徐世芬,尹平,吳君怡,曹燕

行為學評價在針灸治療神經精神疾病實驗研究中的應用概況

徐世芬,尹平,吳君怡,曹燕

(上海中醫(yī)藥大學附屬市中醫(yī)醫(yī)院,上海 200071)

行為學作為一門與生理學相關的新興科學,近年來被廣泛研究和應用,尤其在疾病的動物實驗研究中。針灸治療神經精神疾病的機制研究中,應用行為學評分是對針灸療效的判定。該文就針灸治療神經精神疾病的動物實驗研究中應用行為學的情況進行歸納和總結,并指出所存在的問題和改進方法。

針灸療法;行為學評定;實驗研究;大鼠;小鼠

行為學評價被廣泛應用于各種實驗研究中,作為療效評價的指標之一,尤其是神經精神疾病的機制研究中的重要組成部分。本文就近年來以大鼠或者小鼠為實驗對象,通過使用針灸的干預方法來研究其對一系列行為學指標產生影響的文獻進行綜述,并給予初步的分析。

1 運動功能的評價

運動功能評分一般用于腦血管疾病、腦外傷和脊髓損傷等方面的的療效評定。針灸的實驗研究中,用于評定針灸干預中樞神經疾病的的療效指標之一,觀察大鼠或者小鼠的肌力和運動情況。

1.1 Zea Longa評分[1]

5分制評分,0分為無神經缺損癥狀;1分為不能完全伸展對側前爪;2分為向對側轉圈;3分為向對側傾倒;4分為不能自發(fā)行走,意識喪失。

張聞東等[2]針刺對超早期腦缺血再灌注大鼠進行干預,并用Zea Longa評分方法對大鼠神經損傷行為評分進行評定,發(fā)現在缺血再灌注后12 h、24 h針刺組大鼠神經損傷行為評分與模型組比較,差異具有統(tǒng)計學意義(＜0.05),說明缺血再灌注后12 h、24 h針刺組大鼠神經損傷行為得到較為明顯改善,針刺超早期腦缺血再灌注大鼠可促進其神經行為功能的恢復。模型組不做干預,電針組取百會、大椎、曲池、足三里穴給予電針治療。崔寶娟[3]用電針干預局灶性早期腦缺血大鼠模型,分別于腦缺血后24 h,48 h及72 h用Zea Longa方法觀察大鼠神經行為學變化,并測定缺血半暗帶區(qū)凋亡因子半膚氨酸蛋白酶3(Caspase3)表達,行為學結果與同時間點模型組比較,電針組均有顯著性差異(＜0.05,＜0.01),電針組組內比較,72 h組與24 h組相比有顯著性差異(＜0.01),表明電針刺激能有效改善腦缺血大鼠的神經功能,且有累積效應。

1.2 Bederson評分[4]

6級5分法,正常為5級(0分),表現為無神經功能缺損癥狀;4級(1分)為輕微缺損,表現為前肢蜷縮或屈曲,主要是持續(xù)性腕屈曲或肩內收伴肘部伸展;3級(2分)為中度缺損,表現為前肢持續(xù)性蜷縮或屈曲,可見腕、肘全部屈曲、肩部內收或內旋;2級(3分)為嚴重缺損,表現為持續(xù)性肢體蜷縮或者屈曲,一次肢體推力抵抗持續(xù)性減弱,自主活動時不伴肢體劃圈行為;1級(4分)為非常嚴重缺損,表現為雙側肢體持續(xù)性蜷縮或屈曲,一側肢體抵抗力持續(xù)性減弱,自主活動時出現肢體劃圈行為;0級(5分),表現為無自發(fā)性活動,出現意識障礙。

周利等[5]采用頭針治療卒中易感性自發(fā)性高血壓大鼠,應用Bederson評分評定大鼠神經功能缺損情況,結果1星期后,頭針組與空白對照組相比,神經功能缺損程度有顯著改善(＜0.05)。周爽等[6]對高血壓性腦出血大鼠電針水溝、內關、足三里,觀察其6 h、24 h、48 h和72 h的Bedserson評分,結果顯示,電針治療后神經癥狀明顯改善,并隨時間的推移逐漸趨于恢復,與模型組比較有顯著性差異(＜0.01,＜0.05)。

