張學(xué)麗，肖紅俠，吳 琦

(天津市海河醫(yī)院，天津300350)

結(jié)核病嚴(yán)重影響人類健康，抗結(jié)核藥物的出現(xiàn)使結(jié)核病得到有效控制，但近10年，結(jié)核病疫情迅速回升，尤其耐藥結(jié)核病的流行，為結(jié)核病疫情的控制帶來(lái)更大的挑戰(zhàn)。有研究［1，2］表明，結(jié)核分枝桿菌菌壁缺失變異形成L型后可長(zhǎng)期潛伏于宿主體內(nèi)導(dǎo)致結(jié)核病復(fù)燃。同時(shí)有研究［3］表明，結(jié)核分枝桿菌L型是導(dǎo)致結(jié)核菌耐藥的原因之一。本研究觀察了結(jié)核分支桿菌L型的誘導(dǎo)及其對(duì)抗菌藥物的敏感性?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 結(jié)核分枝桿菌菌株 由標(biāo)準(zhǔn)結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株以比濁法稀釋成1億個(gè)菌細(xì)胞/mL的菌液備用。

1.2 培養(yǎng)基 由美國(guó)BD公司提供的960培養(yǎng)基作為結(jié)核分枝桿菌誘導(dǎo)培養(yǎng)基，按照文獻(xiàn)［4］配制培養(yǎng)基作為培養(yǎng)L型菌的非高滲培養(yǎng)基。用蒸餾水分別稀釋抗結(jié)核藥物利福平、異煙肼、乙胺丁醇的藥物原粉(Sigma公司)并加入BD960培養(yǎng)基，使其在每毫升培養(yǎng)基內(nèi)的終濃度分別為:0.05、0.1、0.2 μg利福平，0.01、0.04、0.08 μg 異煙肼，1、2.5、5 μg 乙胺丁醇。并用蒸餾水稀釋抗菌藥物原粉分別加入羅氏培養(yǎng)基及非高滲培養(yǎng)基內(nèi)，使藥物最終的質(zhì)量濃度分別為:4 μg/mL 鏈霉素、0.2 μg/mL 異煙肼、40 μg/mL 利福平、2 μg/mL 乙胺丁醇、30 μg/mL 卡那霉素、1 μg/mL 對(duì)氨基水楊酸、40 μg/mL 卷曲霉素、3 μg/mL 氧氟沙星。

1.3 L型菌判定標(biāo)準(zhǔn) 結(jié)核分支桿菌L型菌株為煎蛋樣菌落，在高倍鏡下為圓球、卵圓或不規(guī)則形態(tài)，半透明或不透明，單個(gè)或鏈狀排列，沉于瓶底，不運(yùn)動(dòng)，不粘附瓶壁?？顾崛旧?jiàn)結(jié)核分支桿菌L型細(xì)胞為抗酸染色陰性，革蘭染色可見(jiàn)體積較小的L型細(xì)胞呈革蘭陰性，體積較大的L型細(xì)胞則為革蘭陽(yáng)性。

1.4 結(jié)核分枝桿菌L型的誘導(dǎo)與分離 將結(jié)核分枝桿菌接種于含不同濃度的異煙肼、利福平、乙胺丁醇的BD960液體培養(yǎng)基，置溫箱37℃培養(yǎng)10 d后行抗酸染色，顯微鏡高倍鏡下觀察L型形成情況。之后用0.22 μm孔徑濾菌器過(guò)濾培養(yǎng)物，將濾過(guò)物接種于不含任何藥物的非高滲培養(yǎng)基內(nèi)37℃培養(yǎng)并逐日觀察L型生長(zhǎng)情況。L型密集生長(zhǎng)(14～20/d)后，取培養(yǎng)物傳3代培養(yǎng)后作革蘭染色、抗酸染色后鏡檢。同時(shí)將結(jié)核分枝桿菌接種于不含藥物的BD960液體培養(yǎng)基內(nèi)，置溫箱37℃培養(yǎng)10 d后行抗酸染色，顯微鏡高倍鏡下觀察細(xì)菌型及L型形成情況。取培養(yǎng)物接種改良羅氏培養(yǎng)基置溫箱內(nèi)37℃分離培養(yǎng)。

