張國(guó)華馬小軍，2呂偉麗

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730037；2. 甘肅省草食動(dòng)物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730070）

合作豬SLA-DQA基因第4外顯子多態(tài)性分析

張國(guó)華1馬小軍1，2呂偉麗1

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730037；2. 甘肅省草食動(dòng)物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730070）

合作豬的MHC-DQA基因的適應(yīng)性變異，其抗原識(shí)別區(qū)域（即外顯子4）通過(guò)PCR擴(kuò)增和隨后的單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）和序列分析，結(jié)果顯示在439個(gè)合作豬個(gè)體，SLA-DQA第4外顯子檢出4個(gè)等位基因和6個(gè)基因型（AA、BB、DD、AB、AC和AD），其中A等位基因和AA基因型的頻率最高，為優(yōu)勢(shì)基因和優(yōu)勢(shì)基因型。對(duì)不同型的PCR-SSCP條帶測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)7個(gè)突變位點(diǎn)（5 068 bp T→C，5 109 bp和5 149 bp處缺失C，5 131 bp A→G導(dǎo)致絲氨酸變?yōu)楦拾彼幔? 135 bp C→T，5 234 bp G→A，5 136 bp 處插入A）。遺傳學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，合作豬多態(tài)信息含量（PIC）為0.240 1，屬于低度多態(tài)，各種基因型的分布不顯著。研究結(jié)果證實(shí)，合作豬SLA—DQA基因第4外顯子為低度多態(tài)。

合作豬 SLA-DQA基因 多態(tài)性 遺傳特性。

主要組織相容性復(fù)合體（Major histocompatibility complex，MHC）是脊椎動(dòng)物的一個(gè)與免疫應(yīng)答和抗病性密切相關(guān)的高度多態(tài)基因家族，其表達(dá)產(chǎn)物分布于各種細(xì)胞表面，即MHC分子［1］。這種遺傳變異改變了肽的編碼蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，使它們能夠結(jié)合多種外來(lái)多肽［2］。許多研究支持了這一假設(shè)，即MHC基因的等位基因多樣性是由寄生蟲(chóng)介導(dǎo)的平衡選擇［3-7］。豬的MHC稱(chēng)為SLA（豬白細(xì)胞抗原），位于豬的7號(hào)染色體上［8］，與豬的抗病力有密切的關(guān)系。MHC分為Ш類(lèi)基因，Ⅱ類(lèi)基因是其中之一，編碼糖蛋白在細(xì)胞表面［5］，在該基因區(qū)域中，分為兩個(gè)次區(qū)域，即DQ、DR，具有高度的多態(tài)性和連鎖不平衡［9］。目前，對(duì)DQA的研究集中于第二外顯子，且發(fā)現(xiàn)其多態(tài)性可以增加仔豬斷奶前后的重量和體質(zhì)［10］；彭勇波［11］等研究發(fā)現(xiàn)，第4外顯子與豬膘厚度、內(nèi)脂率、眼肌高度、肌肉失水率存在明顯的關(guān)系。高度表達(dá)的SLA-DQA基因的第4外顯子是該基因中功能最重要的區(qū)域，其多態(tài)性較豐富［1，2］。但是，這些研究均未涉及中國(guó)甘肅省甘南州特有的地方豬種—合作豬（亦名蕨麻豬或山豬，是甘肅省甘南藏族自治州特有的地方小型豬種。該品種生長(zhǎng)在海拔3 000米、氣溫最低-28.5℃的高寒潮濕半農(nóng)半牧區(qū)。具有放牧性能強(qiáng)、抗逆性好，不懼暴曬和風(fēng)雪、體型小、生長(zhǎng)較慢、繁殖率低等特點(diǎn)）。有關(guān)中國(guó)合作豬SLA-DQA基因的研究，國(guó)內(nèi)外鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)采用PCR-SSCP和克隆測(cè)序的方法對(duì)439頭合作豬的SLA-DQA第4外顯子的遺傳多態(tài)性檢測(cè)與分析，為進(jìn)一步研究合作豬MHC的抗病、易感性提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

在甘南州合作市屠宰場(chǎng)采集合作豬血液樣品192份和耳組織樣品91份，在夏河屠宰場(chǎng)采集合作豬血液樣品156份，用冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室，置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 采用常規(guī)的酚/氯仿提取法，從血樣中提取DNA并溶解于TE緩沖液，在1%瓊脂糖凝膠，200 V電泳檢測(cè)后，放于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增 采用Primer5.0引物設(shè)計(jì)軟件，根據(jù)GenBank發(fā)表的蘇太豬SLA-DQA基因核苷酸全序列（AY303988）設(shè)計(jì)第4外顯子的核苷酸序列引物（上游引物：5'-CTCACCCCATCCCACTTA-3'，下游引物5'-AATCCTTACCTTCCCTTC-3'），擴(kuò)增目的片段約為251 bp，引物由大連寶生物有限公司合成。

