張煥鄭佳闞丹丹樊金萍

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，哈爾濱 150030；2.伊春市南岔區(qū)人事局，153000 伊春；3.黑河市愛輝區(qū)紀(jì)檢委，黑河 164300）

農(nóng)桿菌介導(dǎo)亞洲百合轉(zhuǎn)化體系的建立及轉(zhuǎn)GsZFP1基因研究

張煥1鄭佳2闞丹丹3樊金萍1

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，哈爾濱 150030；2.伊春市南岔區(qū)人事局，153000 伊春；3.黑河市愛輝區(qū)紀(jì)檢委，黑河 164300）

以亞洲百合‘耀眼’（Cedeazzle）無菌苗小鱗片為遺傳轉(zhuǎn)化受體，并利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將鋅指轉(zhuǎn)錄因子基因GsZFP1轉(zhuǎn)化‘耀眼’無菌苗小鱗片，初步建立亞洲百合‘耀眼’的遺傳轉(zhuǎn)化體系，通過篩選獲得了50株疑似轉(zhuǎn)化植株，通過用PCR方法對獲得的50株疑似抗性植株進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示20株呈陽性，PCR陽性轉(zhuǎn)化率為40%；將得到的陽性植株進(jìn)行RT-PCR檢測，獲得12株RT-PCR陽性植株。結(jié)果表明，鋅指轉(zhuǎn)錄因子基因GsZFP1在亞洲百合‘耀眼’中得到表達(dá)。

亞洲百合 鱗片 轉(zhuǎn)化體系 農(nóng)桿菌介導(dǎo) GsZFP1基因

百合（Liliumspp.）是世界著名鮮切花，消費(fèi)量逐年攀升［1］，并且百合在花卉市場上占有重要位置［2］。由于東北地區(qū)多以亞洲百合栽培為主，為了進(jìn)一步提高亞洲百合的抗寒、抗旱性，因此開展將抗性基因?qū)氚俸系难芯繉Π俸峡剐云贩N篩選具有重要的指導(dǎo)意義。而百合遺傳轉(zhuǎn)化體系多以直接再生方式為主［3］，遺傳轉(zhuǎn)化中多采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法。如劉菊華等［4］以鱗片為受體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將攜帶有幾丁質(zhì)酶基因和β-1，3葡聚糖酶基因?qū)氚俸?，得到了轉(zhuǎn)基因植株。陳莉等［5］以麝香百合‘White Elegance’葉片為受體，將Mn-SOD基因?qū)氚俸现?，以直接再生為主產(chǎn)生抗性植株。因此，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將抗性基因?qū)氚俸系难芯渴潜匾摹?/p>

鋅指蛋白是目前發(fā)現(xiàn)種類最多、在真核細(xì)胞中具有重要調(diào)控作用的一類核酸結(jié)合蛋白［6］。它是一類具有指狀結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，普遍存在于植物中，主要功能涉及植物的生長發(fā)育和對環(huán)境脅迫的應(yīng)答反應(yīng)［7-9］。它對生物的發(fā)育及逆境脅迫的耐受能力都有著重要關(guān)系［10］。目前植物研究較多、較為明確的鋅指蛋白是C2H2型鋅指蛋白，該蛋白大部分鋅指結(jié)構(gòu)具有一段高度保守的氨基酸序列 QALGGH，這是植物中獨(dú)有的特征［11］。研究表明，超量表達(dá)C2H2類型的ZFPs不但提高了植物對鹽、干旱及低溫等非生物脅迫的耐性，還同時(shí)改變了下游基因表達(dá)及脅迫響應(yīng)信號(hào)通路的傳遞［12-15］。GsZFP1基因的表達(dá)產(chǎn)物屬于C2H2鋅指蛋白。GsZFP1基因是羅曉等［16，17］首次從野生大豆中克隆出來的，并且經(jīng)研究表明，該基因能提高擬南芥植株的耐干旱、耐冷性。

