童文君， 張 禮， 薛慶云， 侯北偉， 丁小余

(南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 江蘇 南京 210023)

在植物的健康組織或器官內(nèi)存在大量微生物，在不引起植物病變的同時(shí)這些微生物能與植物建立良好的相互合作關(guān)系，Petrini將這種在其生活史中某個(gè)階段或全部階段不會(huì)引起植物組織或器官明顯變化的細(xì)菌稱為植物內(nèi)生細(xì)菌(endophyte bacteria)[1]。蘭科(Orchidaceae)植物與內(nèi)生細(xì)菌存在著復(fù)雜的微生態(tài)關(guān)系，細(xì)菌可通過(guò)氣孔、皮孔及傷口等開(kāi)放性結(jié)構(gòu)進(jìn)入植物組織，然后在植物組織間隙或細(xì)胞間質(zhì)形成具有生態(tài)功能的群落，同時(shí)植物組織也可保護(hù)內(nèi)生細(xì)菌免受紫外線或干燥等其他有害環(huán)境的傷害，從而保障內(nèi)生細(xì)菌生存[2]。至今，已從90多種蘭科植物中分離出大量?jī)?nèi)生細(xì)菌，這些內(nèi)生細(xì)菌對(duì)蘭科植物具有重要的生物學(xué)功能，如解磷、解鉀、分泌IAA、促進(jìn)植物生長(zhǎng)及抗植物病原菌等[3]。

石斛屬(DendrobiumSw.)為蘭科第2大屬， 包括 1 400多個(gè)種，主要分布于亞洲熱帶和亞熱帶地區(qū)、太平洋島嶼以及大洋洲[4]。目前中國(guó)已記載石斛屬植物81種2變種，其中18種為中國(guó)特有種[5]。近年來(lái)有關(guān)石斛屬內(nèi)生細(xì)菌的研究已有報(bào)道，表明有些內(nèi)生細(xì)菌菌株能直接促進(jìn)石斛屬植物的生長(zhǎng)。俞婕等[6]從鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)中分離到1株內(nèi)生細(xì)菌SH1，將其發(fā)酵原液接種于鐵皮石斛組培苗的基部，其組培苗的生長(zhǎng)速率明顯提高；Tsavkelova 等[7]從杓唇石斛〔Dendrobiummoschatum(Buch.-Ham.) Sw.〕氣生根內(nèi)分離出大量可進(jìn)行光合作用且為宿主提供氮素營(yíng)養(yǎng)的內(nèi)生細(xì)菌。因而，研究石斛內(nèi)生細(xì)菌可為石斛生長(zhǎng)和產(chǎn)量的提高等提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

美花石斛(DendrobiumloddigesiiRolfe)又名環(huán)草石斛、小環(huán)草和小黃草等，主要分布在廣西、廣東、貴州和云南等地，具有滋陰清熱、生津益胃、潤(rùn)肺止咳等功效[8]。近年來(lái)，隨著市場(chǎng)需求的增加價(jià)格上漲，美花石斛被大量采挖，其野生資源遭到極大破壞。由于美花石斛在自然狀態(tài)下生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、繁殖系數(shù)低，所以近年來(lái)主要采用組織培養(yǎng)技術(shù)實(shí)現(xiàn)其大量繁殖，但其組培苗移栽成活率低以及生長(zhǎng)緩慢仍是阻礙美花石斛產(chǎn)業(yè)化的主要問(wèn)題。朱國(guó)勝等[9]的研究結(jié)果表明：美花石斛生長(zhǎng)緩慢主要是因?yàn)槿狈采婢５嘘P(guān)美花石斛內(nèi)生細(xì)菌與其生長(zhǎng)的關(guān)系鮮見(jiàn)研究。