1.3 Zausinger評分法[7]

Zausinger6分法,0分為不能自發(fā)行走;1分為自由走動狀態(tài)下向病變對側旋轉;2分為抓住鼠尾,大鼠向病變對側旋轉;3分為病變對側的側壓力抵抗力下降;4分為不能伸直病變對側前爪,甚至全身向對側屈曲;5分為無神經功能缺損。李雅潔等[8]進行了針刺水溝穴治療腦梗死大鼠模型的參數優(yōu)化研究,針刺治療時間為栓線阻塞大腦中動脈后3 h及之后每隔12 h的共計6個時間點。于末次治療后,進行大鼠Zausinger神經行為學評分以及軟腦膜微循環(huán)和血流量測定,結果發(fā)現手針操作針刺水溝穴治療腦梗死的最佳參數為針刺頻率為3次/s,針刺時間為5 s。

1.4 Garcia評分法[9]

①自發(fā)活動(0～3分),在大鼠籠中觀察5 min,觀察其靠近籠壁及探究環(huán)境的能力;②提尾觀察四肢運動的對稱性(0～3分);③將大鼠置于桌子邊緣,保持兩后肢騰空,觀察其兩前肢運動的對稱性(0～3分);④將大鼠置于籠壁上觀察其攀爬能力,提尾拉下時感受其攀附力(1～3)分;⑤本體感覺(1～3)分,用鈍棒觸摸其兩側,觀察其對刺激的反應;⑥觸須反應(1～3分),從動物后面用鈍棒觸胡須觀察其反應。評分范圍在3～18分之間,18分者正常。

穆艷云等[10]用線栓法閉塞SD大鼠大腦中動脈,制作局灶性腦缺血再灌注模型。造模后2 h給予電針干預百會、大椎穴,進行Garcia行為學評定,結果電針組大鼠的神經行為學評分明顯高于模型組(＜0.01),并且電針能提高海馬神經元細胞線粒體離子泵ATP酶的活性,從而改善神經細胞的能量代謝。

1.5 Kikuo評分法[11]

Kikuo腦卒中指數評分法,根據所出現的一般精神狀態(tài)、偏癱等神經病學和行為障礙,制定出17分制評分法,癥狀越嚴重者,分數越高。

王援朝等[12]采用凝閉大腦中動脈皮層支的方法制作大鼠缺血性中風模型。造模成功后立即給予電針耳穴,取緣中和皮質下,留針20 min,每日2次,共4 d,并在術后24 h,48 h和72 h觀察Kikuo行為學評分,結果耳針治療后神經行為學評分在24 h和72 h均較模型組有顯著降低(＜0.01)。1星期后的血液流變學檢查提示,耳針治療可以調節(jié)缺血區(qū)血液灌注量促進損傷腦細胞恢復。

1.6 Rivlin斜板實驗[13]

傾斜板從水平位置起,每隔5°調整角度,板面附有帶淺槽的橡皮墊,將動物朝左或朝右放置板上,角度從小到大漸增,以其能停留5 s而不跌落的最大角度來做評定,重復3次,取其平均值。該實驗主要用于脊髓損傷后的動物后肢運動神經功能的評定。

李祖劍等[14]運用ALLEN’s致傷法制成大鼠T12中度脊髓損傷模型,給予電針治療,應用斜板實驗對不同組的大鼠在造模后12 h,治療1星期和4星期后分別進行行為學評分。結果顯示,在脊髓損傷后12 h和1星期,電針組與單純針刺以及模型組在行為學無明顯差異,而在4星期,電針組在斜板實驗方面明顯高于其他組別(均＜0.01)。因此,電針治療能促進脊髓損傷大鼠后肢功能恢復,提高其行為學評分。

以上評分方法多應用于有肢體功能障礙的疾病評定,如腦血管疾病、脊髓損傷等。Zea Longa評分、Bederson評分、Zausinger評分、Garcia評分以及Kikuo評分均類似于臨床上神經功能缺損評分方法。以上評分方法從簡單到復雜,從粗略到精細逐漸遞增。Rivlin斜板實驗用于評定脊髓損傷,也比較簡單。評分方法制定得越精細越能減少評定誤差。因為評定方法均為人為操作,具有明顯的主觀性,要減少評定的主觀性造成的誤差,就應該多人評定以求平均值。但所查文獻中未發(fā)現一篇報道提到評分是由3個以上評分員共同參與進行,以計算平均分數作為最終分數。也沒有文獻應用盲法,即評分者與操作者以及統(tǒng)計人員彼此分開,絕大多數研究都是先發(fā)現了行為學的變化后再進行斷頭取腦或者取血進行進一步的機制研究,以說明針刺對行為學改變的原理。準確、公正、精細的行為學判斷是先決條件,因此其重要性可見。應用客觀、靈敏性高,易操作的行為學評價方法進行針刺對神經功能損傷的實驗研究是非常關鍵的。

