王月明，吳 琳，吳瑩瑩，李 盟，楊利桃，黃禮年，孫 新，劉志剛

節(jié)肢動(dòng)物尤其是螨的體壁由真皮細(xì)胞及其分泌的表皮構(gòu)成,其可作為螨蟲(chóng)物種進(jìn)化過(guò)程中的一個(gè)指標(biāo)[1]。Wigglesworth等[2]報(bào)道螨的表皮與昆蟲(chóng)的相似，隨后Hughes[3]及Klag[4]等分別對(duì)無(wú)氣門(mén)螨和粗腳粉螨的表皮作了初步描述。關(guān)于粉塵螨體壁構(gòu)成，國(guó)內(nèi)未見(jiàn)相關(guān)研究。血體腔方面，人們對(duì)昆蟲(chóng)的血體腔已有許多討論[5-6]，螨血體腔的研究中僅有少數(shù)螨血細(xì)胞的相關(guān)討論[7-8]，目前國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)粉塵螨血體腔的有關(guān)報(bào)道?？紤]到生物物種的多樣性，本研究擬對(duì)粉塵螨體壁及血體腔超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，進(jìn)一步加深對(duì)粉塵螨體壁及血體腔的了解，也為塵螨變應(yīng)原疫苗及殺螨劑的研制等提供更全面的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來(lái)源 粉塵螨由深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)院過(guò)敏反應(yīng)與免疫學(xué)研究所提供，于恒溫(25℃±0.5℃)、恒濕(相對(duì)濕度75%±1%)培養(yǎng)箱中，以豆粉和面粉(1∶3)為飼料，隔離培養(yǎng)。

1.2透射電子顯微鏡觀察

1.2.1固定與包埋 于體視鏡下(型號(hào)：SMZ-168, Motic公司)挑取20只純培養(yǎng)成年粉塵螨，經(jīng)1M PBS清洗干凈后挑入前固定液(2.5%戊二醛+2%多聚甲醛+0.1 mol/L磷酸緩沖液)中固定12 h,用微型解剖刀片去除螨四肢及顎體部，挑入新的前固定液中再次固定24 h。清洗后再置1%鋨酸后固定約40 min。隨后經(jīng)梯度酒精脫水、無(wú)水丙酮/包埋劑梯度置換包埋，最終置純包埋劑(Epon 812)中滲透48 h。將樣品挑出放入包埋板中60 ℃聚合約48 h至硬化。

1.2.2制片與觀察 修整組織中性樹(shù)脂塊至所需大小，于光學(xué)顯微鏡下定位準(zhǔn)確后，行超薄切片，撈片于銅網(wǎng)上。正染色后即可于透射電子顯微鏡(TecnaiTMG2 Spirit TWIN)下觀察。

1.3掃描電子顯微鏡觀察 體視顯微鏡下用蒸餾水清洗樣品2次，除去表面雜質(zhì)，待其干燥后，用乙醚麻醉后用干凈的毛筆將其直接粘在電鏡樣品托上即可于掃描電子顯微鏡(JEOL JSM-6490)下觀察。

2 結(jié) 果

2.1粉塵螨體壁 粉塵螨體壁由真皮細(xì)胞分泌產(chǎn)生，根據(jù)組織的化學(xué)組成及結(jié)構(gòu)，其表皮由外到內(nèi)分為上表皮和前表皮，上表皮進(jìn)一步分為表皮質(zhì)層、蠟層和黏質(zhì)層，而前表皮則分為內(nèi)表皮和外表皮，其中前表皮結(jié)構(gòu)明顯分層，其內(nèi)可見(jiàn)許多孔道和薄片。

2.1.1粉塵螨體壁大體觀察 粉塵螨成蟲(chóng)為卵圓形，軀體表面可見(jiàn)許多橫向或縱向的嵴(圖1.1, 圖1.2)，整個(gè)皮紋呈指紋狀，其上著生各種長(zhǎng)短、形狀不一的剛毛(圖1.1)。