PCR擴(kuò)增采用20 μL的體系，各成分用量：上下游引物各0.4 μL，模板DNA 0.8 μL，滅菌dd H2O 6.4 μL，DNA-TAQ預(yù)混酶12 μL。

PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ 1 min，變性95℃30 s，退火56℃ 30 s，延伸72℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)，最后延伸72℃ 10 min。4℃保存，PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.3 PCR產(chǎn)物的SSCP檢測(cè) 取2.5 μL PCR產(chǎn)物，7.5 μL變性劑（98%去離子甲酰胺、0.03%二甲苯青、0.025%溴酚藍(lán)、0.5 mol/L混合而成），經(jīng)105℃變性5 min，然后放置于冰上10 min，在12%非變性聚丙烯酰胺凝膠（acr∶bis=37.5∶1），4℃、200 V，電泳24 h，結(jié)束后銀染法顯色。

1.2.4 SLA-DQA外顯子4測(cè)序 SSCP分析之后，選取不同基因型個(gè)體PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至北京六合華大基因科技股份有限公司測(cè)序。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS17.0計(jì)算各個(gè)基因型的頻率、等位基因頻率；用POPGNE計(jì)算純合度（Ho）、雜合度（He）和有效等位基因數(shù)（Ne）；用PIC軟件計(jì)算多態(tài)信息含量（PIC）；用DNAMAN進(jìn)行核苷酸序列及氨基酸序列比對(duì)。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

對(duì)采集的439頭合作豬DQA的外顯子4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)（圖1），目的條帶清晰，無(wú)雜帶，片段大小為251 bp，包含完整的第4外顯子和部分的第3、4內(nèi)含子。

2.2 PCR-SSCP檢測(cè)結(jié)果

對(duì)擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行SSCP分析，在439頭個(gè)體中，檢測(cè)到4種等位基因：A-D，形成了AA、BB、DD、AB、AD、AC基因型（圖2）。

2.3 合作豬SLA-DQA基因不同等位基因的序列比對(duì)

合作豬DQA基因第4外顯子引物擴(kuò)增區(qū)域內(nèi)發(fā)現(xiàn)的等位基因序列測(cè)定后，以蘇太豬的DQA基因（GenBank No：AY303988）序列為參考基因，比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)的4個(gè)等位基因（圖3）。

2.4 SLA-DQA基因多態(tài)性分析

遺傳雜合度（He）、有效等位基因數(shù)（Ne）、多態(tài)信息含量（PIC）是評(píng)價(jià)群體遺傳變異的重要指標(biāo)。合作豬DQA基因第4外顯子的遺傳多態(tài)性如表1所示，PIC為0.240 1，為低度多態(tài)。

2.5 合作豬SLA-DQA基因第4外顯子基因型和等位基因分布及差異顯著性檢驗(yàn)

合作豬SLA-DQA基因第4外顯子基因頻率和基因型頻率分布見(jiàn)表2。檢測(cè)到6個(gè)基因型（AA、BB、CC、AB、AC和BC），其中，等位基因A的頻率最高，為優(yōu)勢(shì)基因，基因型AA頻率最高，為優(yōu)勢(shì)基因型。

χ2檢驗(yàn)表明，SLA-DQA第4外顯子在該品種中的χ2高于顯著水平（P＜0.05），偏離了Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P＜0.05）。

