趙紅霞，梁 勤，羅岳雄，李江紅，張學鋒，曾鑫年

(1.廣東省昆蟲研究所，廣州 510260;2.華南農(nóng)業(yè)大學，廣州 510642;3.福建農(nóng)林大學，福州 350002)

蜜蜂白堊病(bee chalkbrood disease)是由蜜蜂球囊菌Ascosphaera apis 萌發(fā)的菌絲侵入蜜蜂幼蟲中腸圍食膜引起的真菌性傳染病。我國飼養(yǎng)西方蜜蜂的蜂群達750 萬群，白堊病是影響我國養(yǎng)蜂業(yè)發(fā)展的潛在病害之一。人類活動范圍擴大和交流頻繁，西方蜜蜂蜂群幾乎遍布世界各地，人們對蜂產(chǎn)品需求的增加，過度索取蜂產(chǎn)品，導致蜜蜂抗逆性降低，直接影響該病的爆發(fā)。

隨著蜜蜂白堊病作為第一個內(nèi)生真菌完成了基因組的測序工作(Qin et al.，2006)，蜜蜂白堊病逐漸從分子機制層開展了研究，這將有助于深入探討球囊菌病原學，便于更好的防控該病。本文就蜜蜂白堊病的研究現(xiàn)狀，分別從該病的發(fā)生分布范圍、分類學、流行病學、發(fā)病機理、蜜蜂的免疫反應(yīng)、生物防治等方面進行綜述。

1 蜜蜂白堊病的發(fā)生及其分布情況

早在1900年，人們就開始認識到蜜蜂白堊病的發(fā)生。1901年，Odier 描述過白堊病的發(fā)病情況;1911年P(guān)riess 在德國漢諾威省的患病蜂群的巢脾中發(fā)現(xiàn)過該病，當?shù)仞B(yǎng)蜂者將該病稱為“白堊病”;1913年德國的科學家對白堊病的發(fā)生進行簡單闡述(Maassen，1913);接著波蘭、法國、前蘇聯(lián)、捷克斯洛伐克等國家先后報道過該病;1930年英國首次報道了白堊病的發(fā)生;1955年美國鑒定出致病微生物是一種真菌。此病在1963年以前主要發(fā)生在歐洲各國，因患病蜂群少損失小而被列為次要病害。

直到1970年以后迅速傳播至美國、加拿大、日本、阿根廷、菲律賓等國(Hitchcock and Christensen，1972)。1969-1975年，相繼在加利福尼亞(Hitchcock and Christensen，1972)、亞利桑那州、內(nèi)布拉斯加州、懷俄明州等(Gilliam，1978)發(fā)現(xiàn)該病并嚴重阻礙蜂業(yè)發(fā)展。與此同時，在加拿大的中西部地區(qū)白堊病發(fā)生流行危害(Hitchcock and Christensen，1972)。

1987年之前，地中海國家并未見報道過蜜蜂白堊病發(fā)生流行，雖然有些國家蜂群中發(fā)生過該病，例如1984年，以色列發(fā)現(xiàn)過白堊病，但其發(fā)病率較低，并未引起關(guān)注(Yacbson et al.，1991)。1988年，白堊病在土耳其蜂蜜主產(chǎn)區(qū)規(guī)模爆發(fā)，危害及其嚴重。調(diào)查顯示1986-1988年間主要通過蜂蠟出口，將白堊病傳播至其他國家(Tutkun et al.，1993)。1990年，白堊病感染的蜂群數(shù)量逐漸增多(Yacobson et al.，1991)。

澳洲地區(qū)蜜蜂白堊病的發(fā)生流行比較晚，直到1993年白堊病首次在澳大利亞昆士蘭地區(qū)發(fā)生流行，然后傳播至整個澳洲地區(qū)(Hornitzky，2001)。蜜蜂白堊病在澳洲與北美的迅速傳播歸咎于商業(yè)養(yǎng)蜂的轉(zhuǎn)地飼養(yǎng)。