1.5 結(jié)核分枝桿菌L型對(duì)抗菌藥物的敏感性檢測(cè)將結(jié)核分枝桿菌細(xì)菌型菌液及其L型的傳代純培養(yǎng)物分別接種于含不同抗菌藥物的羅氏培養(yǎng)基及非高滲培養(yǎng)基內(nèi)，肉眼及顯微鏡觀察結(jié)核分枝桿菌及其L型的生長(zhǎng)情況，并用比例法判斷結(jié)核分枝桿菌細(xì)菌型及L型的藥物敏感性。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)核分枝桿菌L型的誘導(dǎo)形成 培養(yǎng)10 d后，顯微鏡高倍鏡下觀察，0.05 μg 利福平、0.01 μg異煙肼、1 μg乙胺丁醇培養(yǎng)基內(nèi)均未見(jiàn)L型菌形成，但可見(jiàn)大量細(xì)菌型生長(zhǎng);而其他濃度藥物培養(yǎng)基內(nèi)均可見(jiàn)L型菌形成，同時(shí)均可見(jiàn)有細(xì)菌型生長(zhǎng)，其中 0.2 μg/mL 利福平、0.08 μg/mL 異煙肼、5 μg/mL乙胺丁醇的藥物培養(yǎng)基內(nèi)的L型菌數(shù)量最多。0.1、0.2 μg/mL 利福平，0.04、0.08 μg/mL 異煙肼，2.5、5 μg/mL乙胺丁醇培養(yǎng)基的濾過(guò)液有典型油煎蛋樣菌落，顯微鏡下可見(jiàn)為L(zhǎng)型菌生長(zhǎng)，未見(jiàn)細(xì)菌型生長(zhǎng)。高倍鏡下可見(jiàn)L型結(jié)核分枝桿菌為圓形、短桿形、不規(guī)則形，革蘭氏染色陰性;短桿形革蘭氏染色為陽(yáng)性，抗酸染色為淡染。

結(jié)核分支桿菌在不含抗結(jié)核藥物的BD960液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d后肉眼可見(jiàn)培養(yǎng)基微混濁，10 d后顯微鏡高倍鏡下可見(jiàn)細(xì)菌型大量生長(zhǎng)，未見(jiàn)L型細(xì)胞。涂片抗酸染色可見(jiàn)典型形態(tài)的抗酸桿菌，接種改良羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)7～10 d后可見(jiàn)結(jié)核分支桿菌菌落生長(zhǎng)。

2.2 結(jié)核分枝桿菌L型對(duì)抗菌藥物的敏感性 結(jié)核分枝桿菌細(xì)菌型在含有上述不同抗菌藥物的羅氏培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)14 d后均未見(jiàn)細(xì)菌型生長(zhǎng)，但含有鏈霉素的培養(yǎng)基內(nèi)可見(jiàn)L型形成，培養(yǎng)30 d后均未見(jiàn)細(xì)菌型及L型生長(zhǎng)。結(jié)核分枝桿菌L型在含有鏈霉素、異煙肼、利福平、乙胺丁醇、對(duì)氨基水楊酸的非高滲培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)7 d后均可見(jiàn)其生長(zhǎng)，而含有卡那霉素、卷曲霉素、氧氟沙星的培養(yǎng)基內(nèi)未見(jiàn)生長(zhǎng)。