3 討論

MHCⅡ類(lèi)基因的主要功能是抗原遞呈和參與免疫調(diào)控（體液免疫的主要調(diào)控方式），也決定了家畜適應(yīng)外界的能力。家畜所處的環(huán)境（地理環(huán)境和氣候環(huán)境）是有很大差別的，為了更好地適應(yīng)所處的環(huán)境，免疫系統(tǒng)表現(xiàn)出了豐富的多態(tài)，所以MHC的功能區(qū)的編碼基因也相應(yīng)的表現(xiàn)出豐富的遺傳多態(tài)性。普遍研究認(rèn)為，哺乳動(dòng)物的MHC遺傳多態(tài)性是長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中等位基因積累和融合所致［11］，多態(tài)性產(chǎn)生的主要機(jī)制是核苷酸的替換［12］。豬MHCDQA等位基因的多態(tài)性表現(xiàn)在點(diǎn)突變的基因序列差異之上［13］?？拙ЬУ龋?4］在大白豬，長(zhǎng)白豬和杜洛克豬DQA基因第4外顯子分別檢測(cè)出3種、4種和4種基因型，且編碼區(qū)發(fā)現(xiàn)3個(gè)核酸突變位點(diǎn)：A→G，A→T，G→A；朱璟［15］在蘇太豬DQA第4外顯子檢測(cè)出3種基因型；吳圣龍［16］在蘇太豬DQA第4外顯子檢測(cè)出了2種基因型，二者均在編碼區(qū)發(fā)現(xiàn)1個(gè)A→G的突變。本研究在合作豬DQA基因第4外顯子區(qū)發(fā)現(xiàn)了6種基因型共7處突變，并且，在5 234 bp處檢測(cè)到的突變與孔晶晶在大白豬、長(zhǎng)白豬和杜洛克豬以及朱璟在蘇太豬中檢測(cè)到的一致。另外，檢測(cè)到合作豬SLA-DQA第4外顯子的6處基因突變，與中國(guó)本地的蘇太豬、滇南小耳豬和云南野豬［17］（特點(diǎn)是生長(zhǎng)速度快，瘦肉率和繁殖率高等），外引品種豬［14］大白豬、長(zhǎng)白豬、杜洛克豬（特點(diǎn)是體型較大、生長(zhǎng)較快和繁殖力強(qiáng)等）在此基因的多態(tài)性分布上有顯著的差異，這可能與合作豬常年生活在高原惡劣環(huán)境下所具有的生長(zhǎng)緩慢、繁殖率低及適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)有關(guān)。豬品種之間生長(zhǎng)的環(huán)境、氣候條件的差異，使其對(duì)外來(lái)病原體的抵抗能力的不同，導(dǎo)致遺傳多態(tài)性的差異［18］。研究結(jié)果已證實(shí)在動(dòng)物抗病育種中MHC基因是一組候選基因，而 MHC Ⅱ類(lèi)基因不同基因型的豬對(duì)疾病的抵抗能力有一定的差異［19］，通過(guò)合作豬DQA 基因第4 外顯子PCR-SSCP 分析發(fā)現(xiàn)了6 個(gè)不同的基因型，充分表明合作豬群體蘊(yùn)藏著更加豐富的遺傳多態(tài)性，是寶貴的遺傳資源。

基因外顯子的功能區(qū)中的SNPs，即功能SNPs，是導(dǎo)致氨基酸改變的nsSNPs對(duì)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性產(chǎn)生顯著影響的區(qū)域［20］。本研究的氨基酸變化位于編碼的跨膜區(qū)和胞質(zhì)區(qū)，即5 131 bp A→G導(dǎo)致絲氨酸變?yōu)楦拾彼?，這種突變都可能影響SLA-DQA基因的功能。

群體遺傳學(xué)分析表明，合作豬SLA-DQA基因第4外顯子的基因型頻率偏離了Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)，表明該區(qū)域可能受到自然選擇的影響，造成了基因型分布的不平衡，使A成為該品種的優(yōu)勢(shì)基因，AA為優(yōu)勢(shì)基因型。多態(tài)信息含量（PIC）和雜合度（He）是群體內(nèi)遺傳變異的測(cè)度［21］。對(duì)某個(gè)群體來(lái)說(shuō)，PIC和He的數(shù)值越大，說(shuō)明該群體內(nèi)基因的一致性越差，基因的變異性也就越大；反之，其數(shù)值越小，基因變異性也就越小，該群體選擇的潛力也就越?。?4］。本研究發(fā)現(xiàn)，合作豬PIC＜0.25，為低度多態(tài)。這可能是對(duì)高原豬種而言，受所處的特殊環(huán)境的影響，使基因純合，進(jìn)而造成遺傳多態(tài)性之間的差異。

4 結(jié)論

本研究中合作豬SLA-DQA基因第4外顯子多態(tài)性不太豐富，屬于低度多態(tài)。

［1］ Bernatchez L, Landry C. MHC studies in nonmodel vertebrates： what have we learned about natural selection in 15 years［J］. J Evol Biol, 2003, 16：363-377.

［2］ Janeway CA, Travers P, Walport M, et al. Immunobiology：the immune system in health and disease［M］. 4th edition. London：Current Biology Publication, 1999.

［3］ Apanius V, Penn DJ, Slev PR, et al. The nature of selection on the major histocompatibility complex［J］. Crit Rev Immunol, 1997, 17：179-224.

［4］ Edwards SV, Hedrick PW. Evolution and ecology of MHC molecules：from genomics to sexual selection［J］. Trends Ecol Evol, 1998, 13：305-311.

［5］ Hughes AL, Yeager M. Natural selection at major histocompatibility complex loci of vertebrates［J］. Annu Rev Genet, 1998, 32：415-435.

［6］ Hess CM, Edwards SV. The evolution of the major histocompatibility complex in birds［J］. Bioscience, 2002, 52：423-431.