作者以采自廣西、云南和廣東的美花石斛為研究對(duì)象，對(duì)其根、莖和葉中的可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行分離，剔除重復(fù)菌株并通過(guò)16SrDNA序列測(cè)定和比對(duì)鑒定分離出的菌株，同時(shí)利用擴(kuò)增核糖體DNA限制性酶切分析(amplified ribosomal DNA restriction analysis， ARDRA)方法對(duì)內(nèi)生細(xì)菌菌株的多樣性進(jìn)行分析[10-11]，并測(cè)定所有分離菌株的促生相關(guān)特性(包括解磷、解鉀和產(chǎn)生長(zhǎng)素IAA能力)；在此基礎(chǔ)上，以既能解磷、解鉀又能產(chǎn)生長(zhǎng)素的菌株作為促生實(shí)驗(yàn)菌株，研究這些菌株對(duì)美花石斛試管苗的促生效應(yīng)。以期為尋找與美花石斛生長(zhǎng)相關(guān)的內(nèi)生細(xì)菌、改善其人工生長(zhǎng)環(huán)境提供平臺(tái)，并為美花石斛人工培育產(chǎn)業(yè)研發(fā)奠定理論和應(yīng)用基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 植物采集及組培 供試的野生美花石斛植株于2011年至2012年采自廣西、云南和廣東，樣株編號(hào)分別為GX20120601—GX20120603、YN20111201—YN20111203和GD20111101—GD20111105，合計(jì)11株，均由南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院丁小余教授鑒定，活體植株保存于南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物資源與環(huán)境研究所。美花石斛試管苗由本課題組培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度21 ℃～25 ℃、光照度1 500 lx、光照時(shí)間12 h·d-1、空氣相對(duì)濕度60%～80%。

1.1.2 美花石斛內(nèi)生細(xì)菌的分離、保存和活化 從11株美花石斛的根、莖和葉上分別取質(zhì)量相等的樣品，共33份；稱取質(zhì)量后用體積分?jǐn)?shù)2.5% NaClO溶液浸泡10 min，并用無(wú)菌水淋洗3次(取最后1次淋洗液0.1 mL均勻涂于NA培養(yǎng)基[12]上，若48 h后無(wú)菌落出現(xiàn)則可確認(rèn)表面消毒干凈)；將表面消毒后的植物樣品置于滅菌研缽中，加入相當(dāng)于樣品質(zhì)量9倍的滅菌水并研磨，分別取0.1 mL研磨液涂于NA培養(yǎng)基上，置于28 ℃恒溫箱培養(yǎng)1～3 d，待菌落長(zhǎng)出后根據(jù)菌落的形態(tài)進(jìn)行純化；常溫下用水保存，同時(shí)用體積分?jǐn)?shù)40%甘油保存于-80 ℃條件下。每份樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

所有菌株均用NA培養(yǎng)基活化。挑取常溫下用水保存或-80 ℃下用體積分?jǐn)?shù)40%甘油保存的菌株，劃線分離培養(yǎng)，于28 ℃培養(yǎng)48 h；挑取單菌落至NA培養(yǎng)液中，于28 ℃、250 r·min-1培養(yǎng)24 h，備用。

1.2 方法

1.2.1 解磷能力測(cè)試 吸取待測(cè)菌液10 μL，分別滴到有機(jī)磷培養(yǎng)基(OPA)和無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基(NPA)[13]平板上，于28 ℃培養(yǎng)48 h；觀察NPA及OPA平板上透明菌圈的有無(wú)并測(cè)量菌圈半徑(cm)，每一菌株重復(fù)檢測(cè)3次。

1.2.2 解鉀能力測(cè)試 參照文獻(xiàn)[14]的方法配制含有鉀長(zhǎng)石的培養(yǎng)基，吸取待測(cè)菌液10 μL，滴至鉀長(zhǎng)石培養(yǎng)基平板上，于28 ℃培養(yǎng)72 h；觀察平板上有無(wú)形成透明光滑油滴，并統(tǒng)計(jì)能形成透明光滑油滴的菌株數(shù)量，每一菌株重復(fù)檢測(cè)3次。

