趙仲麟，李 燕，朱 偉，張淑利，賈樹恒，馬斌強，袁 超*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，河南 鄭州450002;2.鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州450002; 3.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河南 鄭州450002)

0 前言

生物類專業(yè)研究生實驗課程培養(yǎng)中，分子生物學(xué)是一門重要的學(xué)位課。分子生物學(xué)通過研究生物大分子的結(jié)構(gòu)和功能等方面的內(nèi)容來闡明各種生命現(xiàn)象的本質(zhì)，其技術(shù)手段越來越多的應(yīng)用到農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)、環(huán)保、制藥等的眾多領(lǐng)域中。研究生培養(yǎng)關(guān)鍵是要提高學(xué)生的實踐能力和創(chuàng)新能力，而實驗課是研究生能力培養(yǎng)中的重要一環(huán)。培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新能力、動手能力，就需要充分發(fā)揮學(xué)科的優(yōu)勢，把最新的科研成果和實驗技術(shù)融入到研究生實驗教學(xué)環(huán)節(jié)中。

本文設(shè)計了一個針對研究生分子生物學(xué)課程的綜合實驗，利用IMPACT(Intein Mediated Purification with an Affinity Chitin-binding)系統(tǒng)對蛋白進(jìn)行表達(dá)純化，以大腸桿菌作為宿主菌。本實驗將分子生物學(xué)和基因工程所學(xué)部分內(nèi)容相整合，既鞏固了學(xué)生的理論知識又科提高學(xué)生的實驗操作技能。該方法為新型蛋白純化方法，國內(nèi)使用較少，增加了學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣的同時，更利于讓學(xué)生了解最新的實驗技術(shù)手段。對于提高學(xué)生的創(chuàng)新和研究能力、培養(yǎng)科研創(chuàng)新思維具有重要意義。

1 實驗原理

IMPACT系統(tǒng)是一種新型的蛋白融合表達(dá)及純化系統(tǒng)，已應(yīng)用到蛋白質(zhì)工程的許多重要領(lǐng)域［1～5］。IMPACT表達(dá)的目的蛋白與內(nèi)含肽(intein)及幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白(CBD)形成融合蛋白，通過幾丁質(zhì)柱親和純化融合蛋白。然后誘導(dǎo)內(nèi)含肽的肽鍵裂解活性，在幾丁質(zhì)介質(zhì)上將目標(biāo)蛋白釋放出來，而內(nèi)含肽與幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白仍結(jié)合在幾丁質(zhì)介質(zhì)上，達(dá)到單柱分離純化蛋白的目的。

將目的蛋白連接到pTWIN2載體Intein 2的N端，DTT還原劑可誘導(dǎo)內(nèi)含肽N端肽鍵裂解，將目標(biāo)蛋白釋放出來(圖1)。此外，還可以將目的蛋白連接到pTWIN2載體Intein 1的C端，通過溫度和pH的改變即可誘導(dǎo)內(nèi)含肽C端肽鍵裂解。但C端融合的反應(yīng)條件是室溫過夜，高溫可能使目的蛋白變性，因此，對于熱不穩(wěn)定的蛋白則最好選擇Intein 2的N端融合。

2 試劑

高保真HiFi Taq酶(全式金公司)，dNTPs，IPTG，氨芐青霉素，氯化鈣，T4 DNA連接酶(NEB)，限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和XhoⅠ(TaKa-Ra)，瓊脂糖，Goldview核酸染料，PCR純化試劑盒(上海生工)，10 mM EDTA(pH 8.0)，1.0% SDS，0.2 M NaOH，冰醋酸，5 M乙酸鉀，25 mM Tris-HCl(pH 8.0)，50 mM葡萄糖，氯仿，無水乙醇，DTT等均為國產(chǎn)分析純。

圖1 IMPACT蛋白純化原理

3 儀器

離心機、PCR儀、瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)、凝膠成像系統(tǒng)、超凈工作臺、培養(yǎng)箱、水浴鍋、移液器等。

