李丹 陳陽 劉宇 王爽 王巖 秦明偉 史同瑞

（黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所 黑龍江 齊齊哈爾 161000）（哈爾濱鐵路獸醫(yī)衛(wèi)生處 哈爾濱 150006）

佐劑最早來源于拉丁語“adjuvare”一詞，為“幫助”，是指能夠提高機(jī)體對抗原的適應(yīng)性免疫應(yīng)答的物質(zhì)，能夠在免疫反應(yīng)中誘導(dǎo)全面持久的免疫應(yīng)答。在疫苗制劑中，佐劑的功能主要包括：增強疫苗抗原的免疫原性；促進(jìn)細(xì)胞免疫和體液免疫，優(yōu)化免疫應(yīng)答，促進(jìn)免疫能力較弱人群中的免疫應(yīng)答；增進(jìn)抗原與黏膜之間的傳遞以及免疫接觸；減少疫苗成分中抗原的需求量以及在實施過程中的免疫接種次數(shù)；優(yōu)化抗原結(jié)構(gòu)，維持抗原構(gòu)象等。

從巴斯德至今近百年來已開發(fā)了許多菌苗和疫苗，但傳統(tǒng)的疫苗一般多為全菌或全病毒制成,其中含有大量非免疫原性物質(zhì)，這些物質(zhì)除具有毒副作用外也有佐劑作用，所以一般不需要外加佐劑。因此，很長一段時間以來主要是研究毒素、類毒素、抗毒素的學(xué)者在研究和使用佐劑。直到1925年，法國免疫學(xué)家兼獸醫(yī)學(xué)家Gaston Ramon發(fā)現(xiàn)如果在白喉和破傷風(fēng)疫苗中加入某些與之無關(guān)的物質(zhì)可以特異地增強機(jī)體的抵抗反應(yīng)，從此佐劑引起了人們的注意，許多國家也開始不同程度的開展了這方面的研究。

1.傳統(tǒng)佐劑

1.1 鋁佐劑

鋁佐劑是目前獸用疫苗和人用疫苗上應(yīng)用最廣泛的佐劑。鋁佐劑苗可以分為鋁沉淀疫苗和鋁吸附疫苗兩種，鋁沉淀疫苗是將鋁劑懸液加至抗原液中，鋁吸附疫苗是將抗原溶液加至氫氧化鋁或磷酸鋁中。兩種鋁佐劑疫苗不僅能夠減少抗原用量，還能夠增強機(jī)體的免疫應(yīng)答。鋁佐劑通常用氫氧化鋁，其次是明礬及磷酸三鈣。

1926 年，Glenny發(fā)現(xiàn)用明礬沉淀的白喉類毒素懸液要比類毒素本身具有更高的抗原性，免疫豚鼠取得了較強的免疫效果。1931年，Glenny等又報道了氫氧化鋁吸附抗原制成的疫苗在注射部位具有緩慢釋放的功能，就此提出氫氧化鋁佐劑的作用機(jī)制為儲存庫效應(yīng)。然而在1950年，Holteta首次對此機(jī)制提出質(zhì)疑。長期以來關(guān)于鋁佐劑疫苗的具體機(jī)制尚不明確，但目前Glenny理論是對于鋁佐劑作用機(jī)制的主流解釋。隨著科學(xué)的發(fā)展和研究水平的提高，人們對于氫氧化鋁的作用機(jī)制不斷有了新的認(rèn)識。

2004 年Rimanilo等研究發(fā)現(xiàn)氫氧化鋁佐劑可激活固有免疫應(yīng)答。2007年Li等研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞主要對抗原進(jìn)行吞噬和破碎作用，鋁則激活細(xì)胞內(nèi)源性免疫應(yīng)答相關(guān)的Nalp3炎性復(fù)合體，促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌產(chǎn)生高水平的促炎癥因子IL-1β 和IL-18。Eisenbart等進(jìn)一步研究證實氫氧化鋁佐劑還可激活T2細(xì)胞分泌IL-4，誘導(dǎo)MHC-Ⅱ類分子和CD83、CD86等的表達(dá)，誘導(dǎo)Th2型體液免疫應(yīng)答。2013年周洋證實鋁佐劑可升高血漿中促炎細(xì)胞因子和趨化因子水平。

