關(guān)亞鵬，婁　忻，張　莉，張雪霞，時(shí)　蕾

(華北制藥集團(tuán)新藥研究開發(fā)有限責(zé)任公司 微生物藥物國家工程研究中心河北省工業(yè)微生物代謝工程技術(shù)研究中心，河北 石家莊 050015)

硒元素具有重要的生理功能，作為一種人體必需的微量元素已經(jīng)引起人們的高度重視。人體缺硒會(huì)導(dǎo)致癌癥、心肌梗塞等多種重大疾病，而天然食品中的硒含量普遍較低[1-2]。目前，補(bǔ)充硒的方式主要有兩種：無機(jī)硒和有機(jī)硒。無機(jī)硒主要以亞硒酸鈉為主，但其毒性遠(yuǎn)大于有機(jī)硒，而酵母本身的營養(yǎng)豐富，且轉(zhuǎn)化無機(jī)硒的能力也很強(qiáng)，所以通過富硒酵母補(bǔ)充硒元素是一種安全有效的途徑[3-5]。

目前，國內(nèi)關(guān)于富硒酵母誘變方法的研究比較多，如采用紫外誘變、硫酸乙二酯(DES)誘變、60Co-γ射線輻照等物理和化學(xué)方法[6-8]。近年來，氦氖激光誘變?cè)谖⑸镞z傳育種方面的應(yīng)用越來越多。氦氖激光誘變機(jī)理尚不明確，可能的原因是激光的穿透作用使細(xì)胞內(nèi)的一些重要物質(zhì)發(fā)生不可逆的變化，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)各種代謝機(jī)制紊亂，代謝過程受阻，表現(xiàn)為細(xì)胞分裂遲緩或死亡[9-10]。作者在此采用紫外誘變結(jié)合氦氖激光輻照誘變方法篩選到了一株高產(chǎn)富硒酵母。

1　實(shí)驗(yàn)

1.1　菌種、培養(yǎng)基與儀器

釀酒酵母FX-12-135，自行保存。

分離培養(yǎng)基：葡萄糖，蛋白胨，酵母粉，瓊脂。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖，酵母粉等。

發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖，蛋白胨，酵母粉。

紫外燈(30 W)；He-Ne-1000型氦氖激光儀。

1.2　誘變方法

1.2.1菌懸液的制備

將初始菌種成熟斜面加入無菌水，刮下菌體，經(jīng)振蕩、玻璃珠打散，過濾后制成菌懸液，逐級(jí)稀釋至適宜濃度，待用。

1.2.2紫外誘變處理

將菌懸液置于平皿中，在距離紫外燈32 cm處進(jìn)行30～180 s的照射處理，時(shí)間間隔為30 s。將照射后的菌懸液稀釋到一定濃度，涂布于固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，挑選菌落，進(jìn)行初篩和搖瓶篩選，以未經(jīng)紫外線照射的菌液作為對(duì)照，計(jì)算致死率；根據(jù)搖瓶篩選結(jié)果計(jì)算正突變率，正突變率以富硒水平高于出發(fā)菌種水平的突變株數(shù)量計(jì)算。

1.2.3氦氖激光誘變處理

取適量菌懸液置于無菌的石英小皿中進(jìn)行氦氖激光(功率18 mW，距離20 cm)輻照，輻照時(shí)間分別為20 min、30 min、40 min、50 min、60 min、70 min、80 min；將處理菌液稀釋至合適濃度，取適量涂布于固體平板上，28 ℃培養(yǎng)2 d，待菌落成熟后進(jìn)行菌落初篩和搖瓶篩選，根據(jù)搖瓶篩選結(jié)果計(jì)算菌種的正突變率。

1.3　初篩和搖瓶篩選

以菌落大小和菌落形態(tài)作為篩選指標(biāo)，挑選生長(zhǎng)快、直徑較大的單菌落轉(zhuǎn)接于正常固體平板(不含硒)和含硒(300 μg·g-1)平板上，并做好標(biāo)記，位置一一對(duì)應(yīng)。單菌落培養(yǎng)2 d后，選取在含硒平板上長(zhǎng)勢(shì)良好、顏色微紅的單菌落對(duì)應(yīng)的正常固體培養(yǎng)基上的單菌落傳斜面培養(yǎng)。然后進(jìn)行搖瓶復(fù)篩，發(fā)酵過程中補(bǔ)加一定量的亞硒酸鈉，發(fā)酵結(jié)束測(cè)定有機(jī)硒含量。