1.2.3 產(chǎn)生長(zhǎng)素能力測(cè)試 用含200 mg·L-1L-色氨酸的NA液體培養(yǎng)基，于28 ℃、180 r·min-1條件下培養(yǎng)菌液48 h；取1 mL菌懸液滴于白色瓷板上，并加1 mL Salkowski比色液[15]，對(duì)照組僅滴加1 mL比色液；將白色瓷板置于室溫條件下避光放置30 min后觀察其顏色變化，并記錄顏色變化強(qiáng)度，每一菌株重復(fù)檢測(cè)3次。

1.2.4 ARDRA分析 采用CTAB法[16]提取內(nèi)生細(xì)菌DNA，利用細(xì)菌通用引物8f和1492r對(duì)內(nèi)生細(xì)菌的16SrRNA片段進(jìn)行擴(kuò)增[17]；用AluI和MspI(MBI Fermentas，Vilnius，Lithuania)2種限制性內(nèi)切酶對(duì)16SrRNA擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行聯(lián)合酶切；取酶切后的樣品進(jìn)行電泳，并在UVP凝膠成像系統(tǒng)上進(jìn)行觀察[18]。

利用GelCompar Ⅱ軟件分析酶切產(chǎn)物圖譜?；赑earson相關(guān)指數(shù)的相似性系數(shù)、采用UPGMA法(unweighted pair-group method using arithmetic averages)繪制聚類樹(shù)狀圖，具體參數(shù)如下：optimization(0.66%)； position tolerance(1.3%)； chance towards end of fingerprint(0%)；minimum height(0%)；minimum surface(0%)；uncertain bands(ignore)。以70.0%相似度為基準(zhǔn)對(duì)菌株進(jìn)行聚類分析；從菌株活化到酶切，對(duì)5個(gè)菌株進(jìn)行重復(fù)，5個(gè)菌株相似度均大于70.0%則聚在一簇。

選取各ARDRA簇的代表菌株進(jìn)行16SrDNA測(cè)序，并在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)，獲得各菌株的分類鑒定結(jié)果。

1.2.5 試管苗促生潛力觀察 將既能解磷、解鉀又能產(chǎn)生長(zhǎng)素的菌株接種到200 mL NA液體培養(yǎng)基中，于28 ℃、250 r·min-1條件下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，至菌液的OD600值約為1×108CFU·mL-1，用無(wú)菌NA培養(yǎng)液稀釋100倍備用。

取300株試管苗， 按照 3～4 cm、2～3 cm和1～2 cm株高分為3組，其中，株高3 cm試管苗分至第2組，株高2 cm試管苗分至第3組，每組100株。分別吸取1 mL稀釋菌液(1×106CFU·mL-1)添加至試管苗根部，對(duì)照組僅添加1 mL NA培養(yǎng)液；每組5個(gè)重復(fù)。將試管苗置于溫度(25±2) ℃、光照度1 500 lx、光照時(shí)間12 h·d-1、空氣相對(duì)濕度60%～80%的條件下培養(yǎng)，每隔10 d觀察1次，連續(xù)觀察2個(gè)月，分別記錄培養(yǎng)瓶中試管苗的株高和根長(zhǎng)變化。

2 結(jié)果和分析

2.1 不同產(chǎn)地美花石斛內(nèi)生細(xì)菌分布特征

分離結(jié)果顯示：從來(lái)源于廣西、云南及廣東3個(gè)產(chǎn)地的美花石斛根、莖和葉中分別分離獲得內(nèi)生細(xì)菌菌株42、11及14株，共計(jì)67株內(nèi)生細(xì)菌菌株。從分離部位看，分離自莖的菌株占總菌株數(shù)的51%(34株)，數(shù)量最多；分離自根的菌株占31%(21株)；分離自葉的菌株僅占18%(12株)，數(shù)量最少。

2.2 美花石斛內(nèi)生細(xì)菌促生特性分析

2.2.1 解磷能力分析 測(cè)定結(jié)果顯示：在分離獲得的67株美花石斛內(nèi)生細(xì)菌菌株中，有54株菌株能夠在OPA培養(yǎng)基(有機(jī)磷培養(yǎng)基)上產(chǎn)生明顯的透明菌圈，且菌圈半徑為0.3～1.6 cm。按產(chǎn)地劃分，其中有40株菌株分離自來(lái)源于廣西的植株，占74%；有9株菌株分離自來(lái)源于云南的植株，占16%；有5株菌株分離自來(lái)源于廣東的植株，占10%。按分離部位劃分，其中有50%(27株)的菌株分離自莖，30%(16株)的菌株分離自根，20%(11株)的菌株分離自葉。

