郭向賀董穎胡紅霞趙艷珍

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院，秦皇島 066003；2.北京市水產(chǎn)科學(xué)研究所，北京 100068）

鱘魚(yú)種質(zhì)鑒定方法研究進(jìn)展

郭向賀1，2董穎2胡紅霞2趙艷珍1

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院，秦皇島 066003；2.北京市水產(chǎn)科學(xué)研究所，北京 100068）

鱘魚(yú)是一類古老的大型經(jīng)濟(jì)魚(yú)類，由于過(guò)度捕撈和人類對(duì)其生態(tài)環(huán)境的破壞及其鱘魚(yú)自身具有的性成熟時(shí)間長(zhǎng)、幼體成活率低等特點(diǎn)，使世界范圍內(nèi)的鱘魚(yú)自然資源日趨枯竭。人工養(yǎng)殖鱘魚(yú)已是鱘魚(yú)制品的主要來(lái)源，但由于種質(zhì)來(lái)源不清及大量雜交鱘的存在導(dǎo)致種質(zhì)混亂情況比較嚴(yán)重，目前國(guó)內(nèi)外均未有一套比較完善可行的鱘魚(yú)種質(zhì)鑒定體系?？偨Y(jié)了目前進(jìn)行鱘魚(yú)種質(zhì)鑒定的一些常用方法，分析了各個(gè)方法的優(yōu)缺點(diǎn)，為確立一套穩(wěn)定可靠的鱘魚(yú)種質(zhì)鑒定方法奠定基礎(chǔ)。

鱘魚(yú) 種質(zhì) 鑒定方法

鱘形目（Acipenseriformes）魚(yú)類是現(xiàn)存唯一的大型軟骨硬鱗魚(yú)，多數(shù)種類具有江河洄游的習(xí)性［1］。鱘魚(yú)肉厚鮮美，含豐富的蛋白質(zhì)［2］，尤其是具有“黑色黃金”之稱的魚(yú)子醬，富含人體必需的多種氨基酸和不飽和脂肪酸（EPA、DHA）、無(wú)機(jī)鹽、維生素，以及多種必需微量元素，價(jià)格更是不菲［3］。但由于人類活動(dòng)的影響致使鱘魚(yú)野外種質(zhì)資源急劇下降，鱘形目多數(shù)種處于瀕?；驑O危狀態(tài)［4］。

隨著人們對(duì)鱘魚(yú)以及鱘魚(yú)魚(yú)子醬需求的增長(zhǎng)，人工養(yǎng)殖鱘魚(yú)已經(jīng)成為鱘魚(yú)制品的主要來(lái)源［5］。雖然鱘魚(yú)養(yǎng)殖規(guī)模越來(lái)越大，但由于沒(méi)有規(guī)范的養(yǎng)殖引種制度，而且國(guó)內(nèi)外目前也還沒(méi)有一套完整的鱘魚(yú)種質(zhì)鑒定體系［6］，使得鱘魚(yú)種質(zhì)現(xiàn)狀繁雜，不利于鱘魚(yú)產(chǎn)業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展。為規(guī)范鱘魚(yú)貿(mào)易以及防止非法捕撈和交易，急需建立一套完整的鱘魚(yú)種質(zhì)鑒定體系。目前，對(duì)鱘魚(yú)進(jìn)行種質(zhì)鑒定主要有形態(tài)學(xué)、SSCP、RAPD、RFLP、AFLP、微衛(wèi)星及物種特異性PCR等多種方法。本文主要對(duì)現(xiàn)在已有的各種鱘魚(yú)種質(zhì)鑒定方法的應(yīng)用情況和優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行綜述，以期為鱘魚(yú)種質(zhì)鑒定找出最優(yōu)方案提供參考。

1 鱘魚(yú)現(xiàn)狀

鱘魚(yú)在早侏羅世已經(jīng)存在（距今1.9-1.4億年），素有“活化石”之稱［7］。鱘魚(yú)隸屬于硬骨魚(yú)綱（Osteichthyes）、輻鰭亞綱（Actinopterygii）、硬鱗總目（Chondrostei）、鱘形目（Acipenseriformes）。現(xiàn)存的鱘魚(yú)有2科6屬27種，其中鱘科（Acipenseridae）有鰉屬（Huso）2種、鱘屬（Acipenser）18種、鏟鱘屬（Scaphirhynchus）2種、擬鏟鱘屬（Pseudoscaphirhynchus）3種；白鱘科（Polyodontidae）有白鱘屬（Psephurus）和匙吻鱘屬（Polyodon）各1種［8］。鱘魚(yú)主要分布在北回歸線以北的亞洲、歐洲和北美洲［9］。但是近幾年由于人類過(guò)度捕撈以及鱘魚(yú)棲息地被大型水利工程的興建和水環(huán)境污染等外界因素破壞，以及鱘魚(yú)性成熟晚、個(gè)體大且幼魚(yú)成活率低等因素，使得野生鱘魚(yú)種群數(shù)量急劇減少，已被列為《瀕危野生動(dòng)植物種國(guó)際貿(mào)易公約》附錄Ⅱ物種［10］。