中國大陸于1961年曾報道發(fā)生類似蜜蜂白堊病的病害(陳淑靜等，1994)，但僅是零星蜂場、個別蜂群染病，未造成危害，故而未受到重視。1983年，我國臺灣省三峽地區(qū)首次發(fā)生蜜蜂白堊病，由于該時期正處于轉(zhuǎn)地放蜂時期，于是此病很快蔓延至臺灣全省，成為臺灣地區(qū)蜜蜂主要病害。1991年中國大陸江蘇揚州、浙江寧波等地出現(xiàn)蜜蜂白堊病;直到1992年暴發(fā)流行，并且擴散至十多個省區(qū)，至1993年已遍及全國所有的蜜蜂飼養(yǎng)區(qū)。1992-1993年全國的意大利蜜蜂蜂群發(fā)病率達30%-40%，其中四川、浙江、江蘇、安徽等重病區(qū)的蜂群發(fā)病率高達50%-60%，嚴重地影響?zhàn)B蜂業(yè)的發(fā)展。1996年以來，蜜蜂白堊病的發(fā)病率總體雖呈下降趨勢，但在部分地區(qū)仍然很嚴重(Zaghloul et al.，2005)，仍是影響當?shù)仞B(yǎng)蜂業(yè)發(fā)展的主要病害。2005年5月，中華人民共和國農(nóng)業(yè)部第53 號令公布的《動物病原微生物分類名錄》也將白堊病蜂球囊菌定為三類動物病原微生物。

2 分類學

球囊菌屬中包含一些腐生生物和一些病原微生物。迄今為止，已經(jīng)鑒定出球囊菌屬的22個種，它們以致病性真菌或腐生菌存在于蜜蜂體內(nèi)(Hibbett et al.，2007)。先前僅僅依靠形態(tài)學，很難對球囊菌進行分類。近年來，隨著分子生物學的發(fā)展，一些分子生物學技術(shù)被用于球囊菌的分類和鑒定，并取得了成功。Reynaldi 等(2003)利用同工酶技術(shù)，成功將蜜蜂球囊菌Ascosphaera apis與同屬 Ascosphaera proliperda、Ascosphaera aggregata 區(qū)分開。

Hassan 等(1985)用Rep-PCR 方法鑒定不同的蜜蜂球囊菌菌株，但是這種方法需要純化蜜蜂球囊菌。James 等(2006)根據(jù)球囊菌屬核糖體保守序列設(shè)計不同引物，進行PCR 擴增，成功將球囊菌屬和與之最相近的屬區(qū)分開來。此方法不但有很高的靈敏性，而且可以鑒定各個種的混合感染。目前，采用DNA 技術(shù)將蜜蜂白堊病的病原物歸為子囊菌門 Ascomycota、子囊菌亞門Pezizomycotina、散囊菌綱Eurotiomycetes、散囊菌亞綱Eurotiomycetidae、散囊菌目Onygenales、子囊球菌科 Ascosphaeraceae、囊球菌屬 Ascosphaera(Lumbsch and Huhndorf，2007)。

3 流行病學

在春季，白堊病是西方蜜蜂主要病害之一，真菌極易于冷熱交替和高濕度(通風差)的環(huán)境中繁殖(Borum and Ulgen，2008)。除了環(huán)境因素，諸如真菌的菌株特點和蜜蜂的遺傳背景等生物因子也影響該病的發(fā)病率和病害的嚴重性。關(guān)于真菌菌株，不同球囊菌的品系侵染差異達20 倍(Glinski，2003)，高濃度的真菌孢子增加了感染機率(Gilliam et al.，1988;Flores et al.，2005a;2005b)。在蜂群中，白堊病發(fā)病的速度取決于特定的球囊菌品系、球囊菌孢子萌發(fā)的速度和孢子擴散的有效性。

