劉子記 詹園鳳 楊衍

（中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所 農(nóng)業(yè)部華南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，儋州 571737）

利用SSR標(biāo)記鑒定熱研二號(hào)油綠苦瓜雜交種純度

劉子記 詹園鳳 楊衍

（中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所 農(nóng)業(yè)部華南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，儋州 571737）

利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)熱研二號(hào)油綠苦瓜進(jìn)行雜交種純度檢測(cè)技術(shù)研究。研究結(jié)果表明，5對(duì)SSR標(biāo)記在熱研二號(hào)親本間表現(xiàn)明顯的多態(tài)性，其中4對(duì)為共顯性標(biāo)記，1對(duì)為顯性標(biāo)記。為確保鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，利用4對(duì)共顯性的SSR標(biāo)記對(duì)熱研二號(hào)進(jìn)行純度鑒定，雜交種純度為98.82%，與田間形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果完全一致。該研究表明利用SSR標(biāo)記對(duì)熱研二號(hào)油綠苦瓜進(jìn)行純度鑒定是切實(shí)可行的。

苦瓜 SSR 熱研二號(hào) 純度鑒定

苦瓜（Momordica charantiaL.，2n= 2x= 22）為葫蘆科（Cucurbitaceae）苦瓜屬（MomordicaL.）一年生草本植物，因果實(shí)具有特殊的苦味，故名苦瓜?？喙蠣I(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高，富含維生素C、維生素E、氨基酸及礦物質(zhì)。此外，苦瓜所含的藥理活性成分具有降血糖［1］、抗腫瘤［2］和降低膽固醇［3］等功效。海南省屬于華南地區(qū)北運(yùn)瓜菜產(chǎn)業(yè)帶，對(duì)保障全國(guó)菜籃子工程建設(shè)具有不可替代性。苦瓜是海南主要冬種瓜菜種類之一，栽培面積逐年擴(kuò)大。

作物雜交種純度顯著影響作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。開展種子純度檢測(cè)對(duì)保證種子質(zhì)量和發(fā)揮優(yōu)良品種的增產(chǎn)潛力具有重要意義。傳統(tǒng)田間形態(tài)鑒定所需時(shí)間較長(zhǎng)，易受環(huán)境條件影響，不能完全滿足雜交種生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)的需要［4］。DNA 分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展為作物品種鑒定與純度分析提供了更為準(zhǔn)確、可靠、方便的方法。SSR標(biāo)記具有快速、準(zhǔn)確、多態(tài)性豐富、呈共顯性遺傳、操作簡(jiǎn)單、結(jié)果穩(wěn)定可靠等特點(diǎn)［5］，符合作物品種鑒別的4個(gè)基本準(zhǔn)則：環(huán)境的穩(wěn)定性、品種間變異的可識(shí)別性、最小的品種內(nèi)變異和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性?？梢钥焖佟?zhǔn)確、有效地檢測(cè)生物體中的遺傳變異，被廣泛用于黃瓜［6，7］、甜瓜［8］、西瓜［9］等瓜類作物品種純度檢驗(yàn)。與黃瓜、西瓜和甜瓜相比，苦瓜基因組研究進(jìn)展比較緩慢，公開發(fā)表的基因組序列資源和SSR標(biāo)記數(shù)目非常有限，目前國(guó)內(nèi)外尚無利用SSR標(biāo)記鑒定苦瓜雜交種純度的研究報(bào)道。本研究擬以熱研二號(hào)油綠苦瓜雜交種及其親本為材料，旨在利用SSR標(biāo)記建立苦瓜雜交種純度鑒定技術(shù)體系。

1 材料與方法

1.1 材料

熱研二號(hào)屬油綠型雜交苦瓜品種，由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所選育而成，適合在華南地區(qū)的海南、廣東、廣西苦瓜主產(chǎn)區(qū)推廣種植。母本材料02-20-4-9由來自日本沖繩省的一個(gè)栽培品種經(jīng)過連續(xù)8代自交選育出的強(qiáng)雌性系，表現(xiàn)豐產(chǎn)、中熟、強(qiáng)雌性、高抗白粉病。父本MC009是來自云南玉溪的一個(gè)優(yōu)良自交系，該自交系抗病性強(qiáng)，早熟。將熱研二號(hào)、母本及父本材料播種于營(yíng)養(yǎng)缽中，待植株長(zhǎng)至5-6片真葉時(shí)利用改良的CTAB法［10］提取02-20-4-9、MC009和熱研二號(hào)單株葉片的基因組DNA，貯于-20℃冰箱備用。

1.2 方法

1.2.1 多態(tài)性標(biāo)記篩選 利用已開發(fā)的苦瓜SSR標(biāo)記［11，12］，以母本材料02-20-4-9和父本材料MC009基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，篩選多態(tài)性的SSR標(biāo)記。