可在NPA培養(yǎng)基(無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基)上產(chǎn)生明顯透明菌圈的有30株菌株。按產(chǎn)地劃分，其中90%(27株)分離自來(lái)源于廣西的植株，3%(1株)分離自來(lái)源于云南的植株，7%(2株)分離自來(lái)源于廣東的植株；按照分離部位劃分，其中47%(14株)分離自莖，30%(9株)分離自根，23%(7株)分離自葉。此外，所有能解無(wú)機(jī)磷的菌株均表現(xiàn)出解有機(jī)磷的特性。

2.2.2 解鉀能力分析 測(cè)定結(jié)果顯示：在分離獲得的67株美花石斛內(nèi)生細(xì)菌菌株中，有22株菌株能形成透明的光滑油滴狀菌落，說(shuō)明這些菌株具有解鉀能力。按產(chǎn)地劃分，其中68%(15株)分離自來(lái)源于廣西的植株，22%(5株)分離自來(lái)源于云南的植株，10%(2株)分離自來(lái)源于廣東的植株；按照分離部位劃分，其中64%(14株)分離自莖，36%(8株)分離自根，而分離自葉的菌株均無(wú)解鉀能力。

2.2.3 產(chǎn)生長(zhǎng)素能力分析 測(cè)定結(jié)果顯示：在分離獲得的67株內(nèi)生細(xì)菌菌株中，有24株菌株可使Salkowski比色液變紅，說(shuō)明這些菌株具有產(chǎn)生長(zhǎng)素能力。按照產(chǎn)地劃分，其中75%(18株)分離自來(lái)源于廣西的植株、17%(4株)分離自來(lái)源于云南的植株、8%(2株)分離自來(lái)源于廣東的植株；按照分離部位劃分，其中67%(16株)分離自莖，21%(5株)分離自根，12%(3株)分離自葉。

此外，在所有67株菌株中，有8株菌株同時(shí)兼具解無(wú)機(jī)磷、解有機(jī)磷、解鉀以及產(chǎn)生長(zhǎng)素的特性，并且這些菌株均分離自來(lái)源于廣西的植株莖部。

2.3 美花石斛內(nèi)生細(xì)菌多樣性分析

根據(jù)ARDRA分析結(jié)果，采用UPGMA法對(duì)67株內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見(jiàn)圖1。聚類分析結(jié)果顯示：67株內(nèi)生細(xì)菌共表現(xiàn)出50種不同的ARDRA譜型，根據(jù)70.0%的相似度劃分，67株菌株被分為31個(gè)ARDRA簇(圖1)。其中，僅包含1株菌株的ARDRA簇有18個(gè)， 而其他13個(gè)ARDRA簇則包含2株及2株以上的菌株。按照產(chǎn)地劃分，其中分離自廣西植株的42株菌株分屬于22個(gè)ARDRA簇，分離自云南植株的11株菌株分屬于5個(gè)ARDRA簇，分離自廣東植株的14株菌株分屬于7個(gè)ARDRA簇。最大的ARDRA簇(第12簇)包含3個(gè)產(chǎn)地的13株菌株，其中6株分離自莖；第二大簇(第3簇)包含分離自廣西植株根、莖和葉的9株菌株，其中5株菌株分離自根。

