劉亞舉，孫現(xiàn)鋒

IDproofMixture軟件包在STR分析和法醫(yī)生物統(tǒng)計(jì)中應(yīng)用

ApplicationofIDproofMixtureSoftwarePackagetoSTRAnalysisandForensicBiologicalStatistics

劉亞舉1，孫現(xiàn)鋒2

目的探討IDproof Mixture軟件包在DNA個(gè)體識(shí)別數(shù)據(jù)分析中的應(yīng)用。方法采用AB 3130XL型測(cè)序儀電泳PCR產(chǎn)物，使用IDproof Mixture軟件包進(jìn)行STR片段分析和計(jì)算似然比率(likelihood ratio，LR)或隨機(jī)匹配概率(probability of random match，Pm)。結(jié)果該軟件包不僅能對(duì)STR電泳數(shù)據(jù)進(jìn)行分析判型，而且能進(jìn)行DNA識(shí)別數(shù)據(jù)的分析。結(jié)論IDproof Mixture軟件包操作簡(jiǎn)單，兼具判型、統(tǒng)計(jì)計(jì)算和混合斑分析功能，在法醫(yī)DNA檢驗(yàn)中有重要意義。

STR片段分析；個(gè)體識(shí)別；混合斑分析；法庭生物統(tǒng)計(jì)

在法醫(yī)DNA檢驗(yàn)過(guò)程中，STR電泳獲得的原始數(shù)據(jù)，一般先要用GeneMapper軟件進(jìn)行分析判型。然后再用專門的軟件或人工計(jì)算似然率(likelihood ratio,LR)，親權(quán)指數(shù)(paternity index,PI)等證據(jù)強(qiáng)度指標(biāo)。其間涉及的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)移、格式轉(zhuǎn)換等，不僅增加操作量，而且增加出錯(cuò)機(jī)會(huì)。本文介紹的IDproof Mixture Software是一款多功能的STR分析工具，該軟件不僅具有批量數(shù)據(jù)處理、質(zhì)量報(bào)告生成、STR判型、圖譜顯示等基礎(chǔ)功能，還可以進(jìn)行同一性比對(duì)，混合斑分析等DNA分型結(jié)果的統(tǒng)計(jì)計(jì)算。該軟件支持國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上多種PCR擴(kuò)增試劑盒，兼容AB3130或3500系列測(cè)序儀電泳數(shù)據(jù)。該軟件具有界面友好、操作簡(jiǎn)便、結(jié)果清晰、自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)。使用者可訪問(wèn)www.qiagen.com/IDproofMixture自由下載，但免費(fèi)版的功能和使用期限會(huì)受到一定限制。

1 軟件的啟動(dòng)與設(shè)置

下載后，點(diǎn)擊Desktop進(jìn)行安裝，安裝后打開(kāi)桌面IDproof Mixture Software，從菜單欄Window模塊Preference中的 Licensing注冊(cè)，注冊(cè)后自動(dòng)生成Admin(管理員)和Default(實(shí)驗(yàn)室主任)兩個(gè)角色。然后用管理員角色登錄，一方面可以從菜單欄Security模塊User View中建立其他角色，如技術(shù)主管、實(shí)驗(yàn)室人員等，并設(shè)定角色的權(quán)限；另一方面通過(guò)Reference Data模塊對(duì)以下項(xiàng)目進(jìn)行添加、刪除、更改等設(shè)置：①M(fèi)arkers(基因座)；②Test Kits(擴(kuò)增試劑盒)；③Size Standards(片段分析標(biāo)準(zhǔn))；④Populations(人群)，打開(kāi)Populations后，在Population Manager中選擇Chinese(Han)進(jìn)行編輯，可以對(duì)Frequencies設(shè)定，在Source框內(nèi)描述參考文獻(xiàn)的來(lái)源等。對(duì)該軟件的日常使用，則以管理員外的其他角色登錄，本文的介紹是以Default角色登錄進(jìn)入(軟件窗口下方的狀態(tài)欄可以顯示)。

2 軟件的使用介紹

法醫(yī)DNA提取、PCR擴(kuò)增、電泳檢測(cè)等已形成完整成熟的技術(shù)檢驗(yàn)體系，而下游DNA數(shù)據(jù)的分析統(tǒng)計(jì)及信息挖掘還有很大的潛在空間。IDproof Mixture Software能夠兼容多種形式的電泳檢測(cè)數(shù)據(jù)，本文主要敘述fsa或hid數(shù)據(jù)形式的分析應(yīng)用，其中以嫌疑人(男)和受害人(女)的2人混合STR分析演示軟件的使用過(guò)程。

2.1STR片段分析

首先，建立STR片段分析結(jié)果的保存文件夾。打開(kāi)軟件，在File列表中點(diǎn)擊New，選擇New Examination，在出現(xiàn)的對(duì)話框中，填寫Number(命名根據(jù)自己的習(xí)慣)，點(diǎn)擊Finish。