鱘魚(yú)野生資源日益枯竭的同時(shí)，由于其重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，市場(chǎng)對(duì)鱘魚(yú)產(chǎn)品的需求卻逐年增加。因此人工養(yǎng)殖就成為解決鱘魚(yú)資源保護(hù)和市場(chǎng)需求間矛盾的唯一方法，前蘇聯(lián)、歐洲各國(guó)、美國(guó)及伊朗等國(guó)都相繼開(kāi)展了鱘魚(yú)的人工養(yǎng)殖。我國(guó)從20世紀(jì)90年代開(kāi)始開(kāi)展鱘魚(yú)人工養(yǎng)殖，目前年產(chǎn)鱘魚(yú)商品魚(yú)約3萬(wàn) t，占世界總養(yǎng)殖產(chǎn)量的80%左右，已經(jīng)成為了世界上最重要的鱘魚(yú)生產(chǎn)大國(guó)。但是現(xiàn)存的鱘魚(yú)都是多倍體，彼此間極易進(jìn)行雜交，且產(chǎn)生的雜交種很難區(qū)分。而不同種類鱘魚(yú)及其雜交種的生長(zhǎng)速度和適應(yīng)條件各不相同，其經(jīng)濟(jì)價(jià)值也不盡相同。例如，不同品種鱘魚(yú)卵加工制成的魚(yú)子醬的價(jià)格就相差懸殊，歐洲鰉的魚(yú)子醬價(jià)格超過(guò)5 000美元/kg，俄羅斯鱘的魚(yú)子醬約為4 000美元/kg，西伯利亞鱘的魚(yú)子醬約為3 000美元/kg，而小體鱘的魚(yú)子醬基本沒(méi)有市場(chǎng)。因此，進(jìn)行正確的鱘魚(yú)種質(zhì)鑒定是解決因種質(zhì)混亂引起的糾紛及提高鱘魚(yú)產(chǎn)業(yè)價(jià)值的有效途徑。

2 種質(zhì)鑒定方法

鱘形目自被記錄以來(lái)，人類發(fā)展出多種鱘魚(yú)的種質(zhì)鑒定方法，從傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)到最新的分子生物學(xué)手段都有，本文就各個(gè)方法的應(yīng)用以及優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行了概述。

2.1 形態(tài)學(xué)

動(dòng)物形態(tài)學(xué)是生物學(xué)中具有悠久發(fā)展歷史的一門學(xué)科，從公元前4世紀(jì)亞里斯多德關(guān)于動(dòng)物解剖的試驗(yàn)記錄開(kāi)始，到達(dá)爾文進(jìn)化論使得動(dòng)物形態(tài)學(xué)進(jìn)入嶄新時(shí)期，再到20世紀(jì)初宏觀形態(tài)學(xué)研究的深入，已發(fā)展成為包括解剖學(xué)、比較解剖學(xué)、細(xì)胞學(xué)和組織學(xué)、古動(dòng)物學(xué)和胚胎學(xué)等的綜合性學(xué)科［11］。形態(tài)學(xué)方法可簡(jiǎn)單概括為可數(shù)性狀、可量性狀、結(jié)構(gòu)特征等［12］。

Vasil'eva［13］根據(jù)鰓耙正面及側(cè)面的形態(tài)結(jié)構(gòu)將其現(xiàn)有鱘魚(yú)分為4個(gè)類群，其鰓耙結(jié)構(gòu)分別為圓錐形、扁寬形、樹(shù)形及鉤形。Artyukhin［14］通過(guò)比對(duì)嘴型、吻須位置、第一背骨板是否最大、卵的大小等28處形態(tài)學(xué)特征，對(duì)包括小體鱘、施氏鱘、達(dá)氏鰉、俄羅斯鱘等23種鱘屬進(jìn)行了區(qū)分，并對(duì)形態(tài)學(xué)鑒定與分子鑒定的部分結(jié)果相悖的現(xiàn)象進(jìn)行了解釋。陳細(xì)華［15］對(duì)27種鱘魚(yú)從受精卵到成體的形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行了詳細(xì)的描述及對(duì)比。

Gao等［16］利用中華鱘紅細(xì)胞的密度比其他鱘魚(yú)高的特點(diǎn)將其與其他鱘魚(yú)進(jìn)行區(qū)分，Artyukhin等［17］從形態(tài)學(xué)角度對(duì)6種太平洋鱘魚(yú)進(jìn)行研究，并討論庫(kù)頁(yè)島鱘在分類學(xué)的地位。張穎等［18］利用施氏鱘（♂）×達(dá)氏鰉（♀）雜交鱘特有表型將其與親本進(jìn)行區(qū)分，雖然雜交鱘形態(tài)與母本更為接近，但仍可以通過(guò)比對(duì)頭部特征以及胸鰭、側(cè)骨板數(shù)、臀鰭條數(shù)等7項(xiàng)可數(shù)特征進(jìn)行區(qū)分。

形態(tài)學(xué)方法雖然具有簡(jiǎn)單、直觀等優(yōu)點(diǎn)，但因其判斷的主觀性強(qiáng)，需要較專業(yè)的系統(tǒng)學(xué)知識(shí)，且因地理隔絕或同種鱘魚(yú)不同發(fā)育階段形態(tài)學(xué)也有差異等因素的存在極易造成錯(cuò)判，另外形態(tài)學(xué)也較難區(qū)分多種多樣的雜交鱘。

2.2 PCR-RFLP

限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性（Restriction fragment length polymorphism，RFLP）作為第一代DNA遺傳標(biāo)記法，由Grodjicker等［19］于1974年提出，是利用限制性內(nèi)切酶消化不同品種或個(gè)體的同源分子，經(jīng)電泳分離出不同的限制性片段。特別是RFLP與PCR結(jié)合，使得DNA多態(tài)性檢測(cè)更加直接、快速。

