陳 麗， 陳 君， 吳 鋼， 梁宇紅， 楊志杰， 伍善廣*

(1. 廣西科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣西 柳州 545005，2. 柳州市工人醫(yī)院，廣西 柳州 545005)

黃酮類化合物是柿葉的主要有效成分，具有保護(hù)心腦血管、保護(hù)肝臟、抗氧化、止血、降糖、抗菌等多種藥理作用[1-7]。柿葉中黃酮類化合物有蘆丁、黃芪苷、異槲皮素、山柰酚、槲皮素、金絲桃苷和楊梅樹皮苷等[8]。腦心清片是以柿葉黃酮為主藥的心腦血管疾病治療藥物，能顯著增加冠脈和腦部血流量，改善心、腦組織的供血供氧狀態(tài)，用于冠心病、心絞痛、腦動(dòng)脈硬化和缺血性腦血管病等。但腦心清片需每日服用3次，每次2～4片，這使患者用藥順應(yīng)性降低。本研究以柿葉黃酮為主藥，殼聚糖為主要輔料試制了柿葉黃酮緩釋片，并對(duì)其體外釋放度進(jìn)行了研究，研究表明自制緩釋片質(zhì)量穩(wěn)定，體外藥物釋放機(jī)制符合Ritger-Peppas釋藥模型的Non-Fick擴(kuò)散，在12 h內(nèi)呈現(xiàn)良好的釋藥性能[9]。為驗(yàn)證緩釋片體內(nèi)緩釋效果，本研究以蘆丁為對(duì)照，建立兔血漿中柿葉黃酮測定的高效液相色譜法，對(duì)柿葉黃酮緩釋片在兔體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)進(jìn)行初步研究。

1 材料

1.1 藥品 柿葉黃酮(西安市天園生物制劑廠，批號(hào) TY20120629，純度80.3%)；蘆丁對(duì)照品(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)100080-200707，純度92.5%)；柿葉黃酮緩釋片(自制，批號(hào)HS130109，每片含柿葉黃酮16 mg的緩釋片)；柿葉黃酮普通片(自制，批號(hào)PT130108，每片含柿葉黃酮8 mg的緩釋片)。

1.2 試劑 甲醇(一級(jí)色譜純，天津四友，批號(hào)120705)；蒸餾水(屈臣氏蒸餾水，批號(hào)20130204)；磷酸(分析純，成都市科龍化工試劑廠，批號(hào)20120629)；冰醋酸(分析純，成都市科龍化工試劑廠，批號(hào)20120625)。

1.3 儀器 1260 Infinity 高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；TGL16M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司)；電子分析天平(塞多利斯科學(xué)儀器北京有限公司)；TDP1.5T單沖壓片機(jī)(上海力超電機(jī)廠)；SB-3200DTDN超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)；移液器(賽默飛世爾儀器有限公司)；其它為常規(guī)儀器。

1.4 動(dòng)物 健康雄性兔6只，體質(zhì)量約2.5 kg，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(許可證號(hào)：SCXK桂2009-0002)。

2 方法與結(jié)果

2.1 兔血漿中蘆丁的測定

2.1.1 色譜條件 島津Cn-3色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相甲醇-0.1%磷酸溶液(47∶53)；進(jìn)樣量10 μL；體積流量0.8 mL/min；檢測波長360 nm；柱溫室溫。

2.1.2 血漿樣品的處理方法 精密量取經(jīng)肝素抗凝的兔血漿100 μL至1.5 mL具蓋離心管中，精密加入1 000 μL提取液(甲醇-冰醋酸為9∶1)，混合后超聲10 min，4 ℃下15 000 r/min離心10 min，取上清液過0.22 μm有機(jī)濾膜，濾液取10 μL注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。

2.1.3 蘆丁對(duì)照溶液的制備 精密稱取105 ℃下干燥至恒定質(zhì)量的蘆丁對(duì)照品0.005 4 g(純度92.5%)，置250 mL量瓶中，用少量甲醇超聲溶解后，放冷，再用甲醇定容，搖勻，即得質(zhì)量濃度為19.98 μg/mL的蘆丁對(duì)照溶液。