蜜蜂的遺傳背景、健康狀況和壓力都是影響白堊病發(fā)生的重要因子，因此，許多研究通過選擇性育種技術(shù)，改善蜜蜂的品系，達到耐受白堊病的目的(Gilliam et al.，1983;Spivak and Reuter，1998a;1998b)。由于預(yù)先存在的壓力，諸如生物和非生物因子都削弱了蜜蜂先天性免疫反應(yīng)，導致易受病害危害(Flores et al.，1996;Bailey，1981)。防治白堊病最重要的是改進飼養(yǎng)管理策略。

4 發(fā)病機理

兩性孢子最初被認為是幼蟲染病的主要因子(Spiltoir，1955;Hitchcock and Christensen，1972;Rose et al.，1984)。早期的研究得出孢子首先侵染幼蟲表皮，然后被攝取吸收(Matus and Sarbak，1974;Gilliam et al.，1978)?，F(xiàn)在廣泛認為球囊菌孢子被幼蟲消化吸收致其發(fā)病(Flores et al.，1996;Heath，1982)。球囊菌可以感染三型蜂(工蜂，雄蜂和蜂王)的幼蟲。根據(jù)Bailey(1963，1981)報道，3-4 日齡幼蟲易被感染，而其他研究者發(fā)現(xiàn)1-2 日齡幼蟲也容易感染(De，1976)。鄭志陽等(2010)證實室內(nèi)飼養(yǎng)的蜜蜂幼蟲，菌絲均在幼蟲7 日齡末至8 日齡從幼蟲末端穿出體表。成年蜜蜂雖然不受球囊菌危害，但是在病原物的傳播中起著媒介作用;成年蜜蜂間通過互哺行為導致病原物的傳遞;采集蜂攜帶真菌孢子的蜜源食物返回巢內(nèi)，然后被孢子感染的食物通過哺育幼蟲的過程傳遞，致其幼蟲發(fā)病(Gilliam and Vandenberg，1997)。蜂箱或巢框等蜂機具中蜜蜂球囊孢子至少可以存活15年，因此，這類蜂機具可能作為白堊病發(fā)生流行的源頭(Anderson，1997)。

蜜蜂幼蟲通過腸道內(nèi)的CO2，促進球囊菌孢子的萌發(fā)。幼蟲被球囊菌感染后，快速減少消耗食物，最后停止取食。Theantana and Chantawannakul(2008)證實，球囊菌產(chǎn)生的胞外酶輔助其侵染幼蟲中腸圍食膜。球囊菌侵入中腸腸壁后，菌絲開始進入體腔生長，甚至侵入幼蟲后腸(Koenig，1987;Nelson and Gochnauer，1982)。蜜蜂球囊菌從幼蟲體后生成并逐漸覆蓋整個幼蟲。然后，球囊菌菌絲生長變?yōu)樽厣蚝谏咦?，改變了菌絲的大小和顏色，這種變化形式是由于球囊菌子實體的生成。蜜蜂幼蟲的死亡源于機械損傷、酶活性改變、血淋巴循環(huán)的破壞和毒性的產(chǎn)生等原因(Glinski et al.，2003)。

從表觀癥狀觀察球囊菌感染蜜蜂幼蟲體的變化過程，首先幼蟲直立在巢房內(nèi)，腫脹，微軟，后期失水縮小成堅硬的塊狀物，甚至形成干燥和白堊病干癟狀;而顏色是白色或黑色，均依賴于是否子實體已經(jīng)出現(xiàn)(Flores et al.，2004)。實驗室顯微鏡觀察每個黑色蟲體包含108-109個子實體(Hornitzky，2001)，白色蟲體未檢測到子實體(Hornitzky，2001;Aronstein，unpublished)。