PCR反應(yīng)體系為10 μL，其中包括10 mmol/L Tris-HCl（pH8.0），50 mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl2，0.15 mmol/ L dNTPs，50 ng引物，0.6 UTaqDNA聚合酶和60-100 ng模板DNA。擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性3 min；94℃變性40 s，50-60℃（根據(jù)具體引物的退火溫度而定）退火40 s，72℃延伸1.5 min，35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸6 min。PCR產(chǎn)物保存于4℃。4 μL擴(kuò)增產(chǎn)物與2 μL上樣緩沖液混合經(jīng)12%非變性聚丙烯酰胺（丙烯酰胺∶甲叉雙丙烯酰胺=39∶1）凝膠電泳，銀染顯色進(jìn)行帶型統(tǒng)計(jì)。

1.2.2 熱研二號(hào)雜交種純度鑒定 利用在親本材料間表現(xiàn)多態(tài)性的SSR標(biāo)記，以熱研二號(hào)油綠苦瓜單株DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)特異譜帶的擴(kuò)增結(jié)果檢測(cè)雜交種的純度。將取材后的苦瓜幼苗按照順序移栽到中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所蔬菜試驗(yàn)基地，在結(jié)果期依據(jù)品種的果皮顏色及果實(shí)特征特性逐株進(jìn)行鑒定，將SSR標(biāo)記鑒定結(jié)果與田間形態(tài)鑒定結(jié)果進(jìn)行比較分析。

2 結(jié)果

2.1 材料DNA提取

在研磨苦瓜葉片時(shí)添加少量PVP能有效去除糖類物質(zhì)，利用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的DNA純度和濃度，樣品檢測(cè)結(jié)果（圖1）表明，DNA呈現(xiàn)一條清晰整齊的主帶，無明顯降解現(xiàn)象，符合SSR標(biāo)記分析對(duì)DNA模板質(zhì)量的要求。

2.2 多態(tài)性標(biāo)記篩選

以母本材料02-20-4-9和父本材料MC009為模板篩選26對(duì)苦瓜SSR引物，其中15對(duì)引物能擴(kuò)增出清晰可辨的條帶，擴(kuò)增效率為57.69%，5對(duì)引物在親本間能擴(kuò)增出明顯的多態(tài)性（表1，圖2），多態(tài)性比率為19.23%，BSSR3、BSSR7、BSSR9和BSSR14為共顯性標(biāo)記，擴(kuò)增出的特異譜帶能夠?qū)㈦s交種與母本自交種、父本自交種區(qū)分開來；BSSR16為偏父本型的顯性標(biāo)記，雜交種擴(kuò)增出的譜帶與父本材料一致；多態(tài)性片段大小150-480 bp（圖2）。

2.3 利用SSR標(biāo)記對(duì)熱研二號(hào)雜交種純度進(jìn)行鑒定

共顯性標(biāo)記可以有效區(qū)分雜交種、母本自交種和父本自交種。本研究選用在親本材料間表現(xiàn)共顯性的標(biāo)記BSSR3、BSSR7、BSSR9和BSSR14對(duì)170株熱研二號(hào)油綠苦瓜進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果（圖3）表明，168個(gè)熱研二號(hào)單株具有雙親特異譜帶，屬于真實(shí)的雜交種，15號(hào)和26號(hào)單株缺少父本特異帶，與母本擴(kuò)增圖譜一致，說明15號(hào)和26號(hào)單株為母本自交株，這可能由于雄花摘除不徹底導(dǎo)致母本自交結(jié)實(shí)致使雜交種中混有少量母本自交種，4對(duì)SSR標(biāo)記的鑒定結(jié)果一致，熱研二號(hào)雜交種純度為98.82%。從分子標(biāo)記鑒定結(jié)果來看，母本自交是降低雜交種純度的主要原因。母本材料02-20-4-9來自日本沖繩省，表現(xiàn)強(qiáng)雌性，果實(shí)長(zhǎng)圓錐形，淺綠色，父本材料MC009來自云南玉溪，條瘤粗直均勻，深綠色。

在田間鑒定中，通過觀察果皮顏色和性別類型鑒定熱研二號(hào)純度。15號(hào)和26號(hào)單株果皮顏色為淺綠色，表現(xiàn)為強(qiáng)雌性系，其余植株均具有熱研二號(hào)油綠苦瓜典型特征，植株生長(zhǎng)旺盛，分枝性較強(qiáng)，果實(shí)長(zhǎng)圓錐形，皮色深綠有光澤，瓜形美觀，田間鑒定結(jié)果表明15號(hào)和26號(hào)單株屬母本自交株，標(biāo)記鑒定結(jié)果與田間鑒定結(jié)果完全一致。該研究結(jié)果表明SSR技術(shù)可用于熱研二號(hào)油綠苦瓜雜交種純度快速檢測(cè)。