從31個(gè)ARDRA簇中分別選出1個(gè)代表性菌株，對(duì)其16SrDNA片段序列進(jìn)行測(cè)序，并與NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行比對(duì)，31個(gè)ARDRA簇代表性菌株的比對(duì)結(jié)果及促生特性見(jiàn)表1。結(jié)果顯示：分離獲得的67株內(nèi)生菌株屬于12個(gè)屬，分別是假單胞菌屬(Pseudomonas)、微桿菌屬(Microbacterium)、腸桿菌屬(Enterobacter)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)、副球菌屬(Paracoccus)、泛菌屬(Pantoea)、短波單胞菌屬(Brevundimonas)、涅斯捷連科氏菌屬(Nesterenkonia)和沙雷氏菌屬(Serratia)。其中，芽孢桿菌屬、微桿菌屬和腸桿菌屬為美花石斛內(nèi)生細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)屬。芽孢桿菌屬在3個(gè)產(chǎn)地植株的根、莖和葉中均有分布，腸桿菌屬僅在廣西植株的根、莖和葉中有分布，鞘氨醇單胞菌屬僅分布于廣西植株的根中，葡萄球菌屬僅分布于廣西植株的葉中，嗜冷桿菌屬僅分布于廣東植株的莖中，副球菌屬僅分布于廣東植株的根中，涅斯捷連科氏菌屬僅分布于云南植株的根和莖中。

2.4 美花石斛內(nèi)生細(xì)菌促生潛力分析

由表1可見(jiàn)：8株兼具3種促生特性的菌株分別隸屬于芽孢桿菌屬、腸桿菌屬和假單胞菌屬。因3個(gè)產(chǎn)地的植株中均分布有芽孢桿菌屬菌株，故將芽孢桿菌菌株DLB20作為促生實(shí)驗(yàn)菌株。觀察結(jié)果顯示：當(dāng)加入1×106CFU·mL-1DLB20后，菌落在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)緩慢，并逐漸與美花石斛試管苗形成穩(wěn)定的生長(zhǎng)環(huán)境。接種10 d后，株高不同的3個(gè)實(shí)驗(yàn)組的試管苗長(zhǎng)勢(shì)均正常，培養(yǎng)基表面有少許菌落產(chǎn)生。接種30 d后，第3實(shí)驗(yàn)組的試管苗根部細(xì)菌開(kāi)始繁殖，植株開(kāi)始萎蔫發(fā)黃；第1與第2實(shí)驗(yàn)組的試管苗生長(zhǎng)良好，長(zhǎng)勢(shì)沒(méi)有明顯差異。接種60 d后，第3實(shí)驗(yàn)組的植株死亡，第1與第2實(shí)驗(yàn)組的試管苗長(zhǎng)勢(shì)良好且株高無(wú)明顯區(qū)別，但第1實(shí)驗(yàn)組試管苗的生根狀況優(yōu)于第2實(shí)驗(yàn)組；3個(gè)對(duì)照組的試管苗均正常生長(zhǎng)，但第1和第2對(duì)照組的試管苗長(zhǎng)勢(shì)弱于實(shí)驗(yàn)組。3個(gè)實(shí)驗(yàn)組和3個(gè)對(duì)照組試管苗的生長(zhǎng)狀況對(duì)比見(jiàn)圖2。

圖1 美花石斛67株內(nèi)生細(xì)菌的ARDRA指紋圖譜及其聚類圖

表1 美花石斛內(nèi)生細(xì)菌31個(gè)ARDRA簇代表菌株的特征信息

3 討論和結(jié)論

自20世紀(jì)80年代末以來(lái)，蘭科植物的內(nèi)生細(xì)菌日益成為研究熱點(diǎn)。蘭科植物內(nèi)生細(xì)菌種類非常豐富，在根、莖和葉中均有分布[19]，其中根和莖是常見(jiàn)的分離部位。例如，章華偉等[20]從鐵皮石斛中分離出23株內(nèi)生細(xì)菌，其中莖中分布較多；Tsavkelova 等[21]的研究結(jié)果顯示：從杓唇石斛分離內(nèi)生細(xì)菌，根部是常見(jiàn)的分離部位。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：美花石斛莖中所含的內(nèi)生細(xì)菌最多，其次是根，也說(shuō)明蘭科植物的根和莖是常見(jiàn)的分離部位。Chen等[22]的研究結(jié)果表明：美花石斛內(nèi)生真菌隨產(chǎn)地差異表現(xiàn)出一定的特異性，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示美花石斛內(nèi)生細(xì)菌與其內(nèi)生真菌同樣具有地區(qū)特異性。