PCR-RFLP技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)：第一，可靠性較高，因?yàn)樗上拗菩詢?nèi)切酶切割特定位點(diǎn)產(chǎn)生；第二，來(lái)源于自然變異，依據(jù)DNA上豐富的堿基變異不需任何誘變劑處理；第三，多樣性，通過(guò)酶切反應(yīng)來(lái)反映DNA水平上所有差異，在數(shù)量上無(wú)任何限制；第四，共顯性。但該技術(shù)的缺點(diǎn)是操作煩瑣，相對(duì)費(fèi)時(shí)，具有種屬特異性，并且可能因?yàn)閴A基突變而導(dǎo)致限制性酶切位點(diǎn)的丟失或獲得。

PCR-RFLP已應(yīng)用到多種魚(yú)類的種質(zhì)鑒定中，如大馬哈魚(yú)［20］、金槍魚(yú)［21］、海鱸［22］、鱈魚(yú)［23］等。在鱘魚(yú)種質(zhì)鑒定中，PCR-RFLP技術(shù)主要被用來(lái)進(jìn)行魚(yú)子醬品種的鑒定。Wolf等［24］利用不同限制性內(nèi)切酶對(duì)俄羅斯鱘、施氏鱘、小體鱘、西伯利亞鱘等十種鱘魚(yú)的線粒體細(xì)胞色素b序列進(jìn)行酶切，結(jié)果可以用于區(qū)分這些鱘魚(yú)的魚(yú)子醬制品。Ludwing等［25］利用7種限制性內(nèi)切酶成功鑒別出22種鱘魚(yú)中的17種。

2.3 PCR-SSCP

單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（Single-strand conformation polymorphism，SSCP）是在1989年由日本學(xué)者Orita等［26］提出的，根據(jù)堿基改變會(huì)影響單鏈DNA空間構(gòu)象的原理，使得空間構(gòu)象有差異的單鏈DNA分子在聚丙烯酰胺凝膠中受到不同阻力，導(dǎo)致電泳速度不同，經(jīng)染色后就可以在凝膠上面檢測(cè)出結(jié)果。

PCR-SSCP具有以下優(yōu)點(diǎn)：第一，操作簡(jiǎn)單，不需要特別儀器，技術(shù)容易掌握；第二，試驗(yàn)步驟少，周期短；第三，可用非同位素方法檢測(cè)；第四，對(duì)己知和未知基因變異的檢測(cè)均有效，對(duì)DNA 原始材料純度要求不高，且所需量較少；第五，適合于大樣本篩查，特別適用于混合細(xì)胞群體中DNA 變異的檢測(cè)；第六，可分析DNA的多態(tài)性和DNA的突變［27，28］。但PCR-SSCP也具有不能識(shí)別堿基突變位置、較適用于300 bp短鏈DNA分析、結(jié)果易受多種因素影響等缺點(diǎn)。

Hara等［29］最先利用PCR-SSCP技術(shù)進(jìn)行魚(yú)類鑒別。隨后，Rehbein等［30］利用PCR-SSCP技術(shù)進(jìn)行了金槍魚(yú)的種質(zhì)鑒定。Rehbein等［31］利用PCRSSCP技術(shù)對(duì)冷凍的4種鰻魚(yú)（歐洲鰻（Anguilla anguilla）、日本鰻（A.japonica）、美洲鰻（A.rostrata）、澳洲鰻（A.australis））和4種鮭魚(yú)（溪紅點(diǎn)鮭（Salvelinus fontinalis）、褐鮭（Salmo trutta）、虹鱒（Oncorhynchus mykiss）、大西洋鮭（Salmo salar））的肌肉組織、3種鱘魚(yú)（歐洲鰉、俄羅斯鱘和閃光鱘）的魚(yú)子醬以及沙丁魚(yú)、鯡魚(yú)、鱈魚(yú)、金槍魚(yú)和鰹魚(yú)的罐頭樣品進(jìn)行種類鑒定，結(jié)果表明4種鰻魚(yú)在兩個(gè)條帶處差異明顯，5種鮭魚(yú)在3對(duì)引物擴(kuò)增后可快速鑒別出，3種鱘魚(yú)的條帶差異明顯，其中歐洲鰉在不用DNA變性的情況下可輕易獲得指紋圖譜，其他的罐頭樣品也可從兩個(gè)條帶的強(qiáng)弱進(jìn)行區(qū)分。Rehbein等［32］利用線粒體細(xì)胞色素b區(qū)域擴(kuò)增出的兩段序列進(jìn)行PCR-SSCP分析，可以對(duì)俄羅斯鱘、小體鱘、歐洲鰉、閃光鱘和裸腹鱘的魚(yú)子醬進(jìn)行區(qū)分，這兩段擴(kuò)增序列（小于150 bp）既保證了單個(gè)堿基替換對(duì)單鏈DNA空間結(jié)構(gòu)的影響，同時(shí)也可以降低過(guò)長(zhǎng)片段對(duì)種內(nèi)鑒定的誤差。

2.4 RAPD

隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（Random amplified polymorphic DNA，RAPD）技術(shù)是由Williams［33］和Welsh［34］在1990年分別提出的，它的原理是：對(duì)于同一模板DNA，用一個(gè)特定引物進(jìn)行擴(kuò)增所得到的電泳帶譜應(yīng)是一致的，引物不同則帶譜就會(huì)有差異。該技術(shù)利用大量各不相同的隨機(jī)短引物（8-10 bp），以待研究的基因組DNA片段為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳分離后即可進(jìn)行多態(tài)性分析。RAPD技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)：第一，操作簡(jiǎn)便，試驗(yàn)周期短，能在較短的時(shí)間內(nèi)篩選大量樣品；第二，所需樣品量極少；第三，引物具普遍適應(yīng)性；第四，不必事先了解目的基因和片段序列；第五，適應(yīng)于自動(dòng)化操作和分析。但該技術(shù)的缺點(diǎn)是結(jié)果不易重復(fù)、多態(tài)性較低，而且是顯性標(biāo)記。

