國(guó)果 吳沁怡 吳建偉 趙學(xué)軍 付萍 張勇

（貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院 寄生蟲學(xué)教研室，貴陽(yáng) 550004）

家蠅泛素結(jié)合酶基因的生物信息學(xué)分析

國(guó)果 吳沁怡 吳建偉 趙學(xué)軍 付萍 張勇

（貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院 寄生蟲學(xué)教研室，貴陽(yáng) 550004）

利用EST測(cè)序技術(shù)從家蠅幼蟲cDNA文庫(kù)中獲得家蠅泛素結(jié)合酶基因（MD-E2）cDNA序列，采用NCBI、ExPASY中的相關(guān)工具，對(duì)該基因及其編碼蛋白的基本理化性質(zhì)、疏水性、信號(hào)肽、二級(jí)結(jié)構(gòu)和亞細(xì)胞定位等方面進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析，MEGA軟件構(gòu)建了進(jìn)化樹。結(jié)果表明，家蠅泛素結(jié)合酶基因的cDNA序列具有完整的ORF框，全長(zhǎng)480 bp，一共編碼159個(gè)氨基酸。其編碼的蛋白質(zhì)理論分子量為18.117 9 kD，等電點(diǎn)8.64，無信號(hào)肽及跨膜區(qū)，屬于親水性蛋白，具有泛素結(jié)合酶家族的活性位點(diǎn)（FHPNVYPSGTVCLSLL），主要分布于細(xì)胞核；二級(jí)結(jié)構(gòu)以無規(guī)則卷曲為主，β折疊較少。

家蠅 泛素結(jié)合酶 生物信息學(xué)

泛素-蛋白酶途徑（Ubiquitin-proteasome pathway，UPP）廣泛存在于真核系統(tǒng)中，此途徑在細(xì)胞基本進(jìn)程如DNA修復(fù)，細(xì)胞周期調(diào)控，機(jī)體抵御環(huán)境脅迫等一系列通路中發(fā)揮著重要作用［1］。在一般蛋白質(zhì)降解的泛素化途徑中，共需要泛素活化酶（UBE1）、泛素結(jié)合酶（UBE2）和泛素底物連接酶（UBE3）3種酶的參與［2］，泛素結(jié)合酶（UBE2）在選擇性降解靶蛋白中起決定性作用。不同的細(xì)胞內(nèi)有多種UBE2基因，目前發(fā)現(xiàn)酵母有13種，擬南芥中有17種，而人類至少有30種。但對(duì)于昆蟲UBE2研究報(bào)道較少，目前尚未見家蠅體內(nèi)UBE2的相關(guān)研究報(bào)道。有學(xué)者研究顯示，當(dāng)機(jī)體受到病原體如細(xì)菌和病毒攻擊時(shí)，UBE2的表達(dá)水平明顯上升［3-6］。本課題組通過構(gòu)建家蠅幼蟲熱脅迫的cDNA全長(zhǎng)文庫(kù)并進(jìn)行EST測(cè)序，從中篩選得到了UBE2的表達(dá)序列標(biāo)簽，并測(cè)定了其全長(zhǎng)序列。本研究對(duì)家蠅UBE2基因的cDNA序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)與功能的信息學(xué)分析，以期為進(jìn)一步揭示該基因在家蠅免疫防御體系中的功能，挖掘新型的家蠅抗菌功能基因等提供一定的理論及試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

熱誘導(dǎo)的家蠅三齡幼蟲cDNA質(zhì)粒文庫(kù)由北京華大合作構(gòu)建（具體誘導(dǎo)條件及文庫(kù)構(gòu)建方法見課題組前期論文報(bào)道［7］。

隨機(jī)挑選500個(gè)克隆測(cè)序得到多個(gè)EST，Wublastx 方法歸并EST獲得Unigene。對(duì)這些Unigene進(jìn)行BLAST后，從中篩選獲得編碼家蠅UBE2的基因，文庫(kù)質(zhì)粒編碼為004E02b。

1.2 方法

1.2.1 家蠅泛素結(jié)合酶基因的識(shí)別與同源性比較 通過NCBI網(wǎng)站的BLASTx程序，將編號(hào)為004E02b文庫(kù)質(zhì)粒的插入序列與GenBank 中的序列進(jìn)行比對(duì)，判斷該序列是否為全長(zhǎng)編碼序列，尋找該序列的同源蛋白序列，將家蠅泛素結(jié)合酶基因命名為MD-E2。