單一交配型菌絲侵染幼蟲后，形成了白色蟲體(Davis，2003);單一交配型菌絲并未顯示感染性且不能產(chǎn)生無性孢子。最初采用白色蟲尸分離純化培養(yǎng)真菌，在培養(yǎng)的過程中分離形成子囊孢子(Aronstein，unpublished)。假設(shè)球囊菌的一個交配類型抑制了另外一個交配類型或者兩種交配類型不等量分布在環(huán)境中，幼蟲被侵染后形成白色蟲體，一般兩種相反的類型不會同時出現(xiàn)在實驗室內(nèi);所以在自然環(huán)境中，不同交配類型產(chǎn)生差異的侵染行為(Christensen and Gilliam，1983)。因此，蜜蜂幼蟲感染球囊菌后，發(fā)病期短形成白色蟲體;如果給予足夠的時間和適當?shù)臈l件，白色菌絲最終發(fā)展形成球囊菌子實體。

5 蜜蜂免疫防御反應(yīng)

病原性真菌通過破壞昆蟲的主要物理屏障(表皮和圍食膜)進行感染(Barr，1975)。但是，蜜蜂的免疫系統(tǒng)協(xié)同作用可滅活或殺死侵入的微生物(Hedengren-Olcott et al.，2004)。首先，蜜蜂體外表皮中的化學物質(zhì)如蠟質(zhì)和不飽和脂肪酸具有潛在的抗真菌活性(GlinSki，2001);其次，中腸的生化環(huán)境提供了防御食源性真菌性病原物的條件;另外，受傷部位快速激起傷口周圍的蛋白水解，導致血液凝固形成黑色素凝塊，防止傷口處血淋巴的流失。而黑色素的副產(chǎn)物使活性氧釋放，具有細胞毒素抗菌的特性(Davis，2008)。當外在的物理屏障破壞后，侵入的真菌將面對各種生理性的細胞層面和體液性免疫防衛(wèi)(Glinski，2003)。病原侵入后，立即檢測到血淋巴中細胞免疫反應(yīng)，而抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)明顯出現(xiàn)滯后性(Govind，2008;Stanley，2009)。吞噬作用和包囊作用屬于蜜蜂防御真菌性病害的普遍防衛(wèi)機制，血細胞直接殺死真菌孢子，而吞噬機制是破壞其他的未知小分子而殺滅真菌孢子(Stroschein-Stevenson et al.，2009)。激活的體液免疫誘導抗菌肽的合成和溶菌酶活性，激活了酚氧化酶系統(tǒng)。

基于果蠅和蚊子模型，探討昆蟲體液免疫的相關(guān)機制。果蠅的體液免疫主要有兩個信號路徑(Evans et al.，2006)。第一個信號路徑由真菌和革蘭氏陽性菌引起;第二個Relish 信號路徑主要由革蘭氏陰性菌和一些革蘭氏陽性菌病原引起(Govind，2008;Evans and Spivak，2010);這兩個信號路徑均能激發(fā)脂肪體和血細胞中抗菌肽(AMPs)的合成。許多AMPs可以通過形成氣孔殺死或失活侵入的病原菌，同時突變的果蠅顯示易受真菌和細菌的危害，因此兩個主要信號路徑是相互調(diào)節(jié)相互影響，蜜蜂信號路徑中相關(guān)物質(zhì)已經(jīng)得到驗證(Evans et al.，2006)。然而，蜜蜂的微生物識別和信號路徑的機制仍然不甚明了。從基因組層面分析，蜜蜂減少的免疫相關(guān)因子可能舊咎于單個蜜蜂微生物的防御，然后，存在一些免疫防衛(wèi)需要基于群體水平發(fā)揮作用，如蜂群衛(wèi)生行為(Evans and Spivak，2010)。