本試驗(yàn)用的植物表達(dá)載體pCEOM-GsZFP1帶有CaMV35S啟動(dòng)子、E12增強(qiáng)子和 bar 篩選標(biāo)記基因，CaMV35S啟動(dòng)子是廣泛運(yùn)用的組成型啟動(dòng)子，在植物中表達(dá)效率高［18］，bar基因不僅可以作為篩選標(biāo)記基因使用，還具有農(nóng)藝價(jià)值且是國家公認(rèn)的安全性基因［19］。本研究通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將GsZFP1基因?qū)雭喼薨俸稀邸–edeazzle），期待提高其對干旱及冷的抗性，為今后培育亞洲百合抗性品種奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 亞洲百合‘耀眼’（Cedeazzle）鱗莖，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝試驗(yàn)站溫室提供。

1.1.2 菌株和質(zhì)粒 大腸桿菌菌株DH5α、農(nóng)桿菌GV3101均由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院園林育種實(shí)驗(yàn)室提供；重組質(zhì)粒pCEOM-GsZFP1由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物生物工程研究室提供。

1.1.3 常用試劑及酶類 DNA Marker DL2000、dNTPs、Wizard? SV Gel and PCR Clean-Up System均購自大連寶生物工程公司，PCR引物由哈爾濱博仕生物工程公司合成。

1.1.4 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件 試驗(yàn)各個(gè)階段所用的最佳培養(yǎng)基組成及其編號(hào)，見表1，各培養(yǎng)基中均含3.0% 蔗糖和 0.7% 瓊脂，pH為5.82，121℃滅菌 20 min；培養(yǎng)條件：溫度為（25±1）℃、光照強(qiáng)度為25 μmol（m2· s）、光照周期為16 h。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒DNA的提取及檢測 采用中科瑞泰質(zhì)粒小劑量提取試劑盒提取，提取重組質(zhì)粒DNA后，進(jìn)行PCR及凝膠電泳檢測。

1.2.2 凍融法轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌及檢測 采用凍融法將質(zhì)粒pCEOM-GsZFP1轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌GV3101，先制備農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞，再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，最后進(jìn)行檢測。

1.2.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)亞洲百合‘耀眼’的遺傳轉(zhuǎn)化

1.2.3.1 轉(zhuǎn)化受體材料的獲得 剝?nèi)≥^厚大的亞洲百合‘耀眼’鱗片，先用流水沖洗40 min左右，再在超凈工作臺(tái)中經(jīng)過一系列滅菌之后接種至M1培養(yǎng)基中，進(jìn)行不定芽分化培養(yǎng)（圖1-A）；當(dāng)不定芽長至3-5 cm時(shí)從基部切下，接種至M2培養(yǎng)基上，先暗培養(yǎng)15 d，再取出置于組培室，進(jìn)行試管鱗莖誘導(dǎo)培養(yǎng)（圖1-B），培養(yǎng)45 d左右時(shí)，取試管鱗莖上較厚大的小鱗片接種至M3培養(yǎng)基上，進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，5 d左右時(shí)即可進(jìn)行侵染（圖1-C）。

1.2.3.2 農(nóng)桿菌侵染液的準(zhǔn)備 先用接菌環(huán)挑取單菌落接種在10 mL含相應(yīng)抗生素的YEB液體培養(yǎng)基中，于28℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)，至菌液OD600為0.5-0.6，約36 h；然后用接種環(huán)蘸取一次活化的菌液按1∶10的比例接種在50 mL添加相應(yīng)抗生素的YEB液體培養(yǎng)基中二次活化，于28℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)，至OD600為0.5-0.6，約16 h；最后將菌液移至無菌離心管中于10 000 r/min離心10 min，棄上清，用等體積的MS液體培養(yǎng)基重懸，再振蕩1-2 h，至OD600為0.5-0.6，即可作為侵染液備用。

1.2.3.3 篩選劑草丁磷（PPT）濃度的確定 選取試管鱗莖上生長厚大的小鱗莖，用刀片切成約0.25 cm2左右的小塊，在侵染液（OD600為0.5-0.6）中侵染20 min，接種在附加不同濃度PPT（0、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、1.75、2.0 mg/L）的分化培養(yǎng)基上，15 d繼代一次，30 d后觀察小鱗片不定芽分化情況；選取分化較好的不定芽從基部切下，接種在附加不同 濃 度PPT（0、0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5 mg/L）的生根培養(yǎng)基上，25 d后觀察生根情況。