1.2.2 MD-E2理化性質(zhì)分析 用DNASTAR5.0 軟件分析cDNA序列和開放閱讀框；利用瑞士生物信息學(xué)研究所的蛋白分析專家系統(tǒng)（Expert Protein Analysis System，ExPASy）提供的生物信息學(xué)工具Protparam，分析預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的氨基酸殘基性質(zhì)、分子量及理論等電點(diǎn)、摩爾消光系數(shù)、重組產(chǎn)物在細(xì)菌、酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的半衰期、在溶液中的穩(wěn)定性等；ProtScale 分析蛋白質(zhì)的疏水性質(zhì)。采用Signal P分析信號(hào)肽序列。

1.2.3 結(jié)構(gòu)及功能預(yù)測(cè) 利用Interpro 和PREDICTPROTEIN 在線分析軟件預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)中包含的結(jié)構(gòu)域和氨基酸功能位點(diǎn)；利用PSORT Ⅱ在線分析網(wǎng)站分析蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的定位。利用PHD sec 在線服務(wù)器和SWISS MODEL在線預(yù)測(cè)網(wǎng)站預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.2.4 系統(tǒng)發(fā)育樹 從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)下載9個(gè)物種的泛素結(jié)合酶基因編碼蛋白序列，包括果蠅、按蚊、金小蜂、擬谷盜屬、水蚤擬穴青蟹、牛蛙、南美白對(duì)蝦和人類，利用MEGA4.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 MD-E2 基因的序列比對(duì)

NCBI對(duì)MD-E2進(jìn)行BLASTx分析，結(jié)果（圖1）發(fā)現(xiàn)MD-E2基因與黑腹果蠅（Drosophila ananassae）、埃及伊蚊（Aedes aegypti）、大紅斑蝶（Danaus plexippus）泛素結(jié)合酶基因的相似性分別為99%、97%和94%，從比對(duì)的高同源性判斷該基因是家蠅的泛素結(jié)合酶基因，也表明泛素結(jié)合酶極度保守。ORF全長(zhǎng)480 bp，編碼159個(gè)氨基酸。

2.2 理化性質(zhì)預(yù)測(cè)

利用ProtParam工具預(yù)測(cè)表明MD -E2編碼蛋白的相對(duì)分子量為18.12 kD，理論等電點(diǎn)（pI 值）8.64，含酸性氨基酸（DE）12.58%，堿性氨基酸（KR）14.47%，親水性氨基酸（AILFWV）、極性氨基酸（NCQSTY）和帶電氨基酸（RKHYCDE）的比例分別為32.7%、20.75%和34.6%?？梢?，該蛋白在酵母和大腸埃希菌中表達(dá)的半衰期分別大于20 h和10 h，在溶液中的不穩(wěn)定指數(shù)略高于40，為41.02，提示穩(wěn)定性稍弱。

2.3 信號(hào)肽預(yù)測(cè)和分析

分泌蛋白及細(xì)胞膜蛋白都以前體物質(zhì)多肽的形式合成，其N末端含有作為通過膜時(shí)指導(dǎo)蛋白質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)移的氨基酸序列即為信號(hào)肽。利用在線網(wǎng)站Signal IP 3.0 Server 分析此蛋白，結(jié)果顯示MD-E2基因編碼的蛋白沒有信號(hào)肽，屬于非分泌型蛋白。

2.4 亞細(xì)胞定位

MD-E2基因編碼蛋白的亞細(xì)胞定位分析結(jié)果顯示，其分布在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、線粒體、細(xì)胞骨架、和分泌型囊泡的可能性分別為56.5%、17.4%、13%、4.3%和8.7%。推斷MD-E2蛋白可能主要在細(xì)胞核中發(fā)揮生物學(xué)作用。

2.5 結(jié)構(gòu)域分析

ScanProsite 分析顯示，該氨基酸序列含有完整的泛素結(jié)合酶家族的特征性活性位點(diǎn)FHPNVYPSGTVCLSLL（82-97aa）。Inter ProScan 分析顯示其具有泛素結(jié)合酶家族的氨基酸保守結(jié)構(gòu)域（圖2）。MotifScan（模序）分析顯示，MD-E2含有1個(gè)酰胺化位點(diǎn)，1個(gè)蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)；2個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)；1個(gè)N-肉豆蔻酰化位點(diǎn)，1個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)；1個(gè)泛素結(jié)合酶活性位點(diǎn)，2個(gè)泛素結(jié)合酶家族的特征性位點(diǎn)。推測(cè)MD-E2蛋白功能的發(fā)揮可能與激酶磷酸化有關(guān)。