4 實驗步驟

4.1 基因的PCR擴增

選取含有目的蛋白基因的載體為模板，根據(jù)其基因序列設(shè)計正向及反向引物，進(jìn)行PCR擴增反應(yīng)。正向引物前端加入NdeⅠ酶切位點，反向引物引入XhoⅠ酶切位點，也可根據(jù)具體情況使用其它限制性內(nèi)切酶，參見(https://www.neb.com/products/n6952-ptwin2-vector)。PCR反應(yīng)體系如下(總體積為20 μL):模板DNA 0.4 μL(200～300 ng)，正向引物和反向引物各0.4 μL(20 μM)，dNTPs 2 μL(2.0 mM)，10×Buffer 2 μL，高保真Taq酶0.2 μL(2.5 U)，去離子水14.6 μL。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min;95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán);72℃補充延伸10 min。延伸時間可根據(jù)基因片段長度和聚合酶延伸速度進(jìn)行調(diào)整。將反應(yīng)后的體系進(jìn)行瓊脂糖電泳，之后純化回收產(chǎn)物，備用。同時送部分純化產(chǎn)物交測序公司進(jìn)行測序驗證，確保無堿基突變。

4.2 表達(dá)載體的構(gòu)建

本實驗建議使用pTWIN2質(zhì)粒(NEB公司)或其他內(nèi)含肽系列的載體作為表達(dá)載體。將pTWIN2質(zhì)粒和目的基因PCR產(chǎn)物分別使用NdeⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切消化。通過電泳或PCR純化試劑盒進(jìn)行片段回收。將載體與PCR產(chǎn)物按1∶3比例混合，加入T4 DNA連接酶0.5 μL，10×Ligation Buffer 1 μL，連接體系共10 μL，混勻之后4℃連接過夜。使用氯化鈣轉(zhuǎn)化法將連接產(chǎn)物42℃熱擊90 s后轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌E.coli ER2566，涂布于含氨芐青霉素(50 μg/mL)的LB平板上篩選轉(zhuǎn)化子。感受態(tài)大腸桿菌E.coli ER2566的制備及具體轉(zhuǎn)化步驟參見分子克隆實驗指南第三版［6］，也可使用E.coli BL21作為感受態(tài)細(xì)胞。

4.3 重組質(zhì)粒的鑒定

在氨芐青霉素LB平板上挑取數(shù)個轉(zhuǎn)化子，分別接種到5 mL LB液體培養(yǎng)基中(氨芐青霉素50 μg/mL)，37℃培養(yǎng)過夜。取菌液2.0 mL放入2.0 mL的離心管中，12 000 rpm離心2 min，棄上清，所得菌體使用堿裂解法提取質(zhì)粒，最后干燥后質(zhì)粒使用40 μL無菌水溶解。每管各取0.5 μL質(zhì)粒進(jìn)行PCR驗證，反應(yīng)體系如下(總體積為20 μL):質(zhì)粒DNA 0.4 μL，正向引物和反向引物各0.4 μL(20 μM)，dNTPs 2 μL(2.0 mM)，10× Buffer 2 μL，普通Taq酶0.2 μL(2.5 U)，去離子水14.6 μL，反應(yīng)條件同4.1中條件。將反應(yīng)后產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，如有目的條帶，則表明載體構(gòu)建成功。

4.4 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

將鑒定好的含有正確重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子，挑取單菌落，接種到10 mL LB液體培養(yǎng)基中(含氨芐青霉素50 μg/mL)，37℃培養(yǎng)過夜。之后按照1%接種量轉(zhuǎn)接至10 mL的LB液體培養(yǎng)基(含氨芐青霉素100 μg/mL)。37℃振蕩培養(yǎng)至OD600達(dá)0.6，加入終濃度為0.2 mM的IPTG，30℃誘導(dǎo)5 h誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。6 000×g離心5 min收集菌體，使用緩沖液1(20 mM Tris-HCl，pH8.5，0.5 M NaCl，1 mM EDTA)將菌體重懸，冰浴，超聲破碎細(xì)胞，使蛋白釋放。12 000 rpm離心30 min，上清即為澄清的細(xì)胞粗提物。取樣5 μL進(jìn)行SDSPAGE電泳鑒定，大腸桿菌粗提液通過12% ～15%的SDS-PAGE進(jìn)行電泳檢測，過程中需加入蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，電泳后通過考馬斯亮藍(lán)染色。

