陳滿軍，洪文娟，洪志鵬

(昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，昆明650032)

近年來，對血管內(nèi)皮細(xì)胞(VEC)的研究已從靜態(tài)轉(zhuǎn)移到模擬人體血液剪切力的動態(tài)上來。目前研究成果表明，剪切力把信號傳遞到VEC內(nèi)引起細(xì)胞的反應(yīng)，對血液凝固、纖維蛋白溶解、血管重建有重要意義。血液剪切力發(fā)生變化時，VEC會做出一系列應(yīng)答，從而可能引發(fā)一些心血管疾?。?］。因此，通過對剪切力影響下VEC的形態(tài)和分子水平的研究，可為心血管疾病的預(yù)防、治療及生物工程血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)提供新的思路［2，3］。本文就剪切力和VEC的作用關(guān)系作一綜述。

1 血液剪切力對VEC形態(tài)的影響

在體外靜態(tài)培養(yǎng)的VEC融合成單層后整體成鋪路石樣排列，單個細(xì)胞呈三角形、橢圓形或多角形，細(xì)胞排列隨意，無規(guī)律性［4］。當(dāng)血液快速而單向地通過血管時，VEC在血液剪切力的作用下呈紡錘形或梭形生長，其長軸與血液流動的方向平行［5，6］。然而，在血液剪切力作用下，VEC 的這一特征性變化是通過肌動蛋白骨架重組、肌動蛋白微絲重新排列與剪切力的方向?qū)R一致而達(dá)成的。VEC的骨架系統(tǒng)是由微絲、微管、中間絲形成的網(wǎng)絡(luò)與相關(guān)蛋白一起而構(gòu)成的聯(lián)合結(jié)構(gòu)，而肌動蛋白是微絲的主要成分［7，8］。肌動蛋白網(wǎng)絡(luò)是主要承受張力的細(xì)胞骨架成分，含肌動蛋白的微絲在細(xì)胞形狀的確定中起主要作用［9］。剪切力作用下VEC細(xì)胞骨架的變化除改變其形態(tài)和排列外，還涉及其通透性、遷移和增殖以及生物活性物質(zhì)的合成釋放等系列細(xì)胞功能［10］。大量研究表明，剪切力通過激活一系列的力學(xué)感受器和信號分子形成網(wǎng)絡(luò)信號通路對VEC和細(xì)胞骨架進(jìn)行調(diào)控［11～13］。

2 血液剪切力對VEC力學(xué)感受器的影響

VEC通過細(xì)胞膜上的力學(xué)感受器來感受血液剪切力的變化，把機(jī)械信號轉(zhuǎn)化為化學(xué)信號，實現(xiàn)對VEC和細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)。近年來的研究認(rèn)為，細(xì)胞膜上的力學(xué)感受器主要有以下幾類。

2.1 整合素 整合素是一類跨膜蛋白受體家族，連接細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)與細(xì)胞骨架，由α和β兩個亞單位組成，兩個亞單位的胞質(zhì)面對于整合素實現(xiàn)整個分子功能有重要作用。整合素介導(dǎo)的黏附或分子集聚，導(dǎo)致酪氨酸磷酸化。而局部黏著斑激酶(FAK)C端被稱為局部黏附的靶序列，負(fù)責(zé)FAK與整合素的結(jié)合［14］。FAK能與許多其他的信號分子和結(jié)構(gòu)蛋白結(jié)合，如銜接蛋白(c-Src)、細(xì)胞骨架蛋白(裸蛋白和輔肌動蛋白-α形成黏附斑復(fù)合物(FACS)，激活觸發(fā)了一系列的第二信使酶鏈反應(yīng);或者直接激活絲裂酶原活化蛋白激酶(MAPK)聯(lián)級反應(yīng)，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的生長［15］。

2.2 受體酪氨酸激酶(RTKs)RTKs可分為20個亞科。RTKs有一個跨膜域，它在結(jié)構(gòu)上提供了錨定受體位點負(fù)責(zé)酪氨酸磷酸化。RTKs可以感受血液剪切力，觸發(fā)單體二聚作用改變在細(xì)胞膜上的構(gòu)象［16］。酪氨酸激酶被激活使得內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮合成酶(eNOS)促進(jìn)一氧化氮(NO)產(chǎn)生;另外，RTKs家族中的PDGFRa作用位點在Y720，通過結(jié)合 Shb、Shf、Grb2、SHP-2 等蛋白激活 Rac/Ras通路使得細(xì)胞骨架重排［17］。

