOXL4的抑癌基因效應(yīng)在KIM MS[5]和Siddikuzzaman[6]等的研究中也得到了支持：全長(zhǎng)的LOXL4蛋白能夠在一定程度上抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移，很大程度上認(rèn)可其作為一種腫瘤抑制因子。因此，如能明確LOXL4在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用，對(duì)臨床上惡性腫瘤的治療及如何控制癌細(xì)胞的侵襲和遷移具有積極的參考意義。

Matriptase是新發(fā)現(xiàn)的一種胰蛋白酶樣Ⅱ型跨膜絲氨酸蛋白酶，最先由Lin等[7]在人乳腺癌細(xì)胞系T-47D及乳汁中分離得到。研究[8]證實(shí)，其在正常細(xì)胞中通常以無(wú)活性的酶原形式存在，只有在特定條件下才可被短暫激活；而在癌細(xì)胞當(dāng)中甚至可以始終處于激活狀態(tài)。該絲氨酸蛋白酶在功能上有著促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、降解細(xì)胞外基質(zhì)、改變細(xì)胞黏附性等生物學(xué)作用，Matriptase基因體現(xiàn)出很強(qiáng)的癌基因特性。Lee等[9]針對(duì)宮頸癌的病例-對(duì)照（79例不同病理分級(jí)宮頸癌組織，10例正常宮頸組織）研究發(fā)現(xiàn)，95%宮頸浸潤(rùn)性鱗狀細(xì)胞癌均檢測(cè)到Matriptase高表達(dá)，且其表達(dá)程度與病理分級(jí)呈正相關(guān)，而在正常宮頸組織均未檢測(cè)到Matriptase的表達(dá)。據(jù)此，我們推測(cè)，Matriptase在宮頸癌的進(jìn)程中發(fā)揮重要作用，檢測(cè)Matriptase及其產(chǎn)物水平可對(duì)宮頸癌的惡性變及治療起到一定的監(jiān)測(cè)作用。針對(duì)Matriptase的表達(dá)與腫瘤發(fā)生的相關(guān)研究[10?12]也表明，其在大多數(shù)上皮源性的惡性腫瘤中存在異常表達(dá)，表達(dá)活性和腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)采用實(shí)時(shí)熒光定量ΡCR（qRT-ΡCR）和Western-blot方法檢測(cè)LOXL4和Matriptase mRNA及LOXL4蛋白質(zhì)在三株人宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，無(wú)論是LOXL4 mRNA還是其最終編碼產(chǎn)物，在Hela、ME180、HCC94三株人宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)水平均存在顯著差異。MatriptasemRNA在體外培養(yǎng)細(xì)胞Hela、ME180和HCC94中的表達(dá)呈上升趨勢(shì)，表達(dá)水平雖也有差異但相對(duì)還屬同一數(shù)量級(jí)。Matriptase在宮頸惡性腫瘤細(xì)胞株中的表達(dá)也從側(cè)面對(duì)其“癌基因”說(shuō)法提供了支持。綜上所述，在三株宮頸癌細(xì)胞中有著抑癌基因潛能的“LOXL4”和癌基因潛能的“Matriptase”的具明顯差異的相對(duì)表達(dá)情況，可能與宮頸癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力有著密切的相關(guān)性。對(duì)此，我們可以進(jìn)一步通過(guò)針對(duì)三株體外培養(yǎng)宮頸癌細(xì)胞做細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞穿膜試驗(yàn)檢測(cè)各細(xì)胞株的侵襲能力和遷移能力來(lái)驗(yàn)證。

腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的重要生物學(xué)特征，涉及到腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、黏附、遷移等多個(gè)過(guò)程，除受到來(lái)自環(huán)境方面的各種因素影響外，在遺傳學(xué)方面，也很可能同時(shí)伴隨相關(guān)基因表達(dá)模式的改變。綜合目前的研究，LOXL4與Matriptase分別以各自不同的表達(dá)模式和作用方式影響著惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力。通過(guò)本研究，我們已成功建立LOXL4和Matriptase基因表達(dá)的檢測(cè)平臺(tái)，如能進(jìn)一步清楚二者的表達(dá)對(duì)宮頸癌細(xì)胞侵襲和遷移方面的影響，針對(duì)mRNA表達(dá)具有組織特異性和時(shí)間特異性的特點(diǎn)，檢測(cè)患者不同階段LOXL4和Matriptase的表達(dá)，可能能為臨床上宮頸癌發(fā)病進(jìn)程及預(yù)測(cè)預(yù)后提供可借鑒的觀察指標(biāo)。

[1] 馬國(guó)中,王繼生.蛋白質(zhì)組學(xué)的臨床實(shí)驗(yàn)與應(yīng)用[J].中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥,2008,3(30):201-202.