［7］ Penn DJ, Damjanovich K, Potts WK. MHC heterozygosity confers a selective advantage against multiple-strain infections［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 2002, 99：11260-11264.

［8］ Rothschild MF. Selection for disease resistance in pig［J］. Pig News inf, 1985, 6：277-280.

［9］ Amills M, Ramiya V, Norimine J, et al. The major histocompatibility complex of ruminants［J］. Rev Sci Tech, 1998, 17：108-120.

［10］ 張冬杰. SLA-DQA 基因的多態(tài)性與仔豬初生重和30日齡體重的相關(guān)性分析［J］. 黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010, 1（1）：1-2.

［11］ 趙德榮, 孫嵐玲.哺乳類(lèi)MHC多態(tài)性的形成［J］.國(guó)外醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)分冊(cè), 1995, 18（6）：330-332.

［12］ 陳芳芳, 潘玲, 耿照玉.MHC分子多態(tài)性的起源、演變與抗病機(jī)理［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2010, 41（9）：1061-1067.

［13］ Kanai T H, Tanioka Y, Tanigawa M, et al. Allelic diversity at class DRB and DQB loci of the pig MHC［J］.Immunogenetics, 1990, 50（516）：295-300.

［14］ 孔晶晶, 滾雙寶.豬SLA-DQA基因外顯子4多態(tài)性分析［J］.華北農(nóng)學(xué)報(bào), 2012, 27（3）：86-90.

［15］ 朱璟, 葉蘭, 潘章源,等. 蘇太豬SLA-DQA基因SNP 檢測(cè)及其對(duì)部分經(jīng)濟(jì)性狀的遺傳效應(yīng)分析［J］.中國(guó)畜牧雜志, 2010, 46（23）：5-8.

［16］ 吳圣龍, 鞠慧萍, 包文斌,等.蘇太豬SLA-DQA基因多態(tài)性及其與生產(chǎn)性能的關(guān)聯(lián)分析［J］.中國(guó)畜牧獸醫(yī), 2007, 34（7）：38-40.

［17］ 劉榮輝, 盧麗儀, 李華,等.滇南小耳豬與云南野豬SLA-DQA基因的多態(tài)性比較［J］. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué)，2011, 31（5）：360-364.

［18］ Kanai TH, Tanioka Y, Tanigawa M, et al. Allelic diversity at class DRB and DQB loci of the pig MHC J］.Immunogenetics, 1999, 50（516）：295-300.

［19］ 姚金梅, 連林生.豬SLAⅡ類(lèi)基因多態(tài)性及其與抗病性狀關(guān)聯(lián)的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)畜牧獸醫(yī), 2008, 35（10）：64-66.

［20］ Wang Z, Moult J. SNPs, proteins structer, and disease［J］.Human Mutation, 2001, 17：263 -270.

［21］ 李金蓮, 芒來(lái), 石有斐.利用微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)蒙古馬和純血馬遺傳多樣性的研究［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2005, 63（1）：6-9.

（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Analyzing Polymorphism of Hezuo Swine SLA-DQA Gene Exon 4

Zhang Guohua1Ma Xiaojun1，2Lü Weili1
（1. College of Veterinary Medicine，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070；2 Gansu Key Laboratory of Herbivorpous Animal Biotechnology，Lanzhou 730070）

The Hezuo swine SLA-DQA gene adaptive mutation, antigen recognition region（exon 4）by PCR amplification and subsequent single-strand conformation polymorphism（SSCP）and sequence analysis . The results show that 439 Hezuo swine individual SLA -DQA exon 4 detection of three alleles and six genotypes（AA, BB, CC, AB, AC, BC）the highest frequency of the A allele and AA genotype, genotype was the dominant gene and advantages .On a different type of PCR-SSCP pieces with sequencing analysis found that the fourmutated sites（5 068 bp T→C, 5 109 bp and 5 149 bp insert C, 5 131 bp A → G cause serine into glycine, 5 135 bp C → T, at 5 136 bp insert A, the 5 234 bp G → A lead tyrosyl acid becomes cysteine.Genetic analysis：cooperation pig polymorphic information content（PIC）was 0.240 1, belongs to the moderate polymorphism；significant distribution of various genotypes .The findings confirm that cooperation pig SLA - DQA gene the 4 exon has low rich genetic polymorphism .

Hezuo swine SLA-DQA gene polymorphism Genetic characteristics

2013-08-23

甘肅省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（096RJZA005）

張國(guó)華，男，碩士研究生，研究方向：動(dòng)物免疫與抗病；E-mail：664802394@qq.com

馬小軍，男，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：動(dòng)物免疫與抗??；E-mail：maxj712@163.com