RAPD技術(shù)已經(jīng)被用于鯉魚(yú)［35］、鯰魚(yú)［36］、羅非魚(yú)［37］、古比魚(yú)［38］等魚(yú)類的種質(zhì)鑒定中。Van等［39］利用RAPD技術(shù)成功區(qū)分出白鱘的雌核發(fā)育和多倍體群體。而Comincini等最早將RAPD技術(shù)用于鱘魚(yú)的種質(zhì)鑒定，成功對(duì)俄羅斯鱘、波斯鱘、閃光鱘、裸腹鱘等進(jìn)行鑒別［40］。Barmintsev等［41］將該技術(shù)進(jìn)一步發(fā)展，使其不僅適用于鱘魚(yú)的種質(zhì)鑒定，還適用于對(duì)鱘魚(yú)種群、雜交種甚至是鱘魚(yú)制品的鑒定。

2.5 AFLP

擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（Amplified fragment length polymorphism，AFLP）技術(shù)結(jié)合了RFLP和RAPD各自的優(yōu)點(diǎn)，是由Zabeau和Vos［42］在1993年發(fā)明并發(fā)展起來(lái)的一種檢測(cè)DNA多態(tài)性的技術(shù)。其基本原理是模板DNA由于突變等原因?qū)е旅盖形稽c(diǎn)的改變，因此在限制性內(nèi)切酶的作用下將產(chǎn)生大小不等的片段，從而反映模板DNA的多態(tài)性。AFLP技術(shù)具有需要DNA量小、擴(kuò)增效率高、多態(tài)帶比例高、可靠性好、樣品適用性廣、穩(wěn)定遺傳等優(yōu)點(diǎn)。但其缺點(diǎn)是它不是共顯性標(biāo)記，且對(duì)模板DNA的質(zhì)量要求較高。

AFLP技術(shù)已用于虹鱒魚(yú)［43］、鯰魚(yú)［44］、羅非魚(yú)［45］等魚(yú)類的種質(zhì)鑒定。Congiu等［46］最先利用AFLP技術(shù)成功區(qū)分高首鱘、納氏鱘及其雜交品種。而后，AFLP技術(shù)被用于對(duì)小體鱘、俄羅斯鱘、高首鱘、歐鰉、歐洲大西洋鱘、大西洋鱘、納氏鱘、閃光鱘、短吻鱘和西伯利亞鱘等進(jìn)行區(qū)分，并延伸到對(duì)魚(yú)子醬和熏魚(yú)肉等鱘魚(yú)制品的鑒別［47］。

2.6 微衛(wèi)星

微衛(wèi)星DNA標(biāo)記（Microsatellite），也稱為短串聯(lián)重復(fù)序列（Simple tandem repeats，STRs）或簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simple sequence repeats，SSRs），最先由Litt等［48］提出，一般以2-6個(gè)堿基為核心序列，首尾相連串聯(lián)重復(fù)，存在于幾乎所有真核生物的基因組中，豐度高，且呈隨機(jī)均勻分布［49］。微衛(wèi)星具有數(shù)量多且分布均勻、多態(tài)性豐富、共顯性遺傳、遵循孟德?tīng)栠z傳定律以及具有一定的保守性等優(yōu)點(diǎn)。其缺點(diǎn)是特異性引物的篩選費(fèi)時(shí)費(fèi)力，以及可能產(chǎn)生同源異型或者異源同型現(xiàn)象等。

微衛(wèi)星多被用于遺傳多樣性分析，但也可用于種質(zhì)鑒別。Maltagliati等［50］利用微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)地中海瀕危魚(yú)類西班牙鳉（Valencia hispanica）、利氏西班牙鳉（V. letourneuxi）和斑條秘鳉（Aphanius fasciatus）進(jìn)行區(qū)別。Jenneckens等［51］發(fā)現(xiàn)一個(gè)具有種特異性的微衛(wèi)星引物用來(lái)鑒別閃光鱘及其魚(yú)子醬制品。胡佳等［52］采用微衛(wèi)星標(biāo)記結(jié)合線粒體控制區(qū)同源序列比對(duì)的方法，可以很好地鑒別出施氏鱘、達(dá)氏鰉及其正反交子代。

2.7 物種特異性PCR

物種特異性PCR技術(shù)是通過(guò)對(duì)需要辨認(rèn)的物種及其近緣種的某段序列進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)PCR引物設(shè)計(jì)原則針對(duì)其中有差異的區(qū)域設(shè)計(jì)引物，從而得到具有物種特異性的引物，使得在PCR反應(yīng)過(guò)程中只有目的物種的DNA可以與引物正常退火并延伸，而其他物種的DNA不能與引物匹配或匹配后擴(kuò)增得到的產(chǎn)物與目的物種的擴(kuò)增產(chǎn)物存在較大的長(zhǎng)度差異，通過(guò)是否擴(kuò)增成功或其產(chǎn)物的大小差異來(lái)鑒定目的物種。物種特異性PCR技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、物種特異性強(qiáng)以及高靈敏度等特點(diǎn)，但由于其主要以線粒體DNA作為種質(zhì)鑒定的模版來(lái)源，而鑒于線粒體DNA母系遺傳的特點(diǎn)［53］，此方法無(wú)法用于鑒別雜交種。