2.1.4 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密量取經(jīng)肝素抗凝的兔血漿100 μL至1.5 mL離心管，分別精密加入蘆丁對(duì)照溶液10、50、100、200、300、500、700、1 000 μL，精密加入提取液至1.5 mL，使蘆丁的血藥質(zhì)量濃度為0.133 2、0.666 0、1.332 0、2.664 0、3.996 0、6.660 0、9.324 0、13.320 0 μg/mL?；旌虾蟪?0 min，4 ℃下15 000 r/min離心10 min，取上清液過0.22 μm有機(jī)濾膜，濾液取10 μL注入高效液相色譜儀。以血漿蘆丁質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)，用最小二乘法進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：Y=799.093 3X-0.039 9 (r=0.999 1)，本方法質(zhì)量濃度在0.133 2～13.320 0 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.5 回收率試驗(yàn) 取空白兔血漿100 μL，制備低、中、高3種血藥質(zhì)量濃度(0.666 0、6.660 0、13.320 0 μg/mL)的樣品各5份，按“2.1.2”項(xiàng)下方法操作，記錄樣品峰面積(As)。與相同質(zhì)量濃度的蘆丁對(duì)照品溶液峰面積(Ar)進(jìn)行比較，即回收率=As/Ar×100%。結(jié)果見表1。從表1可看出，低、中、高3種質(zhì)量濃度的樣品溶液回收率均>70%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差(RSD%)均<10%，符合生物樣本分析要求。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=5)

2.1.6 精密度試驗(yàn) 取空白兔血漿100 μL，制備低、中、高3種血藥質(zhì)量濃度(0.666 0、6.660 0、13.320 0 μg/mL)的樣品各5份，按“2.1.2”項(xiàng)下方法操作，同一樣品同日內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣5次及不同日連續(xù)5 d進(jìn)樣，計(jì)算日內(nèi)和日間精密度。結(jié)果見表2，結(jié)果表明，樣品在日內(nèi)和日間RSD<10%，方法精密度良好。

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=5)

2.1.7 專屬性試驗(yàn) 在所采用的色譜條件下，空白血漿、空白血漿加蘆丁對(duì)照品、給藥后兔血漿的色譜圖見圖1。從圖1可知，柿葉黃酮中蘆丁的峰形良好，基線平穩(wěn)，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾檢測，對(duì)照品蘆丁和柿葉黃酮中蘆丁的保留時(shí)間一致，樣品峰與雜質(zhì)峰的分離度大于1.5，本法能準(zhǔn)確測定血漿中柿葉黃酮蘆丁的質(zhì)量，靈敏度高。

圖1 血漿中HPLC色譜圖

2.2 柿葉黃酮緩釋片在兔血漿中的藥動(dòng)學(xué)研究

2.2.1 給藥方案及方法 健康兔6只，隨機(jī)分為2組，按自身對(duì)照交叉實(shí)驗(yàn)進(jìn)行。1組服用柿葉黃酮普通片，4片/只；另1組服用柿葉黃酮緩釋片，2片/只。均整片藥物塞入會(huì)厭部，使兔自動(dòng)吞咽并灌入適量清水送下，經(jīng)1周清洗期后交換。給藥前禁食不禁水12 h，給藥后6 h統(tǒng)一進(jìn)食。

2.2.2 血樣采集 2組均在給藥前取空白血樣，給藥后0.5、1、2、3、4、5、6、8、10、12、16、24 h分別取靜脈血，每次2 mL，離心分離出血漿后按“2.1.2”項(xiàng)下方法操作，所得峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算柿葉黃酮中蘆丁含有量。平均血藥濃度-時(shí)間曲線見圖2。

