付錦楠，郭建軍，袁 林，傅筱沖，何順華

(江西省科學(xué)院微生物研究所，江西 南昌330096)

0 前言

減蛋綜合征病毒(egg drop syndrome virus，EDSV)屬禽類腺病毒，主要引起產(chǎn)薄殼蛋或無(wú)殼蛋、產(chǎn)蛋量迅速下降等特征。EDSV病毒是由11種大小從14 ku到97 ku不等的蛋白組成，其中纖維蛋白(fiber)是腺病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，可以識(shí)別細(xì)胞膜上的特異性受體［1］，即病毒粒子通過(guò)纖維蛋白與細(xì)胞膜受體結(jié)合引起感染，纖維蛋白還可以阻斷大分子的合成，抑制病毒的增殖，且?guī)в兄饕膶俸蛠唽偬禺愋钥乖瓫Q定簇及次要的種特異性抗原決定簇，同時(shí)也是EDSV的主要保護(hù)性抗原成分［2］。針對(duì)減蛋綜合征病毒黏膜感染特點(diǎn)和減蛋綜合征病毒纖維蛋白在疾病防治中所起的重要作用，設(shè)計(jì)以纖維蛋白KnobS為免疫原的黏膜免疫系統(tǒng)作為抵御病原入侵的第一道防線，對(duì)科學(xué)防治本病具有重要意義。

在疾病防治中，只能靠注射減蛋綜合征疫苗來(lái)預(yù)防。由于注射極不方便，人們迫切希望有口服疫苗面市。用何種菌來(lái)表達(dá)減蛋綜合征病毒纖維蛋白KnobS是該口服疫苗的關(guān)鍵所在。如果能利用乳酸菌表達(dá)和傳遞外源抗原進(jìn)行黏膜免疫，無(wú)疑是最為安全有效的活菌疫苗。但乳酸菌作為載體表達(dá)外源抗原、存在外源抗原表達(dá)量低、免疫原性差，且有些乳酸菌表達(dá)的產(chǎn)物存在細(xì)胞內(nèi)不能被免疫細(xì)胞識(shí)別和提呈等不足［3］，因此如何提高乳酸菌外源抗原對(duì)黏膜免疫系統(tǒng)的刺激以及增加抗原與免疫細(xì)胞接觸，是提高乳酸菌黏膜免疫應(yīng)答的重要技術(shù)環(huán)節(jié)［4，5］。

本實(shí)驗(yàn)利用乳酸桿菌在腸道的黏附特性、耐膽汁酸鹽、耐胰酶和在腸道的定殖和對(duì)機(jī)體的益生作用，構(gòu)建表達(dá)減蛋綜合征病毒纖維蛋白KnobS重組乳酸菌系統(tǒng)，為促進(jìn)外源抗原對(duì)黏膜刺激的穩(wěn)定性和持久性，在表達(dá)系統(tǒng)中插入了具有黏膜免疫佐劑的大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位(LTB)，實(shí)現(xiàn)了KnobS蛋白與LTB在乳酸菌的共表達(dá)，從而為進(jìn)一步研制EDS的口服活菌疫苗奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 質(zhì)粒pET28a-KnobS，重組質(zhì)粒pMG36e-UP/L-LTB，大腸桿菌DH5α，干酪乳桿菌Lactobacillus casei 393由本室保存。

1.1.2 主要試劑 高保真DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、DL2000 Marker、蛋白質(zhì)Marker、限制性內(nèi)切酶均購(gòu)自大連TaKaRa公司;MRS培養(yǎng)基購(gòu)自O(shè)xoid公司;質(zhì)粒抽提試劑盒、DNA純化試劑盒購(gòu)自愛(ài)思進(jìn)公司;抗EDSV血清和抗LTB血清購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所;HRP標(biāo)記羊抗雞IgG為KPL公司產(chǎn)品;電擊杯為BioRad產(chǎn)品;引物委托上海英俊公司合成，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 引物 上游引物P1含SalⅠ酶切位點(diǎn)，下游引物P2含PstⅠ酶切位點(diǎn)，用于擴(kuò)增KnobS基因，約700 bp。引物CX2、CX2用于擴(kuò)增LTB基因;引物CX1、CX3用于鑒定KnobS-LTB目的基因片段，引物序列如下:

1.2 方法

1.2.1 重組干酪乳桿菌的構(gòu)建及鑒定 以pET28a-KnobS為模版，P1和P2為引物，PCR擴(kuò)增目的基因 KnobS，反應(yīng)體系50 μL:5X PCR Primer STAR Buffer 10 μL，dNTP Mixture 4 μL，模板1 μL，引物各1 μL，Primer STAR HS DNA Polymerase 0.5 μL，補(bǔ)水至50 μL。反應(yīng)條件如下:94℃預(yù)變性30;94℃15 s，50℃15 s，72℃30 s，共28個(gè)循環(huán);72℃延伸5 min。將膠回收的PCR產(chǎn)物KnobS和表達(dá)質(zhì)粒載體pMG36e-UP/L-LTB分別進(jìn)行Sal和PstⅠ雙酶切，連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞干酪乳桿菌Lactobacillus casei 393［5］。