Skeda等報道Alum的佐劑性是由吸附介導(dǎo)的，因此，Alum的佐劑性取決于鋁鹽對抗原的吸附程度。Alum對蛋白抗原的吸附還與靜電吸附和疏水性的相互作用有關(guān)。帶有陰電荷的重組瘧疾疫苗，與帶有陽電荷的Alum能很好結(jié)合，而與帶陰電荷的磷酸鋁則很難結(jié)合。另外，結(jié)合位點數(shù)目也是影響吸附的重要因素，在大分子中結(jié)合位點數(shù)目與分子量成正比。

雖然鋁佐劑是被FDA批準(zhǔn)可用于人類疫苗的佐劑，其安全性和有效性得到了人們的公認(rèn)，但鋁佐劑也有許多不足之處，如因其不能凍干，所以有些新型疫苗無法適用；當(dāng)鋁佐劑通過皮下或皮膚內(nèi)注射而不是肌肉內(nèi)注射的路徑時通可產(chǎn)生肉芽腫；而且在許多情況下鋁鹽并不是一個好的佐劑，尤其是在誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答上，其可誘導(dǎo)產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答，但不能誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答，同時可誘導(dǎo)產(chǎn)生IgE 抗體產(chǎn)生，發(fā)生變態(tài)反應(yīng)，增加發(fā)生超敏反應(yīng)的危險。

1.2 油佐劑

此類佐劑在動物實驗中大量使用，一般包括水包油（O/W）或者油包水乳劑（W/O）和水包油包水雙相乳劑（W/O/W）。如是弗氏佐劑（FA），又可分為弗氏不完全佐劑（FIA）和弗氏完全佐劑（FCA），MF59，AS03，AF03和SE等。

弗氏佐劑（FA）是用礦物油（石蠟油）、乳化劑（羊毛脂）和滅活的分枝桿菌（結(jié)核分枝桿菌或卡介苗）組成的油包水乳化佐劑。這三種成分俱全的佐劑稱為福氏完全佐劑（Freund’s Complete Adjuvant,FCA），不含分枝桿菌的佐劑為福氏不完全佐劑（Freund’s Incomplete Adjuvant,FIA）。FIA是典型的只誘導(dǎo)Th2型細(xì)胞因子，誘生抗體的佐劑。FCA因其中含有滅活的分枝桿菌（長介菌）成份，是標(biāo)準(zhǔn)的誘生體液和細(xì)胞免疫佐劑，可誘導(dǎo)Th1型細(xì)胞因子，能夠促進(jìn)IgG的產(chǎn)生，抑制IgM的產(chǎn)生，從而抑制免疫耐受的產(chǎn)生，推遲超敏反應(yīng)，增加移植排斥，促進(jìn)抗腫瘤作用。石蠟油因不能代謝而存留在注射的部位，這就阻礙了抗原降解或快速反應(yīng)，起到抗原儲存作用，使抗原緩慢持續(xù)的釋放，不斷刺激機(jī)體的免疫系統(tǒng)而產(chǎn)生免疫反應(yīng)。

但因為礦物油不能被代謝，所以會產(chǎn)生一系列的副作用，礦物油乳劑常見的副作用有注射部位的炎癥反應(yīng)、肉芽腫、潰瘍等，另外礦物油以及其中的組分如姥鮫烷、正十六烷等還會引起佐劑型關(guān)節(jié)炎等自身免疫反應(yīng)。對于人類常規(guī)的預(yù)防性疫苗來說乳劑的毒性太大，一般只是用于科學(xué)研究或癌癥患者。

隨著乳化技術(shù)的進(jìn)步，可選擇代謝油取代初期的礦物油來制備更為安全、穩(wěn)定、有效的免疫佐劑，如MF59、AS03、AF03和SE等，MF59是目前研究較熱門的佐劑之一。MF59由角鯊烯（角鯊烯是一種較石蠟油更易代謝的植物油）、Tween-80和Span-85等組成，既可以刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫也可以產(chǎn)生細(xì)胞免疫。MF59是除鋁佐劑外首個用于人類的新型佐劑，它能增強老年人群中流感的免疫原性，于1997年在歐洲獲得認(rèn)證作為流感疫苗的佐劑。AS03與MF59類似，在歐洲認(rèn)證用于流感疫苗，并在2009年H1N1流感大流行中得到廣泛使用。