1-3. 實(shí)驗(yàn)組Experimental group: 1. 株高3～4 cm試管苗 Plantlets with height of 3-4 cm； 2. 株高2～3 cm試管苗 Plantlets with height of 2-3 cm; 3. 株高1～2 cm試管苗 Plantlets with height of 1-2 cm. C1-C3. 對(duì)照組Control group: C1. 株高3～4 cm試管苗 Plantlets with height of 3-4 cm； C2. 株高2～3 cm試管苗 Plantlets with height of 2-3 cm; C3. 株高1～2 cm試管苗 Plantlets with height of 1-2 cm.

蘭科植物內(nèi)生細(xì)菌優(yōu)勢(shì)屬是指宿主組織內(nèi)出現(xiàn)頻率較高的屬。Wilkinson等[23-25]認(rèn)為：假單胞菌屬是地生蘭的優(yōu)勢(shì)屬，其次是芽孢桿菌屬、庫(kù)特氏菌屬(Kurthia)和節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)。在有關(guān)的研究中芽孢桿菌也被證實(shí)為杓唇石斛[26]和流蘇石斛(DendrobiumfimbriatumHook.)[27]內(nèi)生細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)屬。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：美花石斛內(nèi)生細(xì)菌優(yōu)勢(shì)屬包括芽孢桿菌屬、微桿菌屬和腸桿菌屬，其中芽孢桿菌屬在來(lái)源于3個(gè)產(chǎn)地的植株內(nèi)均為優(yōu)勢(shì)屬，腸桿菌屬僅存在于來(lái)源于廣西的美花石斛植株中，且來(lái)源于廣西的植株中優(yōu)勢(shì)屬的種類和數(shù)量都比來(lái)源于云南和廣東的植株豐富，與來(lái)源于廣西的美花石斛樣品新鮮程度較佳有關(guān)。這一研究結(jié)果也證實(shí)了Wilkinson 等[24]關(guān)于“蘭科植物內(nèi)生細(xì)菌優(yōu)勢(shì)屬會(huì)隨地區(qū)、季節(jié)，尤其是基于菌根真菌侵染的組織形態(tài)學(xué)的不同而發(fā)生變化，且不同地區(qū)表現(xiàn)出差異性”的結(jié)論。

磷和鉀都是植物生長(zhǎng)必不可少的營(yíng)養(yǎng)元素，利用解磷和解鉀的內(nèi)生細(xì)菌轉(zhuǎn)化環(huán)境中的磷和鉀是改善植物生長(zhǎng)的首選方法之一[28]。生長(zhǎng)素IAA可以通過(guò)增加根的生長(zhǎng)促進(jìn)植物生長(zhǎng)和分化，還可促進(jìn)根毛增殖和延長(zhǎng)，有利于根從土壤中吸收更多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[29]。通常，促生實(shí)驗(yàn)依據(jù)內(nèi)生細(xì)菌菌株解磷、解鉀、產(chǎn)生長(zhǎng)素的能力來(lái)衡量其促生潛力，而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)具有促生潛力的美花石斛內(nèi)生細(xì)菌菌株可以促進(jìn)其試管苗的生長(zhǎng)。