2.1.2粉塵螨體壁透射電鏡觀察 軀體表皮厚約2 μm，內(nèi)表皮結(jié)構(gòu)明顯分層，明暗相間。上表皮位于表皮的最外層，橫切面可見(jiàn)其外側(cè)緣呈波浪狀(圖1.3)或扁平(圖1.4)，總體較薄，電子致密染色。前表皮(圖1.3)較厚，位于上表皮下方，由一較薄的外表皮和一相對(duì)較厚的內(nèi)表皮構(gòu)成(圖1.4)。外表皮位于內(nèi)表皮的外側(cè)，質(zhì)硬，色較深。內(nèi)表皮含許多薄片及孔道，表皮下可見(jiàn)彎曲、刷狀微絨毛(圖1.3，1.4)。

2.2粉塵螨血體腔 粉塵螨血體腔(又稱血腔)由體壁包繞而成，其內(nèi)充滿血淋巴，各組織器官浸浴其中。血淋巴內(nèi)可見(jiàn)大量線粒體、少許溶酶體樣液泡及吞噬細(xì)胞等(圖2.1)，同時(shí)大量纖維組織散在分布其中(圖2.1-2.4)。部分血體腔內(nèi)可見(jiàn)大量中等電子密度的液泡(圖2.2)，液泡大小形態(tài)不一，局部可見(jiàn)少量深染或淡染區(qū)域。血體腔內(nèi)還可見(jiàn)細(xì)菌及較多糖原顆粒(圖2.3)。此外，在后中腸壁外側(cè)血體腔內(nèi)見(jiàn)由大量糖原、脂滴空泡及線粒體等組成的不定形組織(圖2.4)。

3 討 論

體壁為昆蟲(chóng)軀體最外層的組織，既可防止昆蟲(chóng)體內(nèi)水分的過(guò)度蒸發(fā)，又可防止外界細(xì)菌微生物和殺蟲(chóng)劑等外來(lái)物質(zhì)的入侵，為維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的一保護(hù)性屏障。無(wú)氣門(mén)亞目螨的表皮形態(tài)多樣，粉螨科如粗腳粉螨和腐食酪螨表皮光滑，其他螨科如家食甜螨表皮可見(jiàn)小的乳頭狀突起[9]。屋塵螨的表皮可見(jiàn)間斷的細(xì)紋脊和波谷，呈波浪狀，該特征在肉食螨內(nèi)亦可見(jiàn)[10]。本研究粉塵螨表皮外觀可見(jiàn)許多橫向和縱向的脊，整個(gè)表皮呈指紋樣，與上述屋塵螨和肉食滿的報(bào)道相似。螨體壁皺褶的存在，是含水個(gè)體表皮具有彈性的表現(xiàn)。

有關(guān)軀體表皮構(gòu)成，Wigglesworth等[2]設(shè)計(jì)免疫組化實(shí)驗(yàn)觀察到螨表皮結(jié)構(gòu)與其所研究的昆蟲(chóng)相似。JONES[10]在研究中先后用不同的試劑處理螨，結(jié)果證明螨的上表皮由一蠟層、一多酚層和一表皮質(zhì)層構(gòu)成。本研究中觀察到一電子致密、較薄的上表皮，但其中具體的表皮質(zhì)層、蠟層和黏質(zhì)層三層觀察分界不清。Klag等[4]發(fā)現(xiàn)粗腳粉螨表皮主要由上表皮、外表皮和內(nèi)表皮等4層構(gòu)成，Tongu等[11]在研究中指出粉塵螨軀體表皮厚度均勻一致，由電子致密上表皮、外表皮和內(nèi)表皮構(gòu)成。本研究中觀察到的粉塵螨表皮構(gòu)成與上述Klag、Tongu等的研究觀察結(jié)果基本相符。此外，Brody等[12]還指出螨分層的體壁內(nèi)可見(jiàn)小的孔道和大的導(dǎo)管從皮下組織延伸橫穿體壁，最終攜帶分泌物質(zhì)通過(guò)內(nèi)表皮到達(dá)外表皮表面，即形成蠟層、黏質(zhì)層等保護(hù)層；Tongu等[5]也指出，厚的內(nèi)表皮內(nèi)含薄片及孔道，孔道從表皮細(xì)胞出發(fā)，通過(guò)內(nèi)表皮層，到達(dá)外表皮層，然而不穿透上表皮。本研究中前表皮內(nèi)明顯可見(jiàn)許多孔道及薄片，但由于切片限制，僅觀察到孔道橫截面，未見(jiàn)其橫穿體壁及內(nèi)外表皮的表現(xiàn)。