圖2 兔口服柿葉黃酮制劑后的平均藥時(shí)-曲線

2.2.3 藥動(dòng)學(xué)參數(shù)的計(jì)算[10]將經(jīng)時(shí)血藥濃度數(shù)據(jù)用3P87藥動(dòng)學(xué)數(shù)據(jù)程序處理，對(duì)柿葉黃酮緩釋片和普通片的血藥質(zhì)量濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，以F檢驗(yàn)的結(jié)果結(jié)合AIC最小作為模型選擇的依據(jù)。藥動(dòng)學(xué)參數(shù)：Cmax、Tmax用實(shí)測值，AUC0→24、AUC0→∞、MRT用非房室模型統(tǒng)計(jì)矩法算得，以普通片為參比制劑，計(jì)算柿葉黃酮緩釋片單劑量給藥的相對(duì)生物利用度F%。以主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)AUC0→∞、Cmax、Tmax為指標(biāo)評(píng)價(jià)柿葉黃酮緩釋片與普通片的生物等效性：對(duì)AUC0→∞、Cmax進(jìn)行方差分析，雙單側(cè)t檢驗(yàn)和90%置信區(qū)間檢驗(yàn)，用秩和檢驗(yàn)對(duì)Tmax進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。兔單劑量口服柿葉黃酮制劑后的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見表3，藥動(dòng)學(xué)參數(shù)統(tǒng)計(jì)分析見表4。

結(jié)果表明：柿葉黃酮緩釋片和普通片的體內(nèi)過程均符合一級(jí)吸收一室模型特征，權(quán)重系數(shù)為1，藥物吸收有延遲；緩釋片的AUC0→24、AUC0→∞、Tmax、MRT比普通片顯著增大，Cmax明顯降低；方差分析說明，AUC0→∞和Cmax的個(gè)體間F、周期間F均小于F0.05，無顯著性差異，但制劑間F大于F0.05，差異顯著；雙單側(cè)t檢驗(yàn)AUC0→∞、Cmax的T1，T2均小于t1-0.05(4)；緩釋片與普通片AUC0→∞、Cmax對(duì)數(shù)比值的90%置信區(qū)間分別為50.0%～59.9%和103.2%～134.5%，不在臨界范圍80%～125%和 70%～143%內(nèi)，故柿葉黃酮緩釋片與普通片具有生物不等效性。秩和檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量Z=-2.882，單側(cè)概率P=0.002，說明緩釋片與普通片之間的Tmax有顯著差異，緩釋片的Tmax明顯延長。

表3 兔口服柿葉黃酮制劑后的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

表4 藥動(dòng)學(xué)參數(shù)統(tǒng)計(jì)分析

3 討論

柿葉總黃酮體外含量測定可采用紫外法[11]，但體內(nèi)影響因素多，紫外法不適合體內(nèi)研究。目前發(fā)現(xiàn)的柿葉黃酮類化合物有黃芪苷、槲皮素、異槲皮素、蘆丁、金絲桃苷等，已有學(xué)者以蘆丁為對(duì)照用HPLC法檢測體外柿葉黃酮[12]，還有學(xué)者建立了HPLC法檢測動(dòng)物血漿中蘆丁[13-15]的方法，我們?cè)谶@些研究基礎(chǔ)上進(jìn)行多次試驗(yàn)，得到以蘆丁為對(duì)照的HPLC法檢測家兔血漿中柿葉黃酮的條件為用甲醇-冰醋酸(9∶1)作為蛋白沉淀劑，甲醇-0.1%磷酸溶液(47∶53)為流動(dòng)相，檢測波長為360 nm。本法血漿樣品處理方法簡單，靈敏，專屬性高。

采用3P87藥動(dòng)學(xué)參數(shù)數(shù)據(jù)程序?qū)?jīng)時(shí)血藥濃度數(shù)據(jù)進(jìn)行藥動(dòng)學(xué)模型擬合，擬合評(píng)價(jià)指標(biāo)顯示，柿葉黃酮緩釋片在家兔體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)模型符合一級(jí)吸收一室模型特征，藥物吸收有延遲。緩釋片峰濃度(Cmax)明顯降低(P<0.01)，達(dá)峰時(shí)間(Tmax)明顯延長(P<0.01)，平均滯留時(shí)間(MRT)顯著延長(P<0.01)，說明緩釋片的骨架材料能改變總黃酮在體內(nèi)的吸收、分布與代謝。柿葉黃酮緩釋片采用殼聚糖和阿拉伯膠為混合骨架材料，殼聚糖和阿拉伯膠能在酸性介質(zhì)中膨脹形成黏稠物使藥物在胃腸道停留時(shí)間延長，有充分時(shí)間吸收，故而相對(duì)生物利用度F%明顯提高，約為普通片的1.9倍。