Hubalkova等［54］利用Pan Ⅰ序列設(shè)計(jì)的物種特異性引物對(duì)阿拉斯加狹鱈（Theragra chalcogramma）、藍(lán)鱈（Micromesistius poutassou）、無(wú)須鱈（Merlucciusspp.）、大西洋真鱈（Gadus morhua）、綠青鱈魚(yú)（Pollachius virens）和牙鱈（Merlangius merlangus）進(jìn)行擴(kuò)增，成功對(duì)上述幾種鱈魚(yú)進(jìn)行了區(qū)分。其他可以利用物種特異性PCR進(jìn)行種質(zhì)鑒別的還有鰹魚(yú)［55］、鯊魚(yú)［56］、三文魚(yú)和鱒魚(yú)［57］等。DeSalle和Birstein等［58，59］利用物種特異性PCR對(duì)俄羅斯鱘、閃光鱘、歐洲鰉等進(jìn)行了種質(zhì)鑒定。Mugue等［60］利用線粒體DNA的D-loop片段特性設(shè)計(jì)的物種特異性引物對(duì)俄羅斯鱘、達(dá)氏鰉、小體鱘、西伯利亞鱘、歐洲鰉、施氏鱘、閃光鱘和裸腹鱘等八種鱘的魚(yú)子醬產(chǎn)品進(jìn)行鑒定。

2.8 實(shí)時(shí)定量PCR

Higuchi 等［61］首次利用EtBr（溴化乙錠）演示了實(shí)時(shí)定量PCR（Quantitative real-time PCR）的實(shí)時(shí)過(guò)程，典型的實(shí)時(shí)定量PCR方法包括引物的設(shè)計(jì)與合成、反轉(zhuǎn)錄合成cDNA、PCR反應(yīng)混合液的配制、核酸擴(kuò)增、DNA條帶檢測(cè)等幾步。實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)技術(shù)具有快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。

實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)已被成功應(yīng)用于黑線鱈（Melanogrammus aeglefinus）［62］、歐洲無(wú)須鱈（Merluccius merluccius）［63］、 大 西 洋 鱈（Gadus morh-ua）［64］、金槍魚(yú)［65］、三文魚(yú)和鱒魚(yú)［57］等魚(yú)類的種質(zhì)鑒定中。雖然目前尚未見(jiàn)到其在鱘魚(yú)種質(zhì)鑒定中的應(yīng)用報(bào)道，但作為一種有效的魚(yú)類種質(zhì)快速檢測(cè)技術(shù)，其發(fā)展前景十分可觀，可作為進(jìn)行鱘魚(yú)種質(zhì)鑒定的候選技術(shù)。

2.9 DNA-barcoding

DNA條形碼（DNA-barcoding）技術(shù)自加拿大動(dòng)物學(xué)家Hebert等［66］提出以來(lái)，已被廣泛應(yīng)用在鳥(niǎo)類、哺乳動(dòng)物、魚(yú)類、軟體動(dòng)物及昆蟲(chóng)等不同生物群體中。該技術(shù)主要利用線粒體COⅠ序列很少存在插入和缺失等現(xiàn)象，且長(zhǎng)度適合及進(jìn)化率低等特點(diǎn)，利用其中一段短的DNA序列作為物種快速鑒定的標(biāo)記，并希望以此建立起物種名稱（條形碼）和生物實(shí)體之間一一對(duì)應(yīng)的關(guān)系［14］。DNA條形碼技術(shù)具有鑒定過(guò)程快捷、準(zhǔn)確率高等優(yōu)點(diǎn)。

Ward等［67］利用DNA條形碼技術(shù)對(duì)澳大利亞273 種魚(yú)類的COⅠ基因序列進(jìn)行了分析，不僅成功鑒別出這些魚(yú)類，而且還對(duì)其系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)行了研究，對(duì)了解其進(jìn)化歷程提供了信息參考。程鵬等［68］對(duì)北京市懷柔區(qū)的53種魚(yú)類進(jìn)行了研究發(fā)現(xiàn)，條形碼鑒定與形態(tài)鑒定基本一致，同時(shí)DNA條形碼技術(shù)還彌補(bǔ)了傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒別的缺陷，為魚(yú)類保護(hù)以及新物種的發(fā)現(xiàn)提供了新的解決方法。

雖然DNA條形碼技術(shù)存在包括條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)缺乏、無(wú)法鑒別雜交種、條形碼價(jià)格昂貴等缺點(diǎn)，但該技術(shù)已經(jīng)成為生態(tài)學(xué)研究和物種鑒定的重要工具。同時(shí)，由于其具有的良好對(duì)應(yīng)性，即一段條形碼只對(duì)應(yīng)一個(gè)物種，使得其可能成為世界通用的種質(zhì)鑒定標(biāo)記，特別是在鱘魚(yú)魚(yú)子醬的全球貿(mào)易中具有巨大的應(yīng)用前景，將成為研究的熱點(diǎn)之一。

3 展望

與大多數(shù)魚(yú)類不同，鱘形目魚(yú)類種間甚至屬間的雜交現(xiàn)象極為普遍，且部分雜交種仍可育，產(chǎn)生三雜交后代，這為進(jìn)行鱘魚(yú)種質(zhì)鑒定造成了極大的困難。通過(guò)對(duì)上述幾種鱘魚(yú)種質(zhì)鑒別方法的綜述發(fā)現(xiàn)，目前還沒(méi)有一種方法適用于所有鱘魚(yú)品種的種質(zhì)鑒定，但可以對(duì)比幾種常用的種質(zhì)鑒定方法的優(yōu)缺點(diǎn)，利用優(yōu)缺點(diǎn)互補(bǔ)的原則通過(guò)兩種或多種方法相結(jié)合，找出最優(yōu)組合，使之適用于對(duì)所有鱘魚(yú)特別是雜交鱘品種進(jìn)行種質(zhì)鑒定。由于不能辨別父本，單獨(dú)使用遵循母系遺傳的線粒體DNA標(biāo)記不能區(qū)分出雜交鱘；而利用核DNA標(biāo)記（如微衛(wèi)星、AFLP等）雖然可以知道親本種類，但不能明確哪個(gè)是父本哪個(gè)是母本。因此，我們認(rèn)為應(yīng)該將線粒體DNA標(biāo)記與核DNA標(biāo)記結(jié)合使用，即先通過(guò)線粒體DNA標(biāo)記確定母本種類，再通過(guò)核DNA標(biāo)記確定父本種類并最終確定樣本的種類，這可能是準(zhǔn)確進(jìn)行鱘魚(yú)種質(zhì)鑒定的好方法。但是究竟選取哪些核DNA標(biāo)記以及線粒體的哪個(gè)區(qū)域進(jìn)行分析還需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。