2.新型佐劑

2.1 細(xì)胞因子類佐劑

細(xì)胞因子多屬小分子多肽或糖蛋白，相對分子質(zhì)量在15 000～35 000之間，由活化的免疫細(xì)胞和相關(guān)細(xì)胞產(chǎn)生的，能影響其他細(xì)胞功能，對免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)有介導(dǎo)和調(diào)節(jié)作用，是一類通過與高親和力的特異性受體相互作用，可在低濃度下發(fā)揮作用的生物活性物質(zhì)。目前已有多種細(xì)胞因子如IL-12、IL-15、IL-18、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）和干擾素γ（IFN-γ）等作為病毒D N A 疫苗佐劑在實踐中得到應(yīng)用，并有效增強了D N A疫苗的特異性免疫反應(yīng)。這類物質(zhì)可與抗原共表達(dá)而發(fā)揮佐劑作用，提高核酸疫苗的免疫保護(hù)率，或組裝成表達(dá)質(zhì)粒，與抗原混合使用。

通過多年的研究，人們逐步對各種不同的細(xì)胞因子佐劑刺激機(jī)體產(chǎn)生的不同作用有了一個大致了解，細(xì)胞因子通過免疫調(diào)節(jié)提高抗原提呈能力，誘導(dǎo)并增強C T L 的作用；細(xì)胞因子佐劑能使機(jī)體持續(xù)產(chǎn)生抗體，并阻礙淋巴濾泡中生發(fā)中心的形成；細(xì)胞因子能將B 細(xì)胞與外周隔絕，使抗體生成下降，從而起到陰性免疫調(diào)節(jié)作用。

過去人們普遍認(rèn)為IL-12是佐劑效果最好的細(xì)胞因子，研究發(fā)現(xiàn)IL-12抑制腫瘤細(xì)胞作用很強，并顯著增強了CTL活性，同時增加內(nèi)源性IFN-γ 的分泌。最近IL-7和IL-15作為關(guān)鍵細(xì)胞因子被應(yīng)用來增強CD8T細(xì)胞的免疫記憶。在DNA疫苗同編碼IL-15的基因聯(lián)合投遞增強免疫應(yīng)答來對抗小鼠布氏桿菌感染的實驗中，小鼠接種此疫苗增強了體液免疫，布氏桿菌病特異性抗體IgG 2α 的量超過了IgG1，脾臟細(xì)胞內(nèi)IL-15佐劑DNA疫苗誘導(dǎo)更高水平的IFN和CD8T細(xì)胞，同時對誘導(dǎo)CD4T細(xì)胞也有貢獻(xiàn)。

細(xì)胞因子在DNA疫苗應(yīng)用中有特殊的潛力，細(xì)胞因子可以和抗原在同一載體里共表達(dá)。但因其分泌有可能增加誘導(dǎo)IgE產(chǎn)生，引起過敏反應(yīng)，增加疫苗的不良反應(yīng)。

2.2 CpG ODN佐劑

CpG是指由胞嘧啶、鳥嘌呤及使兩者相連的磷酸酯鍵組成的二核苷酸，CpG二核苷酸及其5，端和3，端的各兩個堿基構(gòu)成CpG基序。人們發(fā)現(xiàn)細(xì)菌DNA具有較強的抗腫瘤作用，這種抗腫瘤作用是基于細(xì)菌DNA的強大免疫刺激功能，而這與其所含的非甲基化的CpG基序有關(guān)，因此CpG基序也被稱為免疫刺激序列，它是細(xì)菌DNA產(chǎn)生免疫刺激作用的核心結(jié)構(gòu)。

目前以CpG ODN為佐劑的細(xì)菌類疫苗的研究涉及：炭疽桿菌疫苗、傷寒疫苗、白百破疫苗、流感嗜血桿菌疫苗、霍亂疫苗等。以CpG ODN為佐劑的病毒類疫苗的研究涉及：流感病毒疫苗、呼吸道合胞病毒疫苗、乙型肝炎疫苗、單純皰疹病毒疫苗、生殖器皰疹病毒疫苗等。以CpG ODN為佐劑的寄生蟲類疫苗的研究涉及：曼森血吸蟲病疫苗、瘧疾疫苗、利什曼病疫苗、鼠弓形蟲疫苗等。

雖然CpG ODN具有安全有效等優(yōu)點，但還是有許多問題有待于解決：比如它的免疫激活機(jī)制、免疫劑量（高劑量CpG ODN及重復(fù)給藥可能導(dǎo)致毒性效應(yīng)）和最適免疫途徑還需要進(jìn)一步研究。目前CPG作為人用乙肝疫苗已進(jìn)入臨床試驗。