2.3 離子通道 各類型的離子通道也被認(rèn)為是VEC對剪切力的力學(xué)感受器，在剪切力作用下通道被激活、開放。研究顯示，許多離子通道是剪切力反應(yīng)型的。例如，瞬時受體勢離子(TRP)通道，是最大的離子通道家族之一，幾乎所有的TRP通道都是由4個同質(zhì)或異質(zhì)的TRP亞單位組成。剪切力激活TRP后通過第二信使系統(tǒng)，如二酯酰甘油 (DAG)、多不飽和脂肪酸 (PUFA)、磷脂酰肌醇(PLC)、鈣離子等傳遞來的信號［18～20］。

2.4 原纖毛 原纖毛是膜覆蓋的棒狀細(xì)胞器從細(xì)胞表面的凸出。原纖毛的核心由9個偶極微管通過微管中心進(jìn)入胞質(zhì)。原纖毛作為可能的剪切應(yīng)力傳感器，目前提出了兩種機(jī)制解釋初級纖毛如何識別剪切應(yīng)力:一種機(jī)制是彎曲原纖毛感受剪應(yīng)力誘發(fā)細(xì)胞骨架變形，原纖毛功能作為一個杠桿;另一個是彎曲的原纖毛激活離子通道，導(dǎo)致細(xì)胞外鈣離子的流入［21～23］。

2.5 內(nèi)皮細(xì)胞小窩(Caveolae) Caveolae位于VEC膜上，長度為50～100 nm。Caveolae能感受剪切應(yīng)力的變化，是力傳導(dǎo)感受器，并介導(dǎo)VEC鈣信號和氧化還原信號［24］。一些研究發(fā)現(xiàn)，剪切力刺激下小窩附近會出現(xiàn)鈣離子內(nèi)流，使得eNOS快速的釋放到細(xì)胞質(zhì)中從而產(chǎn)生NO［25］。利用ATP成像技術(shù)，可以看到ATP釋放集中在小窩區(qū)域［26］。另外，細(xì)胞內(nèi)皮屏障功能依賴于Caveolae和肌動蛋白的結(jié)合［27］。

2.6 G蛋白 G蛋白是一個膜內(nèi)側(cè)的異型三聚體家族，該家族成員均與一類跨膜的受體蛋白直接作用，可引起膜脂質(zhì)分解、產(chǎn)生環(huán)磷鳥苷(cGMP)以及引起鈣離子的變化，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞內(nèi)的各種磷酸化過程。剪切力被證明在無蛋白受體區(qū)域能激活純化G蛋白脂質(zhì)體的重組，這也表明G蛋白本身也是一個剪切力感受器［28］。利用熒光共振實時分子成像技術(shù)，剪切應(yīng)力引起緩激肽B2、G蛋白耦合受體(GPCRs)構(gòu)象改變［29］。

3 剪切力對VEC作用的信號通路

研究表明，血液剪切力通過VEC剪切力感受器激活多條分子信號形成網(wǎng)絡(luò)通路，包括有蛋白激酶C(PKC)、Rho家族小三磷酸鳥苷(GTP)酶家族、MAPK、FAK、NF-κB、c-Src、磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)等實現(xiàn)信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)。

3.1 PKC通路 PKC屬于肌醇磷脂依賴性絲/蘇氨酸激酶家族，作為一種重要的蛋白激酶和細(xì)胞內(nèi)信號分子，可作用于多種底物。例如，細(xì)胞骨架蛋白等激活后直接引起該骨架蛋白的磷酸化，調(diào)節(jié)該細(xì)胞骨架蛋白的功能。PKC可通過增加黏著斑激酶的活性、促進(jìn)整合素的堿性化及調(diào)節(jié)其他蛋白質(zhì)的功能而促進(jìn)黏著斑(FA)形成。當(dāng)胞內(nèi)二脂酰甘油(DAG)和鈣離子水平的增加使PKC構(gòu)象發(fā)生變化，使細(xì)胞表面有更多的整合素 β1。黏著斑蛋白是PKC重要的底物，結(jié)合后可促進(jìn)更多的黏著斑蛋白形成;另一方面，PKC通過磷酸化Rho-鳥嘌呤分離抑制因子(GDI)，誘導(dǎo)調(diào)節(jié)Rac的活化和轉(zhuǎn)位［30］。

3.2 GTP酶通路 GTP酶屬于 Ras超家族，包括Cdc42、Rac、Rho。Rho結(jié)合二磷酸鳥苷(GDP)時無活性，結(jié)合GTP時恢復(fù)活性激活下游效應(yīng)器增加細(xì)胞收縮、FA和應(yīng)力纖維的形成。剪切力誘導(dǎo)RhoA的激活需要整合素ECM［7］，RhoA促進(jìn)C-jun氨基末端激酶/激活蛋白-1(JNK/AP-1)、NF-κB、c-fos 的激活［31～33］。RhoA增加細(xì)胞收縮局部粘連，和肌動蛋白纖維形成張力;Cdc42調(diào)節(jié)絲狀偽足的形成;Rac調(diào)節(jié)細(xì)胞膜板狀偽足的形成。Rho/Rho依賴性激酶(ROCK)信號通路有重要的作用，ROCK位于肌動蛋白收縮核心，磷酸化肌球蛋白直接刺激收縮。ROCK1/2通過與RhoA結(jié)合引起應(yīng)力纖維的形成。