1.2.3.4 抑菌劑頭孢霉素（Cef）濃度的確定 本試驗(yàn)選用頭孢霉素（Cef）作為抑菌劑，用接種環(huán)把農(nóng)桿菌GV3101在附加不同濃度Cef的YEB固體培養(yǎng)平板上劃線，放置在培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行28℃暗培養(yǎng)，2-3 d后觀察抑菌效果，初步確定抑菌劑的大致濃度。再進(jìn)一步做外植體敏感性試驗(yàn)。將轉(zhuǎn)化受體材料（小鱗片）在侵染液（OD600為0.5-0.6）中浸泡15-20 min，取出材料并用無菌濾紙吸干，接種到含有不同濃度（0、150、200、250、300、350、400 mg/L）Cef除菌篩選培養(yǎng)基上，15-20 d繼代一次，隨時(shí)觀察Cef的抑菌效果對小鱗片分化的影響，培養(yǎng)40 d后統(tǒng)計(jì)分化情況。

1.2.3.5 農(nóng)桿菌最適侵染時(shí)間的確定 將外植體侵染時(shí)間設(shè)為5、10、15、20、25、30 min 6個(gè)梯度。用準(zhǔn)備好的農(nóng)桿菌侵染液侵染預(yù)培養(yǎng)5 d的‘耀眼’小鱗片，然后將其接種至M3培養(yǎng)基上，共培養(yǎng)3 d左右時(shí)，取出接種至M4培養(yǎng)基上進(jìn)行不定芽分化，培養(yǎng)一段時(shí)間后，將分化的不定芽從基部切下，接種至M5培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，觀察記錄其生長狀況。

1.2.4 轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測

1.2.4.1 轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測 用CTAB法提取轉(zhuǎn)化后獲得的抗性植株葉片DNA，以葉片DNA為模板，以植物表達(dá)載體上Bar-35S啟動(dòng)子序列特異引物進(jìn)行PCR檢測。

1.2.4.2 PCR陽性植株的RT-PCR檢測 提取經(jīng)PCR檢測陽性植株及非轉(zhuǎn)基因植株的總RNA，首先將其反轉(zhuǎn)錄，然后以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，對轉(zhuǎn)GsZFP1基因陽性植株進(jìn)行RT-PCR檢測，以檢測目的基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取及檢測

提取重組質(zhì)粒DNA后，進(jìn)行PCR及凝膠電泳檢測，電泳結(jié)果（圖2）顯示，轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的陽性克隆擴(kuò)增出目的條帶。

2.2 質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌及檢測

首先采用凍融法將重組質(zhì)粒pCEOM-GsZFP1轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中，其次在含有相應(yīng)抗生素的YEB培養(yǎng)基上劃線，待有單個(gè)的菌落長出后，進(jìn)行搖菌，最后對得到的菌液進(jìn)行PCR檢測。由電泳結(jié)果（圖3）可以看出，擴(kuò)增出目的條帶，說明重組質(zhì)粒已轉(zhuǎn)入到根癌農(nóng)桿菌中，可以用于下一步的轉(zhuǎn)化。

2.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)‘耀眼’的遺傳轉(zhuǎn)化

2.3.1 篩選劑草丁磷對外植體分化率的影響 經(jīng)過不同濃度的草丁磷篩選試驗(yàn)，30 d后觀察可知，小鱗片隨著草丁磷濃度的上升分化率明顯降低（圖4），統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)草丁磷濃度為1.0 mg/L時(shí)，‘耀眼’小鱗片的分化率明顯降低，為38.34%；草丁磷濃度為1.5 mg/L時(shí)，‘耀眼’小鱗片的分化率急劇下降，為8.34%；當(dāng)草丁磷濃度為1.75 mg/L時(shí)，‘耀眼’小鱗片的分化率為3.33%，鱗片已經(jīng)不能分化出健康的不定芽（表2）。因此，以鱗片作為轉(zhuǎn)基因受體分化不定芽時(shí)，篩選劑草丁磷濃度以1.75 mg/L為宜。