3 討論

作物雜交種純度田間種植形態(tài)鑒定所需周期較長(zhǎng)，耗費(fèi)大量人力、物力和財(cái)力，易受栽培措施及環(huán)境因素影響，另外鑒定者的觀察經(jīng)驗(yàn)也制約著鑒定的準(zhǔn)確性。理想的鑒定技術(shù)不但要準(zhǔn)確可靠，還要簡(jiǎn)單、快速和經(jīng)濟(jì)，這是品種純度鑒定技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)［13］。DNA分子標(biāo)記技術(shù)的出現(xiàn)，為作物品種純度鑒定提供了更為準(zhǔn)確、可靠、方便的方法。近年來，AFLP、RAPD和SSR等分子標(biāo)記技術(shù)被廣泛用于作物雜交種純度鑒定。張菊平等［14］和林琿等［15］利用RAPD分子標(biāo)記分別對(duì)‘碧綠3號(hào)’和‘閩研2號(hào)’苦瓜雜交種進(jìn)行純度鑒定，標(biāo)記鑒定結(jié)果與田間鑒定結(jié)果完全一致，但RAPD標(biāo)記的穩(wěn)定性和重復(fù)性較差。SSR標(biāo)記技術(shù)不僅具有RFLP技術(shù)的穩(wěn)定性和共顯性的優(yōu)點(diǎn)，而且操作簡(jiǎn)單和重復(fù)性較好，能夠?qū)⒄嬲碾s交種和自交株、混雜株區(qū)分開，是進(jìn)行作物雜交種純度鑒定的首選標(biāo)記類型，已在多種農(nóng)作物雜交種純度鑒定中得到應(yīng)用。高海娜等［16］和苗明軍等［17］成功利用SSR標(biāo)記對(duì)甘藍(lán)雜交種‘秦甘50’和‘西園4號(hào)’進(jìn)行純度鑒定。SSR分子標(biāo)記鑒定與田間形態(tài)鑒定相比，準(zhǔn)確性更高，速度更快，能大大提高檢測(cè)效率，具有相當(dāng)高的理論和應(yīng)用價(jià)值。由于苦瓜基因組研究相對(duì)滯后，基因組序列資源非常有限，目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于利用SSR標(biāo)記鑒定苦瓜雜交種純度的研究報(bào)道甚少。本研究以苦瓜雜種一代熱研二號(hào)及其父、母本為材料，建立了利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行苦瓜雜交種純度鑒定的技術(shù)體系。通過對(duì)兩種純度鑒定結(jié)果比較分析發(fā)現(xiàn)，田間形態(tài)學(xué)鑒定與標(biāo)記鑒定結(jié)果一致，熱研二號(hào)種子純度為98.82%。該結(jié)果說明本試驗(yàn)建立的SSR技術(shù)體系可用于苦瓜雜交種純度的快速檢測(cè)。

單對(duì)標(biāo)記不易區(qū)分因隔離不嚴(yán)產(chǎn)生的生物混雜，因此利用單對(duì)標(biāo)記鑒定雜交種純度具有一定的局限性。為確保鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，本研究選取4對(duì)共顯性的SSR標(biāo)記對(duì)熱研二號(hào)的多個(gè)遺傳位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，4對(duì)標(biāo)記的檢測(cè)結(jié)果一致，雜交種中僅混雜了母本自交種，該研究結(jié)果表明母本自交是降低熱研二號(hào)油綠苦瓜雜交種純度的主要原因。

4 結(jié)論

建立了快速、穩(wěn)定的檢測(cè)熱研二號(hào)油綠苦瓜雜交種純度的SSR分子標(biāo)記技術(shù)體系，分子標(biāo)記鑒定結(jié)果與田間形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果完全一致，為熱研二號(hào)油綠苦瓜良種的安全使用提供了科學(xué)依據(jù)。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Hybrid Purity Identification of Reyan No. 2 Using SSR Markers

Liu Ziji Zhan Yuanfeng Yang Yan
（Tropical Crops Genetic Resources Institute，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，Key Laboratory of Crop Gene Resources and Germplasm Enhancement in Southern China，Ministry of Agriculture，Danzhou 571737）

The purity identification of Reyan No.2 was performed by using SSR marker technique. The results showed that 5 SSR markers were polymorphic between the parents of Reyan No.2, among which 4 were co-dominant markers, one was dominant marker. To ensure the accuracy and reliability, 4 co-dominant SSR markers were used for purity identification of Reyan No.2. The hybrid purity was 98.82%, which was completely consistent with field identification. It is feasible to conduct purity identification of Reyan No.2 using SSR markers.

Bitter gourd SSR Reyan No.2 Purity identification

2013-09-06

海南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（312025），中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目（1630032012007，1630032012002）

劉子記，男，博士，助理研究員，研究方向：蔬菜分子生物學(xué)及遺傳育種；E-mail：liuziji1982@gmail.com

楊衍，男，博士，副研究員，研究方向：瓜菜遺傳育種；E-mail：catasvegetable@gmail.com