細(xì)菌的濃度是影響促生效果的關(guān)鍵因子，低濃度(1×105CFU·mL-1)具有促生效果，而高濃度則可能對(duì)植物有不利影響[30]，這可能與“細(xì)菌濃度過(guò)高會(huì)破壞植物或部分組織，從而引起植物生長(zhǎng)不良甚至死亡”有關(guān)。基于以上原因，作者從能解磷、解鉀又能產(chǎn)IAA的8個(gè)美花石斛內(nèi)生細(xì)菌菌株中選擇用于促生實(shí)驗(yàn)的菌株，考慮到芽孢桿菌屬是美花石斛內(nèi)生細(xì)菌中分布最廣泛的優(yōu)勢(shì)屬，所以將芽孢桿菌DLB20菌株選為測(cè)試菌株。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：1×106CFU·mL-1DLB20可以促進(jìn)株高3～4 cm的美花石斛試管苗生長(zhǎng)及生根，但導(dǎo)致株高1～2 cm試管苗死亡，表明植物內(nèi)生細(xì)菌的促生效果與細(xì)菌的接種濃度和植株長(zhǎng)勢(shì)有關(guān)。Aspray等[31]認(rèn)為：細(xì)菌僅在一定濃度范圍內(nèi)具有促生作用，不同細(xì)菌的促生濃度范圍存在差異。因此，確定內(nèi)生細(xì)菌的適宜接種濃度對(duì)有效提高其促生效果有重要作用[32]。此外，F(xiàn)rey-Klett等[30]認(rèn)為：蘭科植物在不同的生長(zhǎng)階段可能與不同的菌株共生。因此，從成年植株根內(nèi)分離的菌株對(duì)蘭科植物不同生長(zhǎng)階段植株的促生作用有差異。

由于內(nèi)生細(xì)菌的數(shù)量及種類與植物的產(chǎn)地密切相關(guān)，因而，建議擴(kuò)大采樣數(shù)量和采樣地點(diǎn)對(duì)美花石斛內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行更為廣泛的分離和篩選。有關(guān)美花石斛內(nèi)生細(xì)菌種類還需要采用分子生物學(xué)手段和生理生化實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步鑒定。

參考文獻(xiàn):

[1] PETRINI O. Fungal endophytes of tree leaves[M]∥ANDREWS J H, HIRANO S S. Microbial Ecology of Leaves. New York: Springer-Verlag, 1991: 179-197.

[2] LODEWYCKX C, VANGRONSVELD J, PORTEOUS F, et al. En-dophytic bacteria and their potential applications[J]. Critical Reviews in Plant Sciences, 2002, 21(6): 583-606.

[3] 胡 萌. 植物內(nèi)生細(xì)菌研究進(jìn)展[J]. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 2008, 39(1): 148-151.

[4] LAVARACK P S, HARRIS W, STOCKER G.Dendrobiumand Its Relatives[M]. Portland: Timber Press, 2000.

[5] ZHU G H, JI Z H, WOOD J J, et al.Dendrobium[M]∥WU Z Y, RAVEN P H, HONG D Y. Flora of China: Vol.25. Beijing: Science Press, 2009: 367-397.

[6] 俞 婕, 趙凱鵬, 董 飛, 等. 野生鐵皮石斛內(nèi)生菌的分離及促生作用研究[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技, 2010(9): 96-97.

[7] TSAVKELOVA E A, LOBAKOVA E S, KOLOMEITSEVA G L, et al. Associative cyanobacteria isolated from the roots of epiphytic orchids[J]. Microbiology, 2003, 72(1): 92-97.

[8] 張光濃, 畢志明, 王崢濤, 等. 石斛屬植物化學(xué)成分研究進(jìn)展[J]. 中草藥, 2003, 34(6): 附5-附8.

[9] 朱國(guó)勝, 劉作易, 黃永會(huì), 等. 美花石斛組培苗促生內(nèi)生真菌分離及篩選[J]. 種子, 2007, 26(12): 17-20.

[10] FULTHORPE R R, RHODES A N, TIEDJE J M. High levels of endemicity of 3-chlorobenzoate-degrating soil bacteria[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1998, 64(5): 1620-1627.

[11] CHO J C, TIEDJE J M. Biogeography and degree of endemicity of fluorescentPseudomonasstrains in soil[J]. Applied and Environ-mental Microbiology, 2000, 66(12): 5448-5456.

[12] 沈 萍, 范秀容, 李廣武. 微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M]. 3版. 北京: 高等教育出版社, 1999: 214-215.

[13] ZHENG Y, XUE Q Y, XU L L, et al. A screening strategy of fungal biocontrol agents towardsVerticilliumwilt of cotton[J]. Biological Control, 2011, 56(3): 209-216.

[14] 楊 柳, 唐旺全, 蔣 艷, 等. 解鉀芽孢桿菌的分離·鑒定及其代謝產(chǎn)物分析[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2011, 39(28): 17265-17267.