2 自發(fā)行為的評價

自發(fā)行為的評價主要用于焦慮、抑郁等狀態(tài)的評定。在大鼠的動物實驗中應用最多的有Open-field(礦場)實驗、糖水實驗、強迫游泳和十字高架實驗等。

2.1 礦場實驗

Open-field test[15]是研究動物進入開闊環(huán)境后的各種行為,例如動物對新開闊環(huán)境的恐懼而主要在周邊區(qū)域活動,在中央區(qū)域活動較少,但動物的探究特性又促使其產生在中央區(qū)域活動的動機,也可觀察由此而產生的焦慮、抑郁心理。以往所用的測試工具是高40 cm,長、寬均為80 cm的立方體敞箱,底面用白線劃分為面積相等的25塊。將大鼠置于敞箱底面的中心方格內,以動物穿越底面的格數(4爪均進入的方格方可記數)記錄為水平運動次數,以后肢直立次數(兩前爪騰空或攀附箱壁)記錄為垂直運動次數。記錄時間為3或5 min。如韓焱晶等[16]觀察電針治療慢性不可預見性輕度刺激結合孤養(yǎng)方法制成的抑郁大鼠模型的作用,用底部有25塊格的面積相等的立方體敞箱來測定動物的活動情況。結果,電針治療后的抑郁模型大鼠的運動次數和站立次數明顯高于模型組,說明電針的治療作用。

該方法主要應用于焦慮、抑郁情緒所致行為的評價,以及其他精神疾病的行為學評價,被廣泛應用,目前還沒有更好的評價方法可以替代。近些年來,Open- field視頻測試系統(tǒng)的應用,為該法的測試提供了更加客觀的數據。多采用紅外線光束追蹤法測定動物總運動情況。Xu S等[17]運用視頻分析系統(tǒng),測定抑郁大鼠的自發(fā)行為,運動速度、總運動路程和周邊及中央活動時間與路程,站立次數等,不需要人工計數,完全電腦自動記錄與分析數據,客觀可靠。

2.2 糖水實驗

糖水實驗[18]是大鼠在禁水24 h后,同時給予1%蔗糖水和普通飲用水,24 h后測定兩種水的消耗量,如果蔗糖水的消耗量明顯減少,說明大鼠的糖水偏好降低,主要用于抑郁癥模型大鼠的測定。如莊禮興等[19]觀察針刺與埋線不同方法治療抑郁癥大鼠的療效差異,針刺和埋線百會、心俞、肝俞穴后,檢測大鼠糖水消耗量,結果兩種方法治療后糖水消耗量明顯增加,與模型組比較有顯著差異,說明針刺和埋線均能改善抑郁狀態(tài)。

糖水消耗試驗的精確性不好把握,除非使用密封度以及精確度非常好的水瓶,不存在傾斜時滴水現象。否則誤差比較大,很難得到確切數據。很多文獻報道是斷水24 h后只給蔗糖水,正確測量方法給兩個水瓶,1個裝有蔗糖水,1個裝有普通水,分別測量兩種水的消耗量。

2.3 強迫游泳

強迫游泳(forced swimming test)[20]是評價抑郁動物模型的經典測試方法,該實驗方法是一種行為絕望實驗法,其原理是當大鼠放進一個有限的空間使之游泳,開始時拼命游泳力圖逃脫,很快就變成漂浮不動狀態(tài),僅露出鼻孔保持呼吸,四肢偶爾劃動以保持身體不至于沉下去,實際是動物放棄逃脫的希望,屬于行為絕望。經典的強迫游泳實驗分兩天進行。第一天讓大鼠在25℃的深水中強迫游泳15 min,取出后烘干,歸籠。第二天,在同樣的條件下進行強迫游泳5 min,記錄不動時間。不動時間越短,抗抑郁作用越強。目前該實驗也多用于視頻分析系統(tǒng),數據記錄客觀準確。如Xu S等[16]觀察電針百會、大椎對抑郁模型大鼠的效果中,應用強迫游泳測試視頻分析系統(tǒng),記錄大鼠在25℃水中的漂浮不動時間,結果電針治療后的不動時間較假針刺組以及模型組明顯減少,說明電針有明顯的抗抑郁作用。

強迫游泳試驗的結果容易受很多因素的影響,如水溫、水深、動物本身以及季節(jié)等。水溫一般是要控制在25℃左右,水深的選擇應以動物無法逃脫為標準。一般大鼠實驗時水深為17～33 cm,小鼠實驗時水深約10 cm。水太深,動物難以使用前爪和尾保持不動,就會游動和攀爬。水太淺,動物可利用尾和后爪保持平衡而影響實驗結果。一般冬季和夏季的試驗數據差距很大,冬季動物不愿動,而夏季非?；钴S。所以如何很好地把握試驗數據,排除各種影響因素都至關重要。