目前，蜜蜂對白堊病免疫防衛(wèi)的相關(guān)分子機制研究相對較少(Aronstein and Saldivar，2005;Aronstein et al.，2006)。在蜜蜂球囊菌、美洲幼蟲腐臭病(革蘭氏陽性菌)和大腸桿菌(革蘭氏陰性菌)感染5 日齡幼蟲后，對蜜蜂體內(nèi)的3個溶菌酶和幾個抗菌肽(天蠶素、抗菌肽和防御素等)的表達進行了研究。結(jié)果表明，雖然各種敗血癥感染快速引發(fā)蜜蜂溶菌酶和幾個抗菌肽，但未見任何一個反應(yīng)是由特定病原引起的。Tanji 等(2007)提出真菌侵染的過程中，激活Toll 信號路徑和IMD 信號路徑的分支c-Jun N-terminal kinases(JNK)路徑中各種物質(zhì)(Davis et al.，2008)，提出兩種路徑相互作用(Evans and Spivak，2010)。但是對于蜜蜂成蜂群如何識別球囊菌和其他真菌，真菌孢子，從而引發(fā)宿主的免疫信號路徑，尚需深入地分子機制研究。

6 白堊病的有效防治方法

廣泛的化學藥物施用控制白堊病的效果，已經(jīng)得到驗證(Davis and Ward，2003)。但是，Hornitzky(2001)試驗證實，一些藥物并非專一性防治真菌，故而無法有效控制白堊病。近些年來，由于蜂群中施用化學藥物，存在藥殘和耐藥性問題，探討科學有效防控白堊病的措施或手段極為迫切。本文就幾個有效和廣泛應(yīng)用的防治方法進行描述，這些方法包括改進蜜蜂的遺傳品系、改進管理和蜂場衛(wèi)生策略及天然產(chǎn)品防治等。

6.1 改進遺傳品系

蜜蜂衛(wèi)生行為指蜜蜂具有偵察監(jiān)測和移走病蟲或被寄生幼蟲的行為能力。目前，衛(wèi)生行為被認為是蜜蜂耐受各種幼蟲疾病的主要機制(Spivak and Reuter，2001)。具有衛(wèi)生行為的蜂群明顯減少了儲存在食物和巢脾蜂蠟中真菌孢子的數(shù)量，使這些蜂群抗白堊病能力大大增強，從而減少了白堊病的發(fā)生和化學藥物的使用(Lapidge et al.，2002)。鑒于蜂王繁殖的特點，一般通過選育具有衛(wèi)生行為蜂群的蜂王，進行白堊病預(yù)防。

近來的研究，研究者通過控制衛(wèi)生行為的基因及其相互作用，增加蜜蜂的遺傳多樣性，減少病害的發(fā)生(Tarpy，2003)。另外，衛(wèi)生行為的遺傳基礎(chǔ)涉及幾個基因和極其復雜的行為方式，并且表明增加了遺傳多樣性可能是減少白堊病爆發(fā)的關(guān)鍵(Goode et al.，2005)。

6.2 科學飼養(yǎng)管理

真菌孢子出現(xiàn)在蜂箱各處，具有長時間活性，是導致不斷感染的根源。孢子可能存在于蜜蜂儲存的花粉(Heath，1982a)、巢脾(Flores et al.，2005)及散裝的蜂蜜中(Anderson et al.，1997;Reynaldi et al.，2003)。20℃或30℃環(huán)境條件儲存蜂蜜兩年，分離出的孢子仍可以保持活性15年。

科學飼養(yǎng)管理和有效衛(wèi)生措施可以預(yù)防蜜蜂免白堊病受感染，這些措施包括輔助飼喂，改進營養(yǎng)，提高蜜蜂的健康狀況、保持蜂箱衛(wèi)生及其通風、使用干凈的器皿、每年替換子脾、避免蜂群之間的交互感染，通過嘗試不同的消毒方法測定蜂箱的孢子存活率。采用熏蒸消毒的方法處理蜂箱及其蜂具，但并未被廣泛的接受(Baggio et al.，2005)。伽馬輻照Cobalt-60 可以有效的殺滅舊巢框或蜜蜂巢脾的病菌等，在最佳的輻照水平(10 kGray)對蜂蠟無任何副作用(Wooton et al.，1985)，然而，輻照相關(guān)設(shè)備價格高不利于該措施的推廣和充分利用。采取了一些物理化學措施對蜂蜜處理后，導致酶活性降低，巢框變形或顏色改變。蜂箱加熱殺菌后易造成巢框變形。Anderson等(1997)證實對蜂蜜進行65℃水浴8 h 或70℃水浴2 h 后，球囊菌孢子被殺死，90℃以上加熱的蜂蜜導致焦糖化，改變了色澤;加熱后的蜂蜜羥甲基糠醛的含量增加且酶活降低了，因此，精確控制溫度進行蜂蜜殺菌，避免色澤改變。目前的研究集中在微波輻射、紅外線加熱、超聲波降解和超過濾技術(shù)等對蜂蜜進行處理，以盡量不影響蜂蜜的質(zhì)量(Subramanian et al.，2007)。