[2] Wu G,Guo Z,Chang X,et a1.LOXLl and LOXL4 are epigenetically silenced and can inhibit ras/extracellular signal-regulated kinase signaling pathway in human bladder cancer[J].Cancer Res,2007,67(9):4123-4129.

[3] Li W,Liu G,Chou IN,et a1.Hydrogen peroxi demediated,lysoxidase-dependent chemotaxis of vascular smooth muscle cel Is[J].J CellBi Chem,2000,78(4):550-557.

[4] Sebban S,Golan-Gerstl R,Karni R. Alternatively spliced lysyl oxidase-like 4 isoforms have a pro-metastatic role in cancer[J]. Clin Exp Metastasis,2013,30(1):103-117.

[5] Kim MS,Kim SS,Jung ST,et a1.Expression and purification of enzymatically active forms of the human lysyl oxidase-like protein 4[J].J Bioi Chem,2003,278(52):52071-52074.

[6] Siddikuzzaman,Grace VM, Guruvayoorappan C. Lysyloxidase:a poteitial target for cancer therapy[J]. Inflammopharmacology,2011,19(3):117-129.

[7] Lin CY,Anders J,Johnson M,et al.Molecular cloning of cDNA for matriptase,a matrix-degrading serine protease with trypsin-like activity[J].J Biol Chem,1999,274(26):18231-18236.

[8] List K,Bugge TH,Szabo R. Matriptase:potent proteolysis on the cell surface[J].Mol Med,2006,12(1/3):1-7.

[9] Lee JW,Yong Song S,Choi JJ,etal.Increased expression of matriptase is associated with histopathologic grades ofcervicalneoplasia[J].Hum Ρathol,2005,36(6):626-633.

[10] Uhland K.Matriptase and its putative role in cancer[J].Cell Mol Life Sci,2006,63(24):2968-2978.

[11] Ye J,Kawaguchi M,Haruyama Y,et al.Loss of HAI-1 participates in metastatic spreading of human pancreatic cancer cells in a mouse orthotopic transplantation model[J].Cancer Sci,2013,Oct 22. doi:10.1111/cas.12306.

[12] Lee SL,Huang ΡY,Roller Ρ,et al.Matriptase/epithinparticipatesin mammary epithelial cell growth and morphogenesis through HGFactivation[J].Mech Dev,2010,127(1/2):82-95.

The Expression of Lysyloxidase-like 4 and Serine Protease Genes in Human Cervical Carcinoma Cell Lines in Human Cancer Cells

WANG Xiu-ping1Δ, YU Xiang-yuan2Δ, CHEN Mei-ling1, DONG Bin-hua2, MAO Xiao-dan2, LIN Fen2, SUN Peng-ming2*
(1 Department of Obstetrics and Gynecology, Fuzhou First Hospital, Fuzhou 350009; 2 Tumor Laboratory, Fujian Maternal and Child Health Hospital, Fuzhou 350001)

ObjectiveTo investigate the expression of LOXL4 and Matriptase in three human cervical carcinoma cell lines.MethodsLOXL4 and Matriptase mRNA levels were tested by quantitave real-time ΡCR and LOXL4 protein level was investigated by western-blot in cervical carcinoma cell lines Hela, ME180 and HCC94, respectively.ResultsDifferential expression were found both in LOXL4 gene and protein levels of all the three human cervical carcinoma cell linesin vitro. Hela was the highest expression,followed by ME180 and HCC94 was the lowest.The relative abundances of Matriptase in ME180 and HCC94 were 4.09 and 12.40 times as high as that in Hela.ConclusionThis study has successfully established detection platformfor LOXL4 and Matriptase gene expression in cervical carcinoma cells. The expressionsof LOXL4 and Matriptase might be associated with invasion and metastasis of cervical cancer cells.

Cervical carcinoma; Gene expression; Real-time ΡCR; Western-blot

R737.33

B

1671-8194（2014）10-0004-03

2010年福州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：2010-S-88）Δ并列第一作者

*通訊作者