另外，將PCR技術(shù)與高分辨率的色譜和質(zhì)譜技術(shù)相結(jié)合，可作為未來(lái)鱘魚(yú)種質(zhì)鑒定的探索方向。而具有快捷、準(zhǔn)確率高等優(yōu)點(diǎn)的實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)和DNA條形碼技術(shù)也可能成為未來(lái)鱘魚(yú)種質(zhì)鑒別，特別是魚(yú)子醬產(chǎn)品鑒別的熱點(diǎn)技術(shù)。

［1］ Chapman BB, Skov C, Hulthen K, et al. Partial migration in fishes：definitions, methodologies and taxonomic distribution［J］. Journal of Fish Biology, 2012, 81（2）：479-499.

［2］ Simeanu C, Simeanu D, Pasarin B. Research on physic-chemical indices of the meat of the sturgeon species polyodon spathula［J］. University of Agricultural Sciences and Veterinary Medicine Iasi, 2012, 57：230-233.

［3］ Gessner J, Wirth M, Kirschbaum F, et al. Caviar composition in wild and cultured sturgeons impact of food sources on fatty acid composition and contaminant load［J］. Journal of Applied Ichthyology, 2002, 18（4-6）：665-672.

［4］ Waldman JR. Sturgeons and paddlefishes：a convergence of biology, politics, and greed［J］. Fisheries, 1995, 20（9）：20-21.

［5］ Steffens W, Jahnichen H, Fredrich F. Possibilities of sturgeon culture in Central Europe［J］. Aquaculture, 1990, 89（2）：101-122.

［6］ Ludwig A. Identification of Acipenseriformes species in trade［J］. Journal of Applied Ichthyology, 2008, 24（s1）：2-19.

［7］ Gardiner BG. Sturgeons as living fossils［M］. New York：Springer New York, 1984：148-152.

［8］ Billard R, Lecointre G. Biology and conservation of sturgeon and paddlefish［J］. Reviews in Fish Biology and Fisheries, 2000, 10（4）：355-392.

［9］ Bemis WE, Findeis EK. The sturgeons’ plight［J］. Nature, 1994,370（6491）：602-602.

［10］ Bemis WE, Findeis EK, Grande L. An overview of Acipenseriformes［J］. Environmental Biology of Fishes, 1997, 48（1-4）：25-71.

［11］ Russell ES. Form and function：a contribution to the history of animal marphology［M］. London：Murray J, 1916.

［12］ 董志國(guó), 常玉梅. 魚(yú)類種質(zhì)鑒定的主要技術(shù)與方法［J］. 水產(chǎn)學(xué)雜志, 2002, 15（2）：74-77.

［13］ Vasil’Eva ED. Some morphological characteristics of Acipenserid fishes：considerations of their variability and utility in taxonomy［J］. Journal of Applied Ichthyology, 1999, 15（4-5）：32-34.

［14］ Artyukhin EN. Morphological phylogeny of the order Acipenseriformes［J］. Journal of Applied Ichthyology, 2006, 22（s1）：66-69.

［15］ 陳細(xì)華.鱘形目魚(yú)類生物學(xué)與資源現(xiàn)狀［M］.北京：海洋出版社, 2007.

［16］ Zexia G, Weimin W, Yi Y, et al. Morphological studies of peripheral blood cells of the Chinese sturgeon, Acipenser sinensis［J］. Fish Physiology and Biochemistry, 2007, 33（3）：213-222.

［17］ Artyukhin EN, Vecsei P, Peterson DL. Morphology and ecology of Pacific sturgeons［J］. Environmental Biology of Fishes, 2007, 79（3-4）：369-381.

［18］ 張穎, 劉曉勇, 曲秋芝, 等. 達(dá)氏鰉, 施氏鱘及其雜交種（施氏鱘♂× 達(dá)氏鰉♀）形態(tài)差異與判別分析［J］. 淡水漁業(yè), 2012, 42（6）：27-32.

［19］ Bostein B, White RL, Skolnick M, et al. Construction of a genetic linkage map in manusing restriction fragment length polymorphisms［J］.American Journal of Human Genetics, 1980, 31（3）：314-331.

［20］ Russell VJ, Hold GL, Pryde SE, et al. Use of restriction fragment length polymorphism to distinguish between salmon species［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2000, 48（6）：2184-2188.

［21］ Quinteiro J, Sotelo CG, Rehbein H, et al. Use of mtDNA direct polymerase chain reaction（PCR）sequencing and PCR-restriction fragment length polymorphism methodologies in species identification of canned tuna［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1998, 46（4）：1662-1669 .

［22］ Cocolin L, D’Agaro E, Manzano M, et al. Rapid PCR-RFLP method for the identification of marine fish fillets（seabass, seabream, umbrine, and dentex）［J］. Journal of Food Science, 2000, 65（8）：1315-1317.