4.5 蛋白親和純化過程

使用10倍柱體積的緩沖液1(20 mM Tris-HCl，pH8.5，0.5 M NaCl，1 mM EDTA)對幾丁質(zhì)樹脂進(jìn)行平衡。將離心后的細(xì)胞粗提物緩慢加入幾丁質(zhì)柱，流速約為0.5 mL/min。取少量穿透液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，與細(xì)胞粗提物的電泳進(jìn)行比較，觀察親和柱的蛋白結(jié)合效率。過柱后，用至少10倍柱床體積的緩沖液2(20 mM Tris-HCl，pH 7.0，1 mM EDTA，500 mM NaCl，40 mM DTT)徹底洗柱，由于CBD和幾丁質(zhì)樹脂的結(jié)合力很強，洗柱時使用較高的流速。然后停止柱流，4℃放置12 h以上。最后用緩沖液1將目的蛋白洗脫收集，大約收集8～10管，每管5～8 mL，目標(biāo)蛋白大多在一個柱床體積被洗脫，可以通過檢測280 nm下的吸光值或Bradford法檢測蛋白濃度。隨后對目的蛋白的物理化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行測定。

5 討論

本實驗中涉及步驟較多，時間跨度需2－3周時間，因此較適合作為研究生專業(yè)綜合實驗課程使用。本實驗過程中涉及一系列分子生物學(xué)的基本操作方法，可以綜合鍛煉學(xué)生的實驗技能。在實驗教學(xué)過程中，教師可引導(dǎo)學(xué)生自主設(shè)計實驗，在一定范圍內(nèi)對實驗內(nèi)容進(jìn)行調(diào)整。如目的蛋白可根據(jù)學(xué)生的興趣和實驗條件，使用PCR方法擴增基因。

本實驗使用單柱一步純化蛋白的方法，無需蛋白酶切割即可將目的蛋白與融合蛋白分離。對于不同蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)，時間和溫度可根據(jù)實際情況(可溶性、穩(wěn)定性和表達(dá)量)進(jìn)行調(diào)整。對于很多不穩(wěn)定或37℃不溶的蛋白，則采用20～25℃振蕩培養(yǎng)6 h或12～15℃振蕩培養(yǎng)20 h的條件，誘導(dǎo)蛋白可溶表達(dá)。此外，該方法產(chǎn)生的目的蛋白可帶有N末端的Cys和或C末端的硫酯鍵，可以進(jìn)行蛋白的標(biāo)記、連接和環(huán)化［7，8］。采用MESNA(2-mercaptoethanesulfonic acid)誘導(dǎo)內(nèi)含肽裂解，目的蛋白C端帶有活化的巰脂基團(tuán)，可與N端為半胱氨酸的多肽進(jìn)行連接。通過連接反應(yīng)將非編碼的氨基酸片段或標(biāo)記物連接到已表達(dá)及純化的蛋白序列上。

［1］ Shah N H，Dann G P，Vila-Perelló M，et al.Ultrafast protein splicing is common among cyanobacterial split inteins:implications for protein engineering［J］.Journal of the American Chemical Society，2012，134 (28):11338－11341.

［2］ 李 燕，張 潔，盧 琳，等.內(nèi)含肽介導(dǎo)的蛋白質(zhì)親和純化［J］.江西科學(xué)，2013，31(4):453－455.

［3］ 趙仲麟，頓文濤，蘇同福，等.內(nèi)含肽介導(dǎo)的綠色熒光蛋白純化［J］.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2011，45(5): 581－584.

［4］ Southworth M W，Amaya K，Evans T C，et al.Purification of proteins fused to either the amino or carboxy terminus of the Mycobacterium xenopi gyrase A intein［J］.Biotechniques，1999，27:110－120.

［5］ Zhao Z L，Lu W，Dun BQ，et al.Purification of green fluorescent protein using a Two-Intein system［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2008，77:1175－1180.

［6］ Sambrook，RusseⅡ.分子克隆實驗指南第三版［M］.北京:科學(xué)出版社，2008.

［7］ 趙仲麟，袁 超，朱 偉，等.內(nèi)含肽介導(dǎo)的蛋白連接技術(shù)及其應(yīng)用［J］.生物技術(shù)通報，2011，(11):70－73.

［8］ Xu M Q，Evans T C.Intein-mediated ligation and cyclization of expressed proteins［J］.Methods，2001，24: 257－277.