2.4 十字高架實驗

高架十字[21]是國際上公認的測試動物焦慮行為的首要裝置,主要測試動物的非條件性反射,它以動物自發(fā)性行為為基礎,設計出兩個開臂和兩個閉臂的迷宮,并將迷宮抬高以提高動物進入開臂時的恐懼。該實驗室利用動物對新異環(huán)境為探究特性和對高懸敞開臂的恐懼心理,形成動物的矛盾沖突來考察其焦慮狀態(tài)。徐海洋等[22]電針百會、三陰交治療慢性情緒應激焦慮模型大鼠,采用高架十字迷宮測試系統(tǒng)觀察大鼠的行為,結果電針可以提高慢性情緒應激焦慮模型大鼠進入開臂的次數和在開臂停留時間的百分比,具有明顯抗焦慮作用。

高架十字迷宮是一個簡單、快速、結果重復性好的焦慮檢測模式。為了提高大鼠入臂總次數,避免大鼠躲在閉臂,通常將大鼠置于開場中活動5 min后再放入迷宮。實驗前5～7 d每天撫摸動物1～2 min也可減少無關應激刺激對本實驗的影響。目前還沒有更好的測定焦慮情緒行為的測試系統(tǒng)和方法。

3 學習記憶的評定

學習記憶功能評定一般包括Morris水迷宮、Y迷宮、跳臺實驗、避暗實驗等,主要是評價大鼠的學習記憶能力。

3.1 Morris水迷宮

Morris水迷宮[23]是英國心理學家Morris于20世紀80年代初設計并應用于腦學習記憶機制研究的一種實驗手段,其在癡呆研究中的應用非常普遍。較為經典的Morris水迷宮,測試程序主要包括定位航行試驗和空間探索試驗兩個部分。其中定位航行試驗(place navigation)歷時4 d,每天將大鼠面向池壁分別從4個入水點放入水中若干次,記錄其尋找到隱藏在水面下平臺的時間(逃避潛伏期,escape latency)?？臻g探索試驗(spatial probe)是在定位航行試驗后去除平臺,然后任選一個入水點將大鼠放入水池中,記錄其在一定時間內的游泳軌跡,考察大鼠對原平臺的記憶。遠慧茹等[24]觀察針刺治療多發(fā)性腦梗死癡呆大鼠的療效,通過栓子注入法制作多發(fā)梗死性癡呆模型,隨機分為模型組、針刺組和非穴位組,應用Morris水迷宮觀測大鼠的空間記憶能力,結果針刺組大鼠在隱蔽平臺實驗、反向實驗以及探索實驗中的學習成績均明顯優(yōu)于模型組和非穴組,說明針刺可明顯改善多發(fā)性腦梗死癡呆大鼠的空間記憶能力。

3.2 Y迷宮

Y形迷宮(Y maze)即為三等分輻射式迷宮,由3個支臂和1個連接區(qū)組成,三臂相互夾角為120°,每臂末部鋪以食物槽,用以盛放食物。各臂可依次分為起步區(qū)、錯誤臂以及正確臂。其頂端有一盞15 W的信號燈,底部有電擊裝置,訓練大鼠按照信號燈跑向安全通道,一般將動物經訓練而達到學會的標準定為連續(xù)10次測試中有9次正確者。記錄每一動物迷路分辨學習達到學會標準所需的訓練數,以此作為評價動物學習能力好壞的客觀指標。Y迷宮主要用于優(yōu)先選擇和空間學習任務的檢測。和Y型迷宮類似的還有T型迷宮,其實驗的設計原理和實驗方案和Y型迷宮都十分相似,只是把迷宮的形狀由Y型換成T型。盧雨微等[25]探討耳針對血管性癡呆大鼠學習記憶障礙的改善作用,用Y迷宮檢測大鼠的學習記憶能力,結果耳針治療后大鼠的電擊次數明顯較模型組減少,說明耳針能明顯改善血管性癡呆大鼠的學習記憶成績。

從理論上講,Morris水迷宮實驗是一個厭惡驅動的實驗,而臂形迷宮實驗是食欲驅動的實驗。水迷宮與放射臂狀迷宮相比較的主要優(yōu)越性在于水迷宮中,動物訓練所需的時間較短(1星期),而臂形迷宮則需要幾星期的訓練時間;Morris水迷宮空間寬闊,動物氣味影響幾乎不存在。因此,Morris水迷宮是目前世界公認的較為客觀的學習記憶功能評價方法。