2.6 疏水性和親水性的預(yù)測(cè)與分析

利用Protprotscale在線預(yù)測(cè)MD-E2氨基酸序列的親疏水性，根據(jù)氨基酸分值越低親水性越強(qiáng)和分值越高疏水性越強(qiáng)的規(guī)律可知，MD-E2基因編碼的蛋白多肽鏈第15位具有最低的分值-2.933（最強(qiáng)的親水性），第116為具有最高的分值1.867（最強(qiáng)的疏水性）（圖3）。總體而言，除了局部的疏水區(qū)域，大部分區(qū)域?yàn)橛H水性，因而整個(gè)多肽鏈表現(xiàn)為親水性。該結(jié)果與ProtParam分析結(jié)果一致。

2.7 二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

MD-E2蛋白沒有跨膜區(qū)，Sec預(yù)測(cè)組成MD-E2多肽鏈二級(jí)結(jié)構(gòu)的3種類型，α螺旋（H）、β折疊（E）和無規(guī)則卷曲（L）的比例是33.33∶16.35∶50.31，以無規(guī)則卷曲為主，β折疊較少。利用Swiss-Modeling對(duì)MD-E2的氨基酸序列進(jìn)行蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的同源建模（圖4），可見結(jié)構(gòu)中含有較多的α螺旋和無規(guī)則卷曲，與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果基本吻合。

2.8 系統(tǒng)發(fā)育樹

MD-E2基因編碼蛋白與其他物種泛素結(jié)合酶基因編碼蛋白具有較高的同源性，均在90%以上。用MP法構(gòu)建10個(gè)物種的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明，家蠅、果蠅和岡比亞按蚊的距離最近，雙翅目昆蟲與甲殼綱昆蟲進(jìn)化起源于共同祖先。

3 討論

20個(gè)世紀(jì)80年代以來，泛素及泛素-蛋白酶體通路一直是生物學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。作為胞內(nèi)重要的蛋白質(zhì)降解體系，泛素系統(tǒng)在免疫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮著重要作用［8］。研究表明，泛素蛋白是調(diào)節(jié)昆蟲適應(yīng)外界環(huán)境的過程中的重要蛋白之一［9］，在果蠅體內(nèi)，泛素-蛋白酶體途徑通過降解免疫缺失的Reli蛋白而促進(jìn)了果蠅體內(nèi)抗菌肽基因的激活和表達(dá)［10］。研究者把鰻弧菌（Vibrioan guillarum）注入到貝殼的肌肉內(nèi)發(fā)現(xiàn)，泛素結(jié)合酶的表達(dá)量有所增加，而Boname 和Lehner［11］也證實(shí)了當(dāng)病毒侵入機(jī)體時(shí)，泛素結(jié)合酶基因的表達(dá)明顯上調(diào)。對(duì)植物體內(nèi)泛素體系的研究結(jié)果亦表明，泛素結(jié)合酶在植物抗脅迫反應(yīng)中具有重要的作用，如在熱激和重金屬誘導(dǎo)條件下，番茄中的泛素結(jié)合酶表達(dá)增強(qiáng)［12］，疣粒野生稻中泛素結(jié)合酶基因在受百葉枯病病原菌脅迫120 h內(nèi)隨著時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)逐漸增強(qiáng)［13］，因此我們推測(cè)，家蠅泛素結(jié)合酶可能也參與了家蠅抗病反應(yīng)的過程，也是家蠅強(qiáng)大的免疫防御系統(tǒng)中重要的活性分子之一。

本研究對(duì)MD-E2的分析表明，該蛋白主要定位于細(xì)胞核，概率為56.5%，蛋白上具有多個(gè)磷酸化位點(diǎn)，是一個(gè)功能活躍的蛋白質(zhì)。同源性比較分析結(jié)果顯示，其堿基序列與已經(jīng)報(bào)道的其他9物種的形似性較高，均為90%以上，提示泛素結(jié)合酶是一種高度保守的蛋白。本研究采用生物信息學(xué)方法分析了MD-E2的理化特性和結(jié)構(gòu)，不僅豐富了泛素結(jié)合酶蛋白家族基因信息，同時(shí)為進(jìn)一步研究在外界刺激誘導(dǎo)下，家蠅泛素結(jié)合酶的功能與抗病特性之間的關(guān)系，進(jìn)一步開發(fā)家蠅體內(nèi)豐富的抗菌物質(zhì)奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

家蠅MD-E2基因含有完整的開放閱讀框（480 bp），編碼159個(gè)氨基酸。編碼的蛋白質(zhì)理論分子量為18.1 179 kD，等電點(diǎn)8.64，無信號(hào)肽及跨膜區(qū)，屬于親水性蛋白，具有泛素結(jié)合酶家族的活性位點(diǎn)，主要分布于細(xì)胞核；二級(jí)結(jié)構(gòu)以無規(guī)則卷曲為主，β折疊較少。

［1］ Pickart CM. Back to the future with ubiquitin review［J］. Cell, 2004, 116（2）：181-191.