2.3 脂質(zhì)體佐劑

脂質(zhì)體是由磷脂和固醇類組成的雙層脂質(zhì)分子小球，能夠包裹抗原，其表面為疏水結(jié)構(gòu)，內(nèi)部為親水結(jié)構(gòu)。脂質(zhì)體既可做抗原載體又可做佐劑，用它包裹D N A 疫苗到達(dá)靶細(xì)胞后,脂質(zhì)體與靶細(xì)胞融合并將DNA釋放入細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)。巨噬細(xì)胞等吞噬了含有抗原的脂質(zhì)體，經(jīng)溶酶體酶消化釋放抗原，可激活T 細(xì)胞及B 細(xì)胞。脂質(zhì)體的佐劑效力依賴于脂質(zhì)雙分子層的數(shù)量、電荷、組成成份以及制備的方法。

脂質(zhì)體能顯著增強機(jī)體對抗原的免疫應(yīng)答，包括產(chǎn)生保護(hù)性抗體和細(xì)胞免疫應(yīng)答，還可以作為載體與其它佐劑（如脂質(zhì)A、胞壁酰二肽及其衍生物、IL-1、IL-2等）或DNA疫苗聯(lián)合使用，刺激巨噬細(xì)胞分泌TNF-α、IF-γ、IL-6和IL-12,誘導(dǎo)CD8+細(xì)胞毒性T 細(xì)胞為主的免疫應(yīng)答，同時增強APC的遞呈能力，從而增強機(jī)體免疫應(yīng)答。

但作為疫苗佐劑脂質(zhì)體也存在一些不足：穩(wěn)定性較差，磷脂中的不飽和脂肪酸儲存時會逐漸氧化，小脂質(zhì)體傾向于相互融合成大脂質(zhì)體，在融合過程中可以導(dǎo)致包入抗原的釋放。此外，佐劑與不同的抗原合用，其非特異性免疫調(diào)節(jié)作用是不可預(yù)知的，此外免疫途徑，抗原用量對特定脂質(zhì)體疫苗免疫原性也有極大影響，所以單純脂質(zhì)體作為佐劑的作用機(jī)理不可能得到全面的詮釋。同時脂質(zhì)體在制備過程中要求一定的技術(shù)性，其費用也比其他免疫佐劑高，目前對脂質(zhì)體的應(yīng)用研究還主要集中在醫(yī)學(xué)研究方面，在獸醫(yī)疫苗研究中的應(yīng)用前景還具有一定的不確定因素。

2.4 免疫刺激復(fù)合物（immunostinulating complex ISCOM）

ISCOM由皂角苷、膽固醇、磷脂以及抗原的磷酸鹽溶液組成。粒徑小于40nm，通過前3個組份之間的疏水作用而結(jié)合在一起，疏水的或親水的抗原均可以結(jié)合到其復(fù)合物上。主要通過增強APC的內(nèi)吞作用，誘導(dǎo)黏膜免疫、體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，產(chǎn)生持久的抗體滴度和保護(hù)性應(yīng)答，可通過腸道外和黏膜途徑免疫。它適用于誘導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)的疫苗，正在臨床研究中的有流感病毒疫苗、人乳頭瘤病毒疫苗。

因ISCOM產(chǎn)生有效免疫所需的抗原很少，使其有可能成為多價亞單位疫苗的有效佐劑。ISCOM具有佐劑和抗原提呈的雙重功能，既可激發(fā)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，又可刺激體液免疫。臨床研究表明，ISCOM是目前誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞系（CTL）反應(yīng)最強的免疫刺激物。

3.結(jié)語

合理選擇和使用佐劑不但可以節(jié)約抗原的使用量，還可以迅速刺激免疫系統(tǒng)，增強免疫應(yīng)答。對佐劑的研究一直是疫苗研究過程中的重要環(huán)節(jié)，理想的佐劑應(yīng)該是廣譜、無副作用、對免疫系統(tǒng)具備有效的激活作用，同時便于生產(chǎn)和使用。但是在佐劑大量出現(xiàn)的同時，隨之而來的是對其安全性的擔(dān)憂。因此，未來的工作重點之一應(yīng)是深入研究佐劑的作用機(jī)制，全面推測其對免疫系統(tǒng)的影響，尋找并建立合理可靠的動物模型，預(yù)測免疫毒性發(fā)生的可能性。