第2步，AB系列測(cè)序儀電泳數(shù)據(jù)的導(dǎo)入與分析。在已打開(kāi)的軟件中，點(diǎn)擊工具欄+符號(hào)(Open Workspace)，在主界面左側(cè)出現(xiàn)上述新建的文件夾，在該文件夾中點(diǎn)擊Sample(顏色變暗)。從Operations列表中點(diǎn)擊Import，選擇Import Raw Data form files，在出現(xiàn)的對(duì)話框中，點(diǎn)擊AB FSA/HID，按下Next；在Properties區(qū)域，點(diǎn)擊Add Files，找到原始數(shù)據(jù)保存路徑，選擇電泳數(shù)據(jù)(結(jié)合鍵盤Shift或Ctrl鍵)，按下Open，數(shù)據(jù)就出現(xiàn)在下方窗口，點(diǎn)擊需要修改的數(shù)據(jù)(顏色變暗)，可以在窗口上方的Sample type、Size standard、Test kit等選項(xiàng)進(jìn)行設(shè)置，設(shè)置后點(diǎn)擊Apply to selection，其中的Analysis method默認(rèn)為EasyRead(點(diǎn)擊Edit，可對(duì)一些參數(shù)設(shè)置)；按Finish，再按Yes，最后按OK即可,先對(duì)等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物L(fēng)adder分析，然后是陽(yáng)、陰性對(duì)照，最后是檢測(cè)樣本，分析結(jié)果存于 Sample文件夾內(nèi)。

在分析過(guò)程中，首先數(shù)據(jù)的處理從3個(gè)方面進(jìn)行：①原始數(shù)據(jù)處理Raw Data Analysis：確定分析范圍Auto-Range，使峰形圖更加光滑smooth，起點(diǎn)統(tǒng)一到原始點(diǎn)Baseline substraction，刪除連帶的峰pull-up Correction，去掉毛刺Spike Removal；②Size call：主要是進(jìn)行由時(shí)間到堿基長(zhǎng)度的轉(zhuǎn)化；③Allele call：選擇分析范圍，設(shè)置峰的強(qiáng)度范圍50～30 000。最后進(jìn)行：①自動(dòng)校正Panel，自動(dòng)挑選最合適的Ladder；②選擇陰陽(yáng)性對(duì)照；③Allele Peak分?jǐn)?shù)閾值；④混合樣本判斷閾值。分析結(jié)束后，將顯示并總結(jié)導(dǎo)入數(shù)據(jù)的分析結(jié)果，點(diǎn)擊show analysis summary 即可看到分析總結(jié)，其中√表示質(zhì)量很好；﹗表示結(jié)果可以接受，但需要查看一下；√√表示質(zhì)量好，質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)達(dá)到了，但是Size standard 被修改過(guò)。

第3步，STR數(shù)據(jù)的核查對(duì)照。打開(kāi)Sample文件夾，選擇某一樣品原始數(shù)據(jù)，從菜單欄Electropherogram中，點(diǎn)擊Electropherogram，窗口會(huì)展示峰形圖和分型結(jié)果。如果檢測(cè)到stutter峰、shoulder峰、off-ladder、off-scale、3-band patterns或者overlap過(guò)高過(guò)寬峰，即顯示。同樣可以進(jìn)行Size Calling Regression和Panel Representation操作，還可利用工具欄項(xiàng)目對(duì)分型圖進(jìn)行處理。

2.2法醫(yī)生物統(tǒng)計(jì)計(jì)算

2.2.1DNA數(shù)據(jù)的同一性比對(duì) 主要有3種情況：①現(xiàn)場(chǎng)生物檢材DNA與嫌疑人DNA的同一性比對(duì)；②通過(guò)查找DNA數(shù)據(jù)庫(kù)，比對(duì)與現(xiàn)場(chǎng)生物檢材DNA吻合的個(gè)體；③2份現(xiàn)場(chǎng)生物檢材來(lái)自同一個(gè)體的比對(duì)，日常工作中一般利用繁瑣的人工方法計(jì)算似然比率或隨機(jī)匹配概率。打開(kāi)Sample文件夾，選擇某一樣品原始數(shù)據(jù)，從菜單欄Operations中，點(diǎn)擊Biostatistics，按ID Probability，選擇alleles作為計(jì)算的標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)擊Next，選擇種族人群基因頻率用來(lái)計(jì)算分型概率，點(diǎn)擊Finish，顯示計(jì)算結(jié)果，如Genotype Frequency、Ratio、Probability，結(jié)果存于 Probability of Identity 文件夾內(nèi)。