［2］ Dikic I, Robertson M. Ubiquitin ligases and beyond［J］. BMC Biol, 2012（10）：22.

［3］ Nú?ez-Acu?a G, Aguilar-Espinoza A, Chávez-Mardones J, et al. Ubiquitin-conjugating enzyme E2-like gene associated to pathogen response in Concholepas concholepas：SNP identification and transcription expression［J］. Fish & Shellfish Immunology, 2012, 33（4）：1065-1068.

［4］ Haas TL, Emmerich CH, Gerlach B, et al. Recruitment of the linear ubiquitin chain assembly complex stabilizes the TNF-R1 signaling complex and is required for TNF-mediated gene induction［J］. Mol Cell, 2009, 36（5）：831-844.

［5］ Li YP, Lecker SH, Chen Y, et al. TNF-alpha increases ubiquitinconjugating activity in skeletal muscle by up-regulating UbcH2/ E220k［J］. Federation of American Societies for Experimental Biology Journal, 2003, 17（9）：1048 -1057.

［6］ Nagy V, Dikic I. Ubiquitin ligase complexes：from substrate selectivity to conjugational specificity［J］. Biol Chem, 2010, 391（2-3）：163.

［7］ 劉紅美, 張潔. 熱脅迫后家蠅幼蟲cDNA文庫(kù)構(gòu)建與隨機(jī)EST測(cè)序分析［J］. 免疫學(xué)雜志, 2010, 26（9）：772-775.

［8］ 金偉軍, 姚祥春, 呂美巧, 等. 泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)、作用和調(diào)控機(jī)制［J］. 科技通報(bào), 2008, 24（1）：29-34.

［9］ 金豐良, 許小霞, 張文慶, 等.家蠅泛素編碼區(qū)cDNA序列的克隆及在原核細(xì)胞中的表達(dá)［J］.昆蟲學(xué)報(bào), 2008, 51（5）：473-479.

［10］ Khush RS, Cornwell WD, Uram JN, et al. A ubiquitin proteasome pathway represses the Drosophilaimmune deficient signaling cascade［J］. Curr Biol, 2002, 12（20）：1728-17371.

［11］ Boname JM, Lehner PJ. What has the study of the K3 and K5 viral ubiquitin E3 ligases taught us about ubiquitin-mediated receptor regulation?［J］. Viruses, 2011, 3：118-131.

［12］ Lau OS, Deng XW. Effect of Arabidopsis COP10 ubiquitin E2 enhancement activity across E2 fa milies and functional conservation among its canonical homologs［J］. Biochem J, 2009, 418：683-690.

［13］ 蔣春苗, 黃興奇, 付堅(jiān), 等. 疣粒野生稻泛素結(jié)合酶基因的全長(zhǎng)cDNA 序列克隆與分析［J］. 作物學(xué)報(bào), 2012, 38（5）：808- 813.

（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Bioinformatics Analysis of the Gene and Protein of Ubiquitinconjugated Enzyme from Musca domestic

Guo Guo Wu Qinyi Wu Jianwei Zhao Xuejun Fu Ping Zhang Yong
（Department of Parasitology，Guiyan Medical College，Guiyang 550004）

A cDNA sequence of Musca domestic ubiquitin-conjugated enzyme（MD-E2）was obtained by in EST technology. Some characters of the MD-E2 gene and encoded protein sequence were predicted and analyzed by bioinformatics methods in the following aspects, such as general physical and chemical properties, hydrophobicity, signal peptide, secondary structure and localization sites in cells. Results showed that the MD-E2 contains a complete ORF（480bp）encoding 159 amino acid with a predicted molecular weight about 18.117 9 kD and pI 8.64. The protein encoded by MD-E2 gene has no signal peptide, and no transmembrane domains, and it is a hydrophilic protein which is mainly located in cell nucleus. The secondary structures are mainly composed of random coil.

Musca domestic Ubiquitin-conjugated enzyme Bioinformatics

2013-07-19

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81160204），貴州省科技廳基金［黔科合（2010）3160］，高校博士點(diǎn)學(xué)科專項(xiàng)科研基金（20105215120001）

國(guó)果，女，博士，副教授，研究方向：昆蟲分子免疫學(xué)；E-mail：guoguojsc@163.com