6.3 采用天然產(chǎn)物和微生物防控白堊病

鑒于白堊病已經(jīng)傳播至世界各地，且防治措施僅限于化學藥劑，故而有必要找到可替代的防治方法。天然產(chǎn)物防治將是可供選擇的有效真菌制劑。許多天然產(chǎn)物的抗真菌活性已經(jīng)測定，如尼泊爾的檸檬草油、檸檬香桉樹提取油、檸檬香茶樹提取油和新西蘭賣盧卡樹提取油對球囊菌均具有較好的抑制作用(Goettel and Duke，1996)。有機酸和對苯酸甲酯對切葉蜂的白堊病有治療效果(Martha，1998)。蜂糧(蜂蜜和水混合物)中加入1%天然產(chǎn)物精油對蜂群生長發(fā)育和繁殖無影響，卻能有效降低白堊病的發(fā)病率;天然巢脾內(nèi)的蜂糧中檢測到兩種抗霉菌物質(zhì)，能夠抑制蜜蜂球囊菌的生長(Martha and Gilliam，1998)。Reynald 對從蜂蜜中分離的需氧型抑制球囊菌孢子形成的細菌進行了研究(Reynaldi，2004)。此外，廣譜抗菌物質(zhì)(溶菌酶)和實驗室培養(yǎng)過程中拮抗真菌也可以用于控制白堊病(Mourad and Zaghloul，2005)。

健康蜜蜂的機體上共生著的一些微生物，不僅可以增強蜜蜂各個方面的生存能力，而且使蜂群免受球囊菌的侵害(Hetru，1998)。細菌或代謝產(chǎn)物對球囊菌生長及產(chǎn)孢量有影響，能明顯抑制菌絲生長或產(chǎn)孢(Basin and Gurel，1999;Reynaldi，2003)，諸如一些芽孢桿菌可以抑制球囊菌孢子形成(Wolski et al.，1997)。加拿大已經(jīng)測定了一些真菌，例如青霉、曲霉、芽孢均可以抑制實驗室培養(yǎng)基中蜜蜂球囊菌的生長。

7 展望

蜜蜂白堊病不僅困擾蜂農(nóng)，而且嚴重影響?zhàn)B蜂業(yè)的經(jīng)濟發(fā)展。近些年，蜂農(nóng)生活壓力增加，從蜂群中過度索取蜜蜂產(chǎn)品，引起蜜蜂抗逆抗病性減弱，導致蜜蜂易被新寄生物和病原侵入;使用化學藥物防治病蟲害，容易造成藥物殘留和產(chǎn)品品質(zhì)下降;因此，我們需要科學飼養(yǎng)管理蜂群。在日常飼養(yǎng)管理措施中，衛(wèi)生蜂王選育和巢脾定期更替有利于防治白堊病，但勞動力和生產(chǎn)成本明顯增加;同時，大部分白堊病初期階段的白色蟲尸，并不能進行真菌繁殖;只有當白色菌絲形成子囊體后，才具有強繁殖力，且耐受各種壓力和存活時間延長，故而我們需要防止真菌形成子囊體(Aronstein and Murray，2010)。其次，球囊菌與蜜蜂是處于共同進化的過程。我們將來對蜜蜂白堊病的研究目標，就是科學飼養(yǎng)管理蜂群，防止真菌的繁殖，使其處于經(jīng)濟危害水平之下。

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