3.3 跳臺實驗

跳臺實驗的裝置為1個25 cm×20 cm×75 cm的被動回避反應箱,箱底鋪直徑為1 mm銅柵,通36 V交流電,銅柵的一角固定1個8 cm×8 cm×5 cm大小的塑料泡沫塊作為動物回避電擊反應的安全區(qū)。先將大鼠放入箱中自由活動3 min,熟悉環(huán)境,然后接通銅柵電源,大鼠受到電擊,其正常反應是跳回泡沫塊以躲避傷害性刺激,多數動物可能再次或多次跳至銅柵上,受到電擊(雙足同時接觸銅柵)又跳回安全區(qū),如此訓練5 min,并記錄每只大鼠首次找到安全區(qū)所需的時間(反應時間)和5 min內受到的電擊次數(錯誤次數),作為學習測試成績。24 h后重復上述試驗,記錄每只大鼠第一次跳下安全區(qū)的時間(潛伏期)和錯誤次數,作為記憶測試成績。蔣希成等[26]觀察針刺對老年癡呆大鼠的療效,結果針刺組大鼠跳臺潛伏期較模型組和治療前明顯延長,錯誤次數明顯減少。說明針刺可明顯提高AD大鼠的記憶能力。

學習記憶實驗方法的基礎是條件反射,跳臺法就是其中的一種較常用的方法,該方法的優(yōu)點是簡便易行,既可觀察對記憶過程的影響,也可觀察對學習的影響,有較高的敏感性。

3.4 避暗實驗

避暗實驗又稱為被動回避(passive avoidance),是利用小鼠或大鼠具有趨暗避明的習性設計的裝置,一半是暗室,一半是明室,中間有一小洞相連。暗室底部鋪有通電的銅柵。動物進入暗室即受到電擊,大鼠受到電擊后可自行逃出暗室,記錄潛伏期及5 min內受到電擊的次數。方程[27]研究電針對腦缺血再灌注大鼠學習記憶功能的影響,采用避暗實驗來觀察大鼠的行為變化。結果腦缺血1.5 h再灌注12 h,模型組大鼠避暗潛伏期縮短,錯誤次數明顯增多,電針干預可以延長避暗潛伏期,減少錯誤次數,說明電針,特別是術前電針預處理可以改善缺血模型大鼠的學習記憶功能。

本實驗也同樣簡單易行,操作簡便,以潛伏期為指標,動物的差異性比較小。對記憶過程特別是記憶再現有較高的敏感度。

近些年來,自發(fā)行為和學習記憶能力的測試,大多采用視頻分析系統(tǒng),避免了人為因素的誤差,增加了行為學測定的客觀性和準確性,為進一步的機制研究奠定了基礎。

4 評價與展望

針灸作為一種干預措施,治療神經精神系統(tǒng)疾病,臨床療效確切,并被廣泛應用。但其機制研究尚需要進一步深入進行。而行為學評定在基礎研究中可以直觀顯示出針灸的治療效果,已經被應用于針刺效應及機制研究中。行為學的評定在研究中起關鍵作用,如果評定不客觀,數據誤差較大,都直接影響了針刺機制的結果。在今后的實驗研究中,應該盡量采用視頻分析系統(tǒng),以求最大化的客觀性;具體操作應該根據權威性的操作指南進行,避免操作方法上的錯誤;對于無視頻分析系統(tǒng)的行為學測試方法,盡量采用多人測試,以求平均值。在行為學方法的選擇上,要多樣化,如抑郁癥的評定,可同時選擇自發(fā)行為、強迫游泳、糖水消耗量等幾個行為學方法,而避免單一方法的假陽性的出現。期望針灸的基礎研究設計更合理,行為學的應用更優(yōu)化。

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Survey of the Application of Behavioral Assessment to Experimental Studies of Acupuncture Treatment for Nervous and Mental Diseases

-,,-,.

,200071,

Behavioral science as an emerging physiology-related science has been widely studied and used, especially in animal experiments in diseases. In studies of the mechanism of acupuncture treatment for nervous and mental diseases, its effect has been evaluated using behavior scores. This article summarizes the application of behavioral science to animal experiments in acupuncture treatment for nervous and mental diseases, points out existent problems and proposes methods for improvement.

Acupuncture therapy; Behavioral assessment; Experimental study; Rats; Mice

1005-0957(2014)03-0278-05

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2014.03.0278

2013-09-14

上海市科委課題(10ZR1428800);教育部博士點基金項目(20103107120013);國家自然科學基金項目(81102636)

徐世芬(1975 - ),女,副主任醫(yī)師,E-mail:xu_teacher2006@ 126.com