3 討論

異煙肼、利福平、乙胺丁醇作為一線抗結(jié)核藥物被廣泛應(yīng)用于抗結(jié)核治療，對(duì)結(jié)核病控制起到積極作用，它們主要是通過(guò)干擾結(jié)核分支桿菌的核酸、脂肪或蛋白質(zhì)代謝而對(duì)繁殖期的結(jié)核分支桿菌產(chǎn)生抑制作用［5］。結(jié)核分枝桿菌L型是細(xì)胞壁缺陷的結(jié)核分枝桿菌，通常認(rèn)為細(xì)菌在干擾細(xì)胞壁肽聚糖合成或破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的抗生素等因素的作用下，可發(fā)生細(xì)胞壁缺陷和形成L型［6］。細(xì)胞壁缺陷造成細(xì)菌喪失了抗生素作用的靶位，因此可對(duì)干擾細(xì)胞壁合成的抗菌藥物形成非遺傳性耐藥性［6］。本文結(jié)果顯示，中高濃度的異煙肼、利福平、乙胺丁醇對(duì)結(jié)核分枝桿菌細(xì)菌型具有抑制和殺滅作用，同時(shí)可誘導(dǎo)結(jié)核分枝桿菌L型形成并且獲得耐藥性。提示結(jié)核分枝桿菌是容易發(fā)生細(xì)胞壁缺陷的細(xì)菌，其可在許多因素的作用下發(fā)生細(xì)胞壁缺陷變異和成為L(zhǎng)型。與王和等［7］實(shí)驗(yàn)結(jié)果相比，低濃度抗結(jié)核藥物不能對(duì)結(jié)核分枝桿菌的細(xì)菌型產(chǎn)生抑制和殺滅作用，也不能誘導(dǎo)形成結(jié)核分枝桿菌L型形成，有可能與抗結(jié)核藥物的濃度低于其對(duì)結(jié)核分枝桿菌的抑菌濃度有關(guān)，這有待試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。濃度升高后抗結(jié)核藥物顯現(xiàn)出對(duì)結(jié)核分枝桿菌的抑制作用，同時(shí)也導(dǎo)致L型形成，L型的產(chǎn)生使結(jié)核分枝桿菌形成對(duì)利福平、異煙肼、乙胺丁醇的耐藥，這樣不但可導(dǎo)致臨床抗結(jié)核藥物治療無(wú)效，而且也可造成結(jié)核分枝桿菌在宿主體內(nèi)潛伏存在和形成結(jié)核的潛在帶菌者與傳染源。

結(jié)核分枝桿菌L型可長(zhǎng)期潛伏于宿主體內(nèi)導(dǎo)致疾病進(jìn)入慢性過(guò)程，在一定條件下可以返祖造成結(jié)核病復(fù)發(fā)。本文結(jié)果可見(jiàn)，結(jié)核分枝桿菌L型對(duì)氨基糖甙類、喹諾酮等抗菌藥物敏感。胡忠義［8］報(bào)道結(jié)核分枝桿菌L型對(duì)鏈霉素、紅霉素、氧氟沙星、諾氟沙星等抗菌藥物均敏感，而對(duì)傳統(tǒng)的抗結(jié)核藥物利福平、異煙肼、乙胺丁醇不再敏感。張世馥等［9］、馬筱玲等［10］經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)結(jié)核分枝桿菌轉(zhuǎn)變?yōu)長(zhǎng)型后致病性大為減輕，引起的癥狀與病理變化很不典型，在臨床上容易引起漏診與誤診。以上這些因素有可能導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌L型長(zhǎng)期潛伏體內(nèi)，并導(dǎo)致疾病呈慢性過(guò)程或復(fù)發(fā)、惡化。馬筱玲等［11］經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，結(jié)核分枝桿菌細(xì)菌型與L型之間能相互變換，L型菌在一定條件下可逐漸回復(fù)成典型分枝桿菌，這也說(shuō)明結(jié)核分枝桿菌L型是結(jié)核感染過(guò)程中持續(xù)存在的一種型式。結(jié)核分枝桿菌L型與結(jié)核病復(fù)發(fā)、惡化有一定關(guān)系［12］。若在患者就診時(shí)同時(shí)進(jìn)行細(xì)菌型和L型培養(yǎng)，并對(duì)結(jié)核分枝桿菌L型培養(yǎng)陽(yáng)性結(jié)核患者進(jìn)行抗結(jié)核分枝桿菌L型治療，對(duì)提高結(jié)核病治愈率，減少?gòu)?fù)治或復(fù)發(fā)可能有一定的幫助。

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