取適量菌液涂布于含有 10 μg/mL Cm的MRS瓊脂培養(yǎng)基上，37℃ 厭氧培養(yǎng)36 h。挑取單個(gè)菌落，接種于含有10 μg/mL Cm的MRS液體培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)過(guò)夜，提取質(zhì)粒。對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定、以引物CX1、CX3進(jìn)行PCR鑒定，并對(duì)疑似陽(yáng)性重組質(zhì)粒進(jìn)行序列測(cè)定，獲得的陽(yáng)性重組質(zhì)粒乳酸桿菌命名為pMG36e-UP/LTB-KnobS/Lactobacillus casei 393。

1.2.2 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) pMG36e-UP/LTBKnobS/Lactobacillus casei 393陽(yáng)性重組菌落接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)過(guò)夜活化，取過(guò)夜培養(yǎng)菌以1∶20比例接種于MRS培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。樣品處理:誘導(dǎo)表達(dá)菌液以6 000 r/min離心5 min，收集上清，加入SDS-PAGE樣品緩沖液(含DTT)，混勻，沸水浴10 min;12 000 r/ min離心5 min。優(yōu)化表達(dá)條件，對(duì)重組細(xì)菌擴(kuò)大培養(yǎng)，采用Ni-NTA離子親和層析純化重組蛋白。

1.2.3 表達(dá)產(chǎn)物的鑒定 同時(shí)設(shè)pMG36e-UP/LLTB/Lactobacillus casei 393為陰性對(duì)照進(jìn)行SDSPAGE電泳及Western Blot分析，確定目的蛋白表達(dá)。重組蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE后，將電泳后的蛋白轉(zhuǎn)移到 NC膜上，按照文獻(xiàn)方法［2～5］進(jìn)行Western blot檢測(cè)，用5%脫脂乳37℃封閉2 h，用PBST洗3次;分別以雞抗EDSV高免血清和抗LTB高免血清為一抗，1∶500稀釋，37℃孵育2 h，PBST洗3次，再與二抗為HRP標(biāo)記羊抗雞IgG(1∶2 000稀釋)作用1 h，PBST洗3次;DAB顯色15～30 min，置蒸餾水中止顯色。

1.2.4 雞抗KnobS蛋白陽(yáng)性血清與雞紅細(xì)胞的血凝抑制試驗(yàn) 根據(jù)EDSV的血凝價(jià)，配制4個(gè)血凝單位的病毒液。在96孔V形微量反應(yīng)板中，每孔加入PBS 2.5 μL，第1孔加入雞抗KnobS蛋白陽(yáng)性血清2.5 μL，依次倍比稀釋至每10孔，棄去2.5 μL，加入4單位病毒至倒數(shù)第2孔，室溫作用30 min，最后一孔補(bǔ)2.5 μL PBS，加入10 mL/L的紅細(xì)胞，室溫放置30 min后，觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組干酪乳桿菌表達(dá)質(zhì)粒 pMG36e-UP/ LTB-KnobS的鑒定

以P1、P2為引物，pET28a-KnobS為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得約708bp的基因片段(見(jiàn)圖1)，該片段經(jīng)1%瓊脂糖凝膠純化，純化產(chǎn)物用Sal和PstⅠ雙酶切，與相同雙酶切的載體質(zhì)粒pMG36e-UP/L-LTB進(jìn)行連接，電轉(zhuǎn)化 Lactobacillus casei 393，經(jīng)氯霉素MRS平板培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)，挑取，單個(gè)菌落 pMG36e-UP/LTB-KnobS/Lactobacillus casei 393擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后，經(jīng)Sal和PstⅠ單酶切約有4.5 Kb的目的片段，雙酶切分別切出3 700 bp和1 200 bp目的片段，PCR鑒定擴(kuò)增出約1 200 bp的基因片段(見(jiàn)圖2)，測(cè)序鑒定結(jié)果表明外源基因KnobS正確插入pMG36e-UP/LTB中。

2.2 融合蛋白LTB-KnobS在干酪乳桿菌中的表達(dá)

對(duì)重組的pMG36e-UP/LTB-KnobS和pMG36e空載體干酪乳桿菌Lactobacillus casei 393進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)(見(jiàn)圖3)，結(jié)果在約41 kDa近出現(xiàn)目的條帶，而空載體并未出現(xiàn)，說(shuō)明LTB-KnobS可能在干酪乳桿菌中得到表達(dá)。從圖3中誘導(dǎo)的情況看，在培養(yǎng)8 h后表達(dá)量開(kāi)始逐漸增加，培養(yǎng)32 h后達(dá)到最大量，然后在培養(yǎng)40 h、48 h后表達(dá)量基本保持一致。