［23］ Aranishi F, Okimoto T, Izumi S. Identification of gadoid species（Pisces, Gadidae）by PCR-RFLP analysis［J］. J Appl Genet, 2005, 46（1）：69-73.

［24］ Wolf C, Hubner P, Luthy J. Differentiation of sturgeon species by PCR-RFLP［J］. Food Research International, 1999, 32（10）：699-705.

［25］ Ludwig A, Debus L, Jenneckens I. A molecular approach to control the international trade in black caviar［J］. International review of hydrobiology, 2002, 87（5-6）：661-674.

［26］ Orita M, Iwahana H, Kanazawa H, et al. Detection of polymorphisms of human DNA by gel electrophoresis as single-strand conformation polymorphisms［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1989, 86（8）：2766-2770.

［27］ 張學(xué), 孫開(kāi)來(lái). PCR-SSCP分析技術(shù)及其應(yīng)用［J］.國(guó)際遺傳學(xué)雜志, 1992, 5：225-231.

［28］ 李玉梅, 姚紀(jì)元, 吳靜, 等. PCR- SSCP 技術(shù)的研究及應(yīng)用進(jìn)展［J］.生物技術(shù)通報(bào), 2007（6）：71-74.

［29］ Hara M, Noguchi M, Naito E, et al. Ribosomal RNA gene typing of fish genome using PCR-SSCP［polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism］method［J］. Bulletin of the Japan Sea National Fisheries Research Institute, 1994, 44：131-138.

［30］ Rehbein H, Mackie IM, Pryde S, et al. Fish species identification in canned tuna by DNA analysis（PCR-SSCP）［J］. Inf Fischereiforsch, 1995, 42（4）：209-212.

［31］ Rehbein H, Kress G, Schmidt T. Application of PCR-SSCP to species identification of fishery products［J］. Journal of the Science of Food and Agriculture, 1997, 74（1）：35-41.

［32］ Rehbein H, Gonzales-Sotelo C, Perez-Martin R, et al. Differentiation of sturgeon caviar by single strand conformation polymorphism（PCR-SSCP）analysis［J］. Archiv Fur Lebensmittelhygiene, 1999, 50：13-16.

［33］ Williams JG, Kubelik AR, Livak KJ, et al. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers［J］. Nucleic Acids Research, 1990, 18（22）：6531-6535.

［34］ Welsh J, McClelland M. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers［J］. Nucleic Acids Research, 1990, 18（24）：7213-7218.

［35］ Dong Z, Zhou E. Application of the random amplified polymorphicDNA technique in a study of heterosis in common carp, Cyprinus carpio L.［J］. Aquaculture Research, 1998, 29（8）：595-600.

［36］ Chong LK, Tan SG, Yusoff K, et al. Identification and characterization of Malaysian river catfish, Mystus nemurus（C&V）：RAPD and AFLP analysis［J］. Biochemical Genetics, 2000, 38（3-4）：63-76.

［37］ Bardakci F, Skibinski DO. Application of the RAPD technique in tilapia fish：species and subspecies identification［J］. Heredity, 1994, 73：117.

［38］ Foo CL, Dinesh KR, Lim TM, et al. Inheritance of RAPD markers in the guppy fish, Poecilia reticulata［J］. Zoological Science, 1995, 12（5）：535-541.

［39］ Van Eenennaam AL, Van Eenennaam JP, Medrano JF, et al. Rapid verification of meiotic gynogenesis and polyploidy in white sturgeon［J］. Aquaculture, 1996, 147（3）：177-189.

［40］ Rezvani Gilkolaei S. Molecular population genetic studies of sturgeon species in the South Caspian Sea［D］. Wales, University of Swansea, 1997.

［41］ Barmintsev VA, Chudinov OS, Abramova AB. Molecular and biological methods of identification and certification of sturgeons and their products［J］. Fish Farming and Fishing, 2001, 1：70-71.

［42］ Zabeau M, Vos P. Selective restriction fragment amplification：a general method for DNA fingerprinting：European, 0534858［P］. 2005-4-27.

［43］ Young WP, Wheeler PA, Coryell VH, et al. A detailed linkage map of rainbow trout produced using doubled haploids［J］. Genetics, 1998, 148（2）：839-850.

［44］ Liu Z, Nichols A, Li P, et al. Inheritance and usefulness of AFLP markers in channel catfish（Ictalurus punctatus）, blue catfish（I. furcatus）, and their F1, F2, and backcross hybrids［J］. Molecular and General Genetics MGG, 1998, 258（3）：260-268.

［45］ Agresti JJ, Seki S, Cnaani A, et al. Breeding new strains of tilapia：development of an artificial center of origin and linkage map based on AFLP and microsatellite loci［J］. Aquaculture, 2000, 185（1）：43-56.

［46］ Congiu L, Dupanloup I, Patarnello T, et al. Identification of interspecific hybrids by amplified fragment length polymorphism：the case of sturgeon［J］. Molecular Ecology, 2001, 10（9）：2355-2359.

［47］ Congiu L, Fontana F, Patarnello T, et al. The use of AFLP in sturgeon identification［J］. Journal of Applied Ichthyology, 2002, 18（4-6）：286-289.

［48］ Litt M, Luty JA. A hypervariable microsatellite revealed by in vitro amplification of a dinucleotide repeat within the cardiac muscle actin gene［J］. Ame J Hum Genet, 1989, 44（3）：397-401.

［49］ 楊述林, 王志剛, 樊斌, 等.微衛(wèi)星及其功能研究［J］.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué), 2003, 6：91-93.

［50］ Maltagliati F, Lai T, Casu M, et al. Identification of endangered Mediterranean cyprinodontiform fish by means of DNA inter-simple sequence repeats（ISSRs）［J］. Biochemical Systematics and Ecology, 2006, 34（8）：626-634.