由表3可知，不定芽根的分化隨著草丁磷濃度的上升分化率明顯降低。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)草丁磷濃度為0.75 mg/L時(shí)，根的分化率明顯降低，為36.67%；草丁磷濃度為1.0 mg/L時(shí)，根的分化率急劇下降，為17.50%；當(dāng)草丁磷濃度為1.25 mg/L時(shí)，根的分化率為4.27%，不定芽已經(jīng)不能分化出健康的根。因此，當(dāng)轉(zhuǎn)基因不定芽分化根時(shí)，篩選劑草丁磷濃度以1.25 mg/L為宜。

2.3.2 抑菌劑頭孢霉素（Cef）濃度的確定 經(jīng)初步篩選確定了抑菌劑的大概濃度為300 mg/L，然后在除菌篩選階段，以300 mg/L為基準(zhǔn)再分別上下設(shè)定不同的濃度進(jìn)行處理，1周后觀察效果（表4）。Cef 在300-350 mg/L范圍內(nèi)能有效抑制農(nóng)桿菌的生長，當(dāng)Cef濃度為300 mg/L時(shí)，外植體的分化率為78.34%，相對較高；而當(dāng)Cef濃度為350 mg/L時(shí)，外植體的分化率為41.67%，分化率相對較低。本著篩選不抑制植物生長的最大濃度的原則，確定‘耀眼’轉(zhuǎn)化抑菌劑濃度為300 mg/L。外植體不定芽長至3-5 cm 時(shí)，從基部切下，在300 mg/L濃度的抑菌劑溶液中沖洗一下，并用濾紙吸干，再接種至無菌苗生根培養(yǎng)基中。

2.3.3 農(nóng)桿菌侵染時(shí)間對‘耀眼’轉(zhuǎn)化率的影響 由表5可知，侵染時(shí)間為5-10 min時(shí)，分化率較低；侵染時(shí)間為25-30 min時(shí)，褐化率較高，除菌較困難；侵染時(shí)間為.15-20 min時(shí)，外植體分化率較高，長勢較好，易除菌。其中侵染時(shí)間為20 min時(shí)，分化率最高且長勢好。因此，‘耀眼’無菌苗小鱗片最適宜的侵染時(shí)間為20 min。

2.3.4 亞洲百合‘耀眼’遺傳轉(zhuǎn)化以及抗性植株再生 農(nóng)桿菌介導(dǎo)亞洲百合‘耀眼’轉(zhuǎn)化及抗性植株再生的過程如圖5所示，首先對預(yù)培養(yǎng)的小鱗片進(jìn)行侵染（5-A）、預(yù)培養(yǎng)（5-B）；其次進(jìn)行抗性芽的篩選（5-C）及芽伸長培養(yǎng)（5-D）；然后進(jìn)行抗性苗的生根篩選（5-E，F(xiàn)）；最后進(jìn)行移栽，獲得轉(zhuǎn)基因植株（5-G）。

2.4 ‘耀眼’轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測

2.4.1 轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測 對篩選出的50株疑似抗性植株進(jìn)行PCR檢測，用Bar-35S啟動(dòng)子序列特異引物，以質(zhì)粒為陽性對照，水為陰性對照，非轉(zhuǎn)基因植株為負(fù)對照對轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行初步的篩選。經(jīng)初步檢測，在試驗(yàn)得到的50株疑似轉(zhuǎn)基因植株中，共得到20株P(guān)CR陽性植株，PCR陽性轉(zhuǎn)化率為40%，初步證明鋅指轉(zhuǎn)錄因子基因GsZFP1已轉(zhuǎn)入到亞洲百合‘耀眼’中。部分檢測結(jié)果見圖6。

2.4.2 陽性植株的RT-PCR檢測 為進(jìn)一步檢測GsZFP1在轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)情況，進(jìn)行RT-PCR檢測。經(jīng)檢測，篩選到的20株P(guān)CR陽性植株中，有12株為RT-PCR陽性植株，說明基因GsZFP1在這些植株中有成功轉(zhuǎn)錄的，但也有不轉(zhuǎn)錄的。部分檢測結(jié)果見圖7。