3.3 MAPK通路 MAPK是激酶家族，包括有ERK、JNK、p38激酶。這些激酶通過蘇氨酸/酪氨酸殘基雙磷酸化，進(jìn)而激活調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長分化。剪切力能激活MAPK，其中ERK有廣泛的催化活性，是細(xì)胞對外信號反應(yīng)的上游關(guān)鍵位點。剪切力變化能啟動MAPK和NF-κB途徑而引起后續(xù)的聯(lián)級反應(yīng)，ERK1/2依賴c-fos基因作用的靶基因是作為cAMP應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(CREB)啟動子的cAMP應(yīng)答元件(CRE)/AP-1 型元件［34］。

3.4 FAK FAK參與蛋白與蛋白的相互作用，是眾多磷酸化的位點之一;它是一個理想的力學(xué)信號傳到的錨定位點，與多個細(xì)胞表面受體和信號蛋白調(diào)節(jié)的對剪切力的應(yīng)答。FAK現(xiàn)在被視為整合素和生長因子介導(dǎo)的信號通路一個集合點［35，36］。FAK通過SH2結(jié)構(gòu)域與胞內(nèi)信號分子非受體酪氨酸激酶(Src)和PI3K結(jié)合磷酸化，定位在肌動蛋白CSK區(qū)域，引導(dǎo)整合素介導(dǎo)的信號通路。從而激活觸發(fā)了一系列的第二信使酶鏈反應(yīng);FAK或者直接激活MAPK聯(lián)級反應(yīng)。FAK激活的會造成 NF-κB磷酸化［37］。

3.5 NF-κB NF-κB 參與調(diào)控免疫學(xué)和炎癥反應(yīng)的基因表達(dá)，其活性可被IκB蛋白所抑制，不能進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)。NF-κB的激活是在翻譯后水平進(jìn)行的，主要通過其抑制物IκB降解實現(xiàn)的。剪切力可以使IκB磷酸化，蛋白酶迅速降解;NF-κB激活進(jìn)入到細(xì)胞核內(nèi)［38］結(jié)合于其靶基因的啟動子或增強(qiáng)子上，迅速誘導(dǎo)靶基因mRNA的合成，從而誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡和炎癥因子的表達(dá)。肌動蛋白骨架的穩(wěn)定與NF-κB 的激活有密切聯(lián)系［39］。

3.6 PI3K/Akt通路 PI3K可以磷酸化肌醇磷脂肌醇環(huán)上的3'-OH，是一個包括許多脂質(zhì)激酶的家族，包含有相對分子質(zhì)量為85 kD的調(diào)節(jié)亞基和110 kD的催化亞基，PI3K激活后產(chǎn)生磷酸肌醇。Akt是一種Ser/Thr蛋白激酶，又稱作PKB，是PI3K重要的下游分子;與磷酸肌醇結(jié)合后，會促進(jìn)eNOS磷酸化和NO的產(chǎn)生［40］。通過研究，在剪切力的作用下PI3K能在15 s內(nèi)激活［41］，同時也能使Akt在30 min內(nèi)被激活維持6 h［40］。PI3K/Akt作用復(fù)雜，還能與下游底物磷酸化而發(fā)揮廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，包括抗凋亡、促細(xì)胞生存等功能。

剪切力在VEC重構(gòu)中起著重要的作用，使得VEC呈彷錘形或梭形生長，其長軸與血液流動的方向平行;VEC通過整合素、RTKs、離子通道、G蛋白、Caveolae等力學(xué)感受器，感知剪切力的變化;從而激活多條分子信號形成網(wǎng)絡(luò)通路，包括有PKC、FAK、c-Src、PI3K、Rho小三鳥苷磷酸酶家族、絲裂酶原活化蛋白激酶(MAPK)、NF-κB等，實現(xiàn)信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，完成血管內(nèi)皮細(xì)胞的重構(gòu)。通過這些研究可以更好地理解循環(huán)系統(tǒng)血液動力學(xué)對VEC的影響，以及血液動力學(xué)因素參與的血管病理生理疾病，如高血壓、血栓的形成、動脈粥樣硬化等;同時，為組織工程設(shè)計構(gòu)建人工血管和血管內(nèi)皮化提供新的思路，為抑制腫瘤血管再生和抗粥樣硬化藥物尋找到新的靶點。

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