2.2.2混合斑的個(gè)體識(shí)別 男女血細(xì)胞[1]、混合上皮細(xì)胞[2]等單細(xì)胞分離檢驗(yàn)技術(shù)在基層DNA實(shí)驗(yàn)室還沒(méi)有普及，檢出完整混合STR分型時(shí)檢材已耗盡，無(wú)法進(jìn)入DNA數(shù)據(jù)庫(kù)，遇到重大疑難案件依靠專家建立數(shù)學(xué)模型進(jìn)行解釋[3-4]或拆分[5]輸入DNA數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，還有就是通過(guò)計(jì)算峰面積推斷出供者STR分型圖譜，但是其過(guò)程復(fù)雜，結(jié)論也很難確定，往往只能給出模糊結(jié)論，這樣就大大降低了現(xiàn)場(chǎng)檢材的應(yīng)用價(jià)值。打開(kāi)Sample文件夾，選擇某一混合樣品原始數(shù)據(jù)，從菜單欄Operations中，點(diǎn)擊Biostatistics，按Likelihood Ratio(LR，似然比率)，混合樣本顯示在分析窗口，選擇種族人群基因頻率用來(lái)計(jì)算LR，按OK和Next，對(duì)話框Available Elements區(qū)域包含所有的參照樣本，可以點(diǎn)擊Fixed、Reference拖拽到Fixed Elements和Reference Elements區(qū)域，然后點(diǎn)擊Finish，顯示LR計(jì)算結(jié)果，并存于 Likelihood Ratio文件夾內(nèi)。同樣可以進(jìn)行Random Man Not Excluded(RMNE)操作，結(jié)果存于相應(yīng)的文件夾內(nèi)。無(wú)論是STR分析，還是統(tǒng)計(jì)計(jì)算，結(jié)果可以導(dǎo)出或輸出。選擇Sample(或LR、RMNE)文件夾內(nèi)原始數(shù)據(jù)，從菜單欄Operations中，點(diǎn)擊Export或Reports即可進(jìn)行操作。

3 討論

目前國(guó)內(nèi)DNA實(shí)驗(yàn)室使用似然比率或隨機(jī)匹配概率進(jìn)行單一來(lái)源生物檢材的描述，包括從DNA數(shù)據(jù)庫(kù)查找嫌疑人的同一認(rèn)定、現(xiàn)場(chǎng)生物檢材與嫌疑人比對(duì)樣本的同一認(rèn)定、2份現(xiàn)場(chǎng)生物檢材來(lái)自同一個(gè)體的比對(duì)認(rèn)定，方法科學(xué)合理、比較成熟，也是IDproof Mixture軟件Biostatistics模塊ID Probability的功能。本文所探討的混合斑是指2人份混合樣本類型，包括：兩個(gè)嫌疑人、嫌疑人與一無(wú)名氏、嫌疑人與受害人樣本的混合，是工作中最為常見(jiàn)的情況，而鑒定意見(jiàn)只是簡(jiǎn)單地描述為“包含有某某和某某的DNA分型(譜帶、峰譜)”，缺少統(tǒng)計(jì)學(xué)的分析說(shuō)明。因此，IDproof Mixture軟件彌補(bǔ)了這方面的不足，其就是利用構(gòu)建的混合斑及參照樣本的模型，計(jì)算個(gè)體包含在混合斑中的似然比率，從而解釋個(gè)體就是嫌犯提供科學(xué)依據(jù)。隨著鑒定人出庭制度的完善，法官或律師將會(huì)對(duì)法醫(yī)DNA鑒定意見(jiàn)的依據(jù)進(jìn)行質(zhì)詢，而此款軟件的出現(xiàn)，能夠?yàn)镈NA技術(shù)員帶來(lái)許多便利，滿足實(shí)際工作需要。

另外，此款軟件解決了“人與物、物與物”的DNA統(tǒng)計(jì)計(jì)算，也是混合樣品分析的杰出軟件；而其姊妹軟件IDproof Software是親緣關(guān)系分析和人群遺傳分析軟件，可以解決“人與人”的DNA統(tǒng)計(jì)計(jì)算，主要應(yīng)用是：親緣關(guān)系分析(包括親緣關(guān)系比對(duì)、親緣關(guān)系中不相符等位基因的關(guān)聯(lián)查詢、三聯(lián)體分析)和親子鑒定(失蹤人員認(rèn)定、同源同胞關(guān)系比對(duì))。這兩款軟件的功能涵蓋了法醫(yī)DNA檢驗(yàn)的后續(xù)工作(即人和物、物和物、人和人等比對(duì)的統(tǒng)計(jì)計(jì)算)，對(duì)法醫(yī)檢材STR數(shù)據(jù)和親緣關(guān)系鑒定樣本進(jìn)行智能分析，聯(lián)合應(yīng)用會(huì)極大地解決DNA檢驗(yàn)者所面臨的問(wèn)題?？傊?，這兩款軟件與市售測(cè)序儀輸出數(shù)據(jù)全部兼容，能夠進(jìn)行原始數(shù)據(jù)分析、生物統(tǒng)計(jì)評(píng)估、親屬關(guān)系分析和人種(群)研究、混合樣本分析，并能編輯模板和輸出報(bào)告。

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2014-10-07

1.許昌市公安局刑事科學(xué)技術(shù)研究所，河南許昌 461000 2.禹州市公安局刑偵大隊(duì)，河南禹州 461670

劉亞舉(1978-)，男，河南襄城人，副主任法醫(yī)師，從事DNA檢驗(yàn)及法醫(yī)遺傳學(xué)統(tǒng)計(jì)工作。

DF795.2

B

1672-688X(2014)04-0304-03