3 討論

由于本試驗(yàn)所使用的植物表達(dá)載體pCEOMGsZFP1上帶有bar 篩選標(biāo)記基因，因此選用草丁磷為篩選劑。在之前亞洲百合轉(zhuǎn)基因過程中，多數(shù)以卡那霉素及羧芐青霉素作為篩選劑，只有王凱等［20］在以亞洲百合‘金黃精靈’為受體材料，建立遺傳轉(zhuǎn)化體系的過程中，以草丁磷為篩選劑，并且得出芽分化階段PPT濃度為1.6 mg/L，根分化階段PPT濃度為0.8 mg/L。本研究通過篩選劑濃度梯度試驗(yàn)確定亞洲百合‘耀眼’芽分化階段PPT最適的濃度為1.75 mg/L，根分化階段PPT最適的濃度為1.25 mg/L。試驗(yàn)結(jié)果與前者不同，這說明亞洲百合不同品種在遺傳轉(zhuǎn)化的過程中，使用的篩選劑濃度也不同。

本試驗(yàn)對篩選植株進(jìn)行了PCR檢測和RT-PCR檢測，初步證明GsZFP1基因已在亞洲百合‘耀眼’表達(dá)，但對于轉(zhuǎn)基因‘耀眼’的抗旱性及耐冷性仍需進(jìn)一步試驗(yàn)研究，包括對轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行基因表達(dá)水平的定量分析、基因表達(dá)對植株生理代謝的影響及遺傳穩(wěn)定性的表達(dá)等，以篩選出表達(dá)強(qiáng)、抗逆性提高幅度大且生長正常的轉(zhuǎn)基因植株，為以后百合的抗性育種和推廣應(yīng)用奠定一定的理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究以亞洲百合‘耀眼’無菌苗小鱗片為轉(zhuǎn)化受體，以根癌農(nóng)桿菌GV3103為轉(zhuǎn)化的菌株，bar基因?yàn)楹Y選標(biāo)記基因，CaMV35S為啟動(dòng)子，將GsZFP1基因?qū)雭喼薨俸稀邸?，建立亞洲百合‘耀眼’的遺傳轉(zhuǎn)化體系，通過篩選獲得了50株疑似轉(zhuǎn)化植株，用PCR方法對獲得的50株疑似抗性植株進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示20株呈陽性，PCR陽性轉(zhuǎn)化率為40%；將得到的陽性植株進(jìn)行RT-PCR檢測，獲得12株RT-PCR陽性植株。結(jié)果表明鋅指轉(zhuǎn)錄因子基因GsZFP1在亞洲百合‘耀眼’中得到表達(dá)。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Establishment of Agrobacterium-mediated Asiatic Lily‘Cedeazzle’Transformation System and Transfer of GsZFP1 Genes

Zhang Huan1Zheng Jia2Kan Dandan3Fan Jinping1
（1. College of Horticulture，Northeast Agricultural University，Harbin 150030；2. Personnel，Nancha area，Yichun 153000；3. JiJianWei，Aihui District，Heihe 164300）

With small scales of aseptic seedling as genetic transformation, zinc finger transcription factor gene GsZFP1 was transformed into‘Cedeazzle’aseptic small scales by Agrobacterium-mediated, and the genetic transformation system of Asiatic Lily‘Cedeazzle’was established. Fifty putative transgenic plants were obtained, and 20 were identified as positive transgenic plants by PCR assay, PCR transform rate was 40%；and 12 positive plants were obtained by RT-PCR test. The results showed that GsZFP1 was expressed in Asiatic Lily‘Cedeazzle’.

Asiatic lily Small scales Transformation system Agrobacterium-mediated GsZFP1 gene

2013-08-23

張煥，女，碩士研究生，研究方向：園林植物遺傳育種；E-mail：ZHLQ8584@163.com

樊金萍，女，教授，研究方向：園林植物遺傳育種；E-mail：fan_xuer2000@aliyun.com