［51］ Jenneckens I, Meyer JN, Horstgen-Schwark G, et al. A fixed allele at microsatellite locus LS-39 exhibiting species-specificity for the black caviar producer Acipenser stellatus［J］. Journal of Applied Ichthyology, 2001, 17（1）：39-42.

［52］ 胡佳, 汪登強(qiáng), 危起偉, 等. 施氏鱘, 達(dá)氏鰉及其雜交子代的分子鑒定［J］.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué), 2010, 17（1）：21-30.

［53］ Sato M, Sato K. Degradation of paternal mitochondria by fertilization-triggered autophagy in C. elegans embryos［J］. Science, 2011, 334（6059）：1141-1144.

［54］ Hubalkova Z, Kralik P, Kasalova J, et al. Identification of gadoid species in fish meat by polymerase chain reaction（PCR）on genomic DNA［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2008, 56（10）：3454-3459.

［55］ Lin WF, Hwang DF. A multiplex PCR assay for species identification of raw and cooked bonito［J］. Food Control, 2008, 19（9）：879-885.

［56］ Mendonca FF, Hashimoto DT, Porto-Foresti F, et al. Identification of the shark species Rhizoprionodon lalandii and R. porosus（Elasmobranchii, Carcharhinidae）by multiplex PCR and PCRRFLP techniques［J］. Mol Ecol Resour, 2009, 9（3）：771-773.

［57］ Rasmussen Hellberg RS, Morrissey MT, Hanner RH. A multiplex PCR method for the identification of commercially important salmon and trout species（Oncorhynchus and Salmo）in North America［J］. J Food Sci, 2010, 75（7）：C595-C606.

［58］ DeSalle R, Birstein VJ. PCR identification of black caviar［J］. Nature, 1996, 381：197-198.

［59］ Birstein VJ, Doukakis P, Sorkin B, et al. Population aggregation analysis of three caviar-producing species of sturgeons andimplications for the species identification of black caviar［J］. Conservation Biology, 1998, 12（4）：766-775.

［60］ Mugue NS, Barmintseva AE, Rastorguev SM, et al. Polymorphism of the mitochondrial DNA control region in eight sturgeon species and development of a system for DNA-based species identification［J］. Russian Journal of Genetics, 2008, 44（7）：793-798.

［61］ Higuchi R, Fockler C, Dollinger G, et al. Kinetic PCR analysis：real-time monitoring of DNA amplification reactions［J］. Biotechnology, 1993, 11：1026-1030.

［62］ Hird HJ, Hold GL, Chisholm J, et al. Development of a method for the quantification of haddock（Melanogrammus aeglefinus）in commercial products using real-time PCR［J］. European Food Research and Technology, 2005, 220（5-6）：633-637.

［63］ Sanchez A, Quinteiro J, Rey-Mendez M, et al. Identification of European hake species（Merluccius merluccius）using real-time PCR［J］. J Agric Food Chem, 2009, 57（9）：3397-3403.

［64］ Herrero B, Madrinan M, Vieites JM, et al. Authentication of Atlantic cod（Gadus morhua）using real time PCR［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2010, 58（8）：4794-4799.

［65］ Lopez I, Pardo MA. Application of relative quantification TaqMan real-time polymerase chain reaction technology for the identification and quantification of Thunnus alalunga and Thunnus albacares［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2005, 53（11）：4554-4560.

［66］ Hebert PD, Cywinska A, Ball SL. Biological identifications through DNA barcodes［J］. Proc Biol Sci, 2003, 270（1512）：313-321.

［67］ Ward RD, Zemlak TS, Innes BH, et al. DNA barcoding Australia’s fish species［J］. Philosophical Transactions of the Royal Society B：Biological Sciences, 2005, 360（1462）：1847-1857.

［68］ 程鵬, 張愛(ài)兵, 王忠鎖. 微型DNA條形碼在魚(yú)類識(shí)別上的應(yīng)用［J］.首都師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版, 2012, 33（2）：47-52.

（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Research Progresses of Germplasm Identification Methods in Sturgeons

Guo Xianghe1，2Dong Ying2Hu Hongxia2Zhao Yanzhen1
（1. Ocean College，Agricultural University of Hebei，Qinhuangdao 066003；2. Beijing Fisheries Research Institute，Beijing 100068）

Sturgeon is a kind of large economic fish. Due to overharvesting, habitat destruction and their biological characteristics such as sexual maturation at a late age and low survival rate of larvae, sturgeon natural resources in the world were depleting. In order to meet the needs of sturgeon caviar and meat, artificial cultivations were developed and had been the main source of sturgeon products. So far, there was not yet a perfect germplasm identification method in sturgeons at home and abroad. Some common sturgeon germplasm identification methods were summarized. The advantages and disadvantages of each method were analyzed and listed. It was helpful to establish a stable and reliable sturgeon germplasm identification method.

Sturgeon Germplasm Identification methods

2013-08-26

北京市科技計(jì)劃（D121100003712002），北京市鱘魚(yú)鮭鱒魚(yú)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（SCGWZJ 20121102-1），科技部支撐計(jì)劃（2012BAD26B05）

郭向賀，男，碩士研究生，研究方向：魚(yú)類遺傳育種；E-mail：guoxianghe@126.com

胡紅霞，女，博士，研究員，研究方向：魚(yú)類遺傳育種；E-mail：huhongxia@bjfishery.com

趙艷珍，女，副教授，研究方向：水生生物種質(zhì)資源和漁業(yè)環(huán)境及其調(diào)控；E-mail：zhaoyanzhen5532@163.com