AUC0→∞、Cmax、Tmax是制劑間生物等效性評(píng)價(jià)的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，因AUC0→∞、Cmax不呈正態(tài)分布，故先將其進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換，才可進(jìn)行方差分析。以AUC0→∞、Cmax為指標(biāo)的方差分析、雙單側(cè)t檢驗(yàn)和90%置信區(qū)間檢驗(yàn)結(jié)果可知，緩釋片與普通片在制劑間具有生物不等效性；以Tmax為指標(biāo)的秩和檢驗(yàn)結(jié)果表明，緩釋片與普通片存在顯著差異。

本研究結(jié)果證明，自制柿葉黃酮緩釋片能在家兔體內(nèi)達(dá)到較好的緩釋效果，能降低峰濃度、延長藥物在體內(nèi)的滯留時(shí)間，減少血藥質(zhì)量濃度的峰谷波動(dòng)，提高生物利用度，達(dá)到了緩釋片的設(shè)計(jì)要求。

參考文獻(xiàn)：

[1] 孫 懿，譚宏棣，藍(lán)曉步，等.柿葉黃酮預(yù)處理對(duì)大鼠離體心臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用[J].濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，32(1):9-10.

[2] 覃斐章，林 興，張緒東，等.柿葉黃酮對(duì)L-NAME誘導(dǎo)的高血壓大鼠血壓的影響[J].現(xiàn)代中醫(yī)藥，2008，28(3):61-63.

[3] 張 艷.柿葉黃酮體外抗氧化活性及對(duì)小鼠急性肝損傷保護(hù)作用的研究[D].西安:陜西師范大學(xué)，2011:1.

[4] 宋常春，鮑慶勝.柿葉黃酮類化合物提取方法和抗氧化性的研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2004，30(9):117-119.

[5] 王樹松，王曉風(fēng).柿葉止血成分的實(shí)驗(yàn)研究[J].河北中醫(yī)，2005，7(1):66-67.

[6] 胡忠澤，楊久峰，譚志靜.柿葉黃酮對(duì)糖尿病小鼠降血糖作用及機(jī)制探討[J].營養(yǎng)學(xué)報(bào)，2006，28(6):540-541.

[7] 尹淑麗，張麗萍，梁 然，等.柿葉黃酮對(duì)BSD-2菌株芽胞數(shù)量及抑菌活性的影響[J].微生物學(xué)雜志，2010，30(6):49-51.

[8] 王 燕.柿葉中黃酮類化合物的研究進(jìn)展[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2011，7(4):173-174.

[9] 梁宇紅，陳 麗，吳 鋼，等.柿葉黃酮緩釋片的制備及其釋放度測定[J].中成藥，2013，35(10)：2134-2137.

[10] 梁文權(quán).生物藥劑學(xué)與藥物動(dòng)力學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2004:328-335.

[11] 羅昱瀾.柿葉中總黃酮的含量測定[J].華夏醫(yī)學(xué)，2008,21(3):433-434.

[12] 趙曉莉.柿葉黃酮類化合物提取分離研究[D].陜西西安：西北工業(yè)大學(xué)，2005.

[13] 楊子華.HPLC法檢測大鼠血漿中蘆丁濃度及其藥物動(dòng)力學(xué)[J].中國藥師，2012，15(6):853-855.

[14] 湯 潔，王 劍，沈麗杰.小鼠血漿及組織中蘆丁和槲皮素HPLC檢測方法的建立[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，17(增刊):49-50.

[15] 許 良，畢開順.大鼠血漿中蘆丁和槲皮素的RP-HPLC同時(shí)分析方法[J].內(nèi)蒙古民族大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2006，21(1):10-13.