[15] GLICKMANN E, DESSAUX Y. A critical examination of the speci-ficity of the Salkowski reagent for indolic compounds produced by phytopathogenic bacteria[J]. Applied and Environmental Micro-biology, 1995, 61(2): 793-796.

[16] DOYLE J J, DOYLE J L. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissues[J]. Phytochemical Bulletin, 1987, 19: 11-15.

[17] CHELIUS M K, TRIPLETT E W. The diversity of archaea and bacteria in association with the roots ofZeamaysL.[J]. Microbial Ecology, 2001, 41(3): 252-263.

[18] 張曉霞, 馬曉彤, 曹衛(wèi)東, 等. 紫云英根瘤菌的系統(tǒng)發(fā)育多樣性[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào), 2010, 16(3): 380-384.

[19] 張 萍, 宋希強(qiáng). 蘭科植物內(nèi)生細(xì)菌物種多樣性及其促生機(jī)理研究進(jìn)展[J]. 熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào), 2012, 20(1): 92-98.

[20] 章華偉, 鐘超群. 鐵皮石斛內(nèi)生細(xì)菌的分離和初步鑒定[J]. 湖南農(nóng)業(yè)科學(xué), 2013, 52(8): 1811-1813.

[21] TSAVKELOVA E A, CHERDYNTSEVA T A, BOTINA S G, et al. Bacteria associated with orchid roots and microbial production of auxin[J]. Microbiological Research, 2007, 162(1): 69-76.

[22] CHEN X M, DONG H L, HU K X, et al. Diversity and anti-microbial and plant-growth-promoting activities of endophytic fungi inDendrobiumloddigesiiRolfe[J]. Journal of Plant Growth Regulation, 2010, 29(3): 328-337.

[23] WILKINSON K G, DIXON K W, SIVASITHAMPARAM K. Inter-action of soil bacteria, mycorrhizal fungi and orchid seed in relation to germination of Australian orchids[J]. New Phytologist, 1989, 112(3): 429-435.

[24] WILKINSON K G, DIXON K W, SIVASITHAMPARAM K, et al. Effect of IAA on symbiotic germination of an Australian orchid and its production by orchid-associated bacteria[J]. Plant and Soil, 1994, 159(2): 291-295.

[25] WILKINSON K G, DIXON K W, BRADLEY J K, et al. Identi-fication and characterization of bacteria associated with western Australian orchids[J]. Soil Biology and Biochemistry, 1994, 26(1): 137-142.

[26] TSAVKELOVA E A, CHERDYNTSEVA T A, NETRUSOV A I. Bacteria associated with the roots of epiphytic orchids[J]. Microbiology, 2004, 73(6): 710-715.

[27] TSAVKELOVA E A, CHERDYNTSEVA T A, KLIMOVA S Y, et al. Orchid-associated bacteria produce indole-3-acetic acid, promote seed germination, and increase their microbial yield in response to exogenous auxin[J]. Archives of Microbiology, 2007, 188(6): 655-664.

[28] ADESEMOYE A O, KLOEPPER J W. Plant-microbes interactions in enhanced fertilizer-use efficiency[J]. Applied Microbiology Biotechnology, 2009, 85(1): 1-12.

[30] FREY-KLETT P, CHURIN J L, PIERRAT J C, et al. Dose effect in the dual inoculation of an ectomycorrhizal fungus and a mycorrhiza helper bacterium in two forest nurseries[J]. Soil Biology and Biochemistry, 1999, 31(11): 1555-1562.

[31] ASPRAY T J, JONES E E, WHIPPS J M, et al. Importance of mycorrhization helper bacteria cell density and metabolite localization for thePinussylvestris-Lactariusrufussymbiosis[J]. FEMS Microbiology Ecology, 2006, 56(1): 25-33.

[32] LIU P, NESTER E W. Indoleacetic acid, a product of transferred DNA, inhibitsvirgene expression and growth ofAgrobacteriumtumefaciensC58[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2006, 103(12): 4658-4662.