圖1 EDSV纖維蛋白KnobS基因的PCR產(chǎn)物電泳圖

圖2 重組質(zhì)粒pMG36e-UP/LTB-KnobS的鑒定

圖3 SDS-PAGE電泳檢測(cè)融合蛋白LTB-KnobS在干酪乳桿菌中的表達(dá)情況

2.3 重組融合蛋白的活性分析

表達(dá)的重組融合蛋白經(jīng)純化后不能與雞紅細(xì)胞發(fā)生凝集，說(shuō)明重組蛋白無(wú)血凝活性。利用抗EDSV高免血清或抗LTB高免血清與重組融合LTB-KnobS蛋白進(jìn)行western blot分析，在41 ku處出現(xiàn)清晰的印跡帶，而不與其他雜蛋白反應(yīng)(圖4)，表明重組蛋白有很好的反應(yīng)活性。因此，重組蛋白具有較好的免疫原性。

圖4 重組蛋白LTB-KnobS的western blot分析

3 討論

以細(xì)菌、病毒作為活載體均可表達(dá)外源蛋白，但從生物安全性及疫苗免疫效果角度出發(fā)，能在腸道黏膜定植的乳酸菌被認(rèn)為是最合適的載體系統(tǒng)。干酪乳桿菌是定植于人及動(dòng)物腸道黏膜表面的重要益生菌群之一，作為表達(dá)和傳遞外源基因的載體系統(tǒng)［3］，具有益生性安全性以及可以通過(guò)先天性免疫激活腸道黏膜免疫系統(tǒng)，不會(huì)刺激體產(chǎn)生抗體等重要特點(diǎn)。胞內(nèi)表達(dá)、分泌表達(dá)、表面表達(dá)是目前研制乳酸桿菌活載體疫苗的主要表達(dá)形式。其中，分泌表達(dá)的蛋白質(zhì)不易被蛋白酶降解，且保持較好的活性。Bermudez［6］等證明胞內(nèi)和分泌形式的重組乳酸乳球菌表達(dá)的lFN-ω雖然均具有活性，但分泌型菌株表達(dá)的lFN-ω活性比在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)的高兩倍。Reveneau［7］等證明以乳酸菌作為抗原傳遞載體的口服疫苗刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答與抗原表達(dá)的部位密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中使用的分泌型表達(dá)系統(tǒng)，在一定程度上保證了蛋白的表達(dá)量和蛋白活性。

纖維蛋白是EDSV的主要結(jié)構(gòu)蛋白，其五鄰體與六鄰體一起構(gòu)成病毒核衣殼，決定病毒粒子的大小。纖維蛋白帶有主要的種特異性抗原決定簇和次要的亞屬特異性抗原決定簇，是具有中和活性的抗原，其中和作用是阻斷病毒體從酸性的核內(nèi)質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞，從而中和病毒。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)這纖維蛋白的研究表明，纖維蛋白的KnobS區(qū)［8］不但可識(shí)別宿主細(xì)胞受體而且能增強(qiáng)病毒的吸附，若病毒的KnobS區(qū)遭到破壞，即可阻止病毒的感染，因而，用EDSV纖維蛋白KnobS區(qū)作為免疫原，研究其誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生有效抗體來(lái)阻止病毒感染是可行的。

LTB作為黏膜免疫佐劑，能傳遞黏膜抗原信息，增加抗原特異性T細(xì)胞克隆的增殖和分化。LTB可激活Thl途徑，不易引起變態(tài)反應(yīng)，同時(shí)能增大抗原分子量，提高外源抗原的免疫原性，亦能提高CD8+T細(xì)胞對(duì)病毒感染細(xì)胞的殺傷力［3，5］。根據(jù)這一特點(diǎn)將LTB設(shè)計(jì)成為靶向分子，推測(cè)其與抗原分子的結(jié)合，有助于促進(jìn)細(xì)胞對(duì)抗原分子的吸收。因此，本試驗(yàn)將編碼減蛋綜合征病毒主要免疫保護(hù)性抗原纖維蛋白KnobS與大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位(LTB)基因插入干酪乳酸桿菌分泌表達(dá)載體，構(gòu)建共表達(dá)減蛋綜合征病毒纖維蛋白KnobS與LTB的重組干酪乳桿菌;SDS-PAGE、Western-blot分析，以及血凝抑制試驗(yàn)均表明，該融合蛋白LTB-KnobS獲得了正確表達(dá);實(shí)現(xiàn)了LTB和減蛋綜合征病毒纖維蛋白KnobS在乳酸桿菌的分泌融合表達(dá)。該重組干酪乳桿菌在動(dòng)物免疫中，能否有效刺激機(jī)體免疫應(yīng)答，LTB對(duì)KnobS是否具有免疫增強(qiáng)作用，尚需進(jìn)一步進(jìn)行動(dòng)物免疫加以驗(yàn)證。

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