1.4　干酵母的制備

取一定量搖瓶發(fā)酵液，在3 000 r·min-1條件下離心10 min，去上清，加入一定量蒸餾水，洗滌、離心菌體，反復(fù)操作3次，得到新鮮酵母，于80 ℃烤箱內(nèi)干燥6 h，即得到干酵母。

1.5　硒含量的測(cè)定[11]

采用3，3-二氨基聯(lián)苯胺比色法測(cè)定酵母中有機(jī)硒含量(μg·g-1)。

2　結(jié)果與討論

2.1　紫外誘變突變株的篩選

初始菌株FX-12-135經(jīng)不同時(shí)間紫外誘變后的致死率和正負(fù)突變率見表1。

表1紫外誘變時(shí)間對(duì)初始菌種FX-12-135生長(zhǎng)的影響

Tab.1EffectsofUVmutationtimeongrowthoforiginalstrainFX-12-135

紫外誘變時(shí)間/s致死率/%正突變率/%負(fù)突變率/%303115896604956513190627811571208861331091509691149218099833118

由表1可見，隨著紫外誘變時(shí)間的延長(zhǎng)，菌株的致死率逐漸上升；當(dāng)紫外誘變時(shí)間為120 s時(shí)，菌株的致死率比較適宜，正突變率最高，達(dá)到了13.3%；當(dāng)誘變時(shí)間為180 s時(shí)，菌株的致死率接近100%，正突變率很低。因此，確定最佳紫外誘變時(shí)間為120 s。

初始菌株FX-12-135的菌懸液經(jīng)紫外照射120 s后涂布平板，挑選155個(gè)培養(yǎng)成熟的單菌落進(jìn)行菌落初篩和搖瓶篩選，得到21支相對(duì)高富硒菌株，挑選其中10支高產(chǎn)菌株進(jìn)行復(fù)試驗(yàn)證，得到菌株UV-13-62，經(jīng)3批搖瓶復(fù)試驗(yàn)證其富集有機(jī)硒能力比出發(fā)菌株提高11.6%。

2.2　氦氖激光誘變突變株的篩選

將紫外誘變得到的菌株UV-13-62斜面制成菌懸液，經(jīng)不同時(shí)間的氦氖激光輻照后，搖瓶篩選計(jì)算菌株的正突變率。氦氖激光輻照時(shí)間對(duì)菌株UV-13-62生長(zhǎng)的影響見圖1。

圖1　氦氖激光輻照時(shí)間對(duì)菌株UV-13-62生長(zhǎng)的影響

由圖1可見，在20～60 min時(shí)菌株的正突變率隨著氦氖激光輻照時(shí)間的延長(zhǎng)而增大；輻照時(shí)間為60 min時(shí)，正突變率最高；超過60 min后，正突變率下降。因此，確定氦氖激光最佳輻照時(shí)間為60 min。

選取氦氖激光輻照60 min的219個(gè)單菌落培養(yǎng)2 d，進(jìn)行菌落初篩和搖瓶篩選，得到36支正突變菌株，挑選富硒水平高于出發(fā)菌株UV-13-62 10%以上的15支菌株進(jìn)行3批搖瓶復(fù)試，以有機(jī)硒含量為篩選指標(biāo)，篩選得到了一株高產(chǎn)菌株HN-14-109，其富集有機(jī)硒能力比UV-13-62提高16.3%，比初始菌株FX-12-135累計(jì)提高29.8%。

2.3　復(fù)合誘變突變株遺傳穩(wěn)定性研究

對(duì)菌株HN-14-109連續(xù)傳代3次，4代斜面同時(shí)進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，考察其遺傳穩(wěn)定性，結(jié)果見表2。

表2菌株HN-14-109的遺傳穩(wěn)定性

Tab.2GeneticstabilityofstrainHN-14-109

傳代數(shù)F1F2F3F4相對(duì)硒含量/%100010261015983

由表2可看出，4代斜面菌株發(fā)酵后的有機(jī)硒含量波動(dòng)不大，說明菌株HN-14-109沒有發(fā)生回復(fù)突變，具有比較穩(wěn)定的遺傳特性。

3　結(jié)論

以釀酒酵母FX-12-135為初始菌株，以有機(jī)硒含量為篩選指標(biāo)，篩選高產(chǎn)富硒酵母菌。首先采用紫外誘變方法處理菌株，然后利用氦氖激光輻照處理進(jìn)行選育,得到一株高產(chǎn)突變株HN-14-109，其搖瓶富硒能力比初始菌株提高29.8%，且遺傳特性穩(wěn)定。表明紫外誘變復(fù)合氦氖激光輻照是提高酵母富硒能力的有效方法。

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