圖1.1雄性粉塵螨軀體背面掃描電鏡觀

Fig.1.1SEMaspectofthedorsalviewoftheintegumentformaleD.farinae(Scalebar=1μm)

R: Ridges 嵴; S: Setae 剛毛

圖1.2粉塵螨體壁橫切面顯示明顯的嵴

Fig.1.2CrosssectionthroughtheintegumentofmaleD.farinaedemonstratedtheobviousridges(R) (13500×) (Scalebar=1μm)

圖1.3粉塵螨體壁橫切面觀：較厚前表皮內(nèi)可見(jiàn)彎曲的孔道和分辨不清的薄片

Fig.1.3CrosssectionthroughtheintegumentofmaleD.farinae

A thick procuticle (Prc) with curved pore canals (Prc) and indistinct lamellae (13 500×) (Scale bar =1 μm)

Epc: Epicuticle 上表皮; Prc: Procuticle 前表皮; MV: Microvilli of the apical plasma membrane 頂部質(zhì)膜微絨毛; Pc: Pore canals 孔道; Ec: Epidermal cell 真皮細(xì)胞; Ha: Haemocoele 血體腔.

圖1.4雄性粉塵螨體壁橫截面顯示：前表皮由內(nèi)表皮和外表皮構(gòu)成，孔道延伸入內(nèi)，其上被覆一致密上表皮

Fig.1.4CrosssectionthroughtheintegumentofmaleD.farinaeshowingprocuticlecomposedofendocuticle(Enc)andexocuticle(Exc)andpenetratedbyporecanals(Pc)andcoveredbydenseepicuticle(Epc) (23000×) (Scalebar=0.5μm)

Prc: Procuticle 前表皮; Epc: Epicuticle 上表皮; Enc: Endocuticle 內(nèi)表皮; Exc: Exocuticle 外表皮; Pc: Pore canals 孔道; Ec: Epidermal cell 真皮細(xì)胞; MV: Microvilli 微絨毛; La: Lamination 薄層.

粉塵螨血體腔由體壁圍繞而成，所有組織器官沐浴在血液中，而其血液起到哺乳動(dòng)物血液和淋巴液的雙重特征，故又稱其為血淋巴[13]。血淋巴具吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、維持機(jī)體體液平衡、清除代謝終產(chǎn)物及免疫防御等重要功能。本研究血體腔中見(jiàn)吞噬細(xì)胞等，參與機(jī)體免疫防御。本研究中還發(fā)現(xiàn)大量中等電子致密液泡，形態(tài)不一，國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，其功能未知。此外，本實(shí)驗(yàn)在后中腸腸壁外側(cè)觀察到由大量糖原、脂滴及線粒體等組成的不定形組織，但在Tongu等[5]和Brody[14]對(duì)粉塵螨的研究中未見(jiàn)報(bào)道。目前國(guó)外已有關(guān)于嗜木螨屬[8]和腐食酪螨[9]等血體腔內(nèi)血細(xì)胞的相關(guān)報(bào)道，結(jié)果顯示與昆蟲(chóng)血細(xì)胞相似。本實(shí)驗(yàn)由于實(shí)驗(yàn)方法的不同及切片條件的限制，未能觀察到明顯血細(xì)胞。

粉塵螨體壁及血體腔為其組織構(gòu)成的重要組成部分，二者在機(jī)體防御方面均起重要作用。本研究為粉塵螨系統(tǒng)性研究提供更加全面的理論基礎(chǔ)，同時(shí)也為殺螨劑的研制等提供參考依據(jù)。

(本實(shí)驗(yàn)曾得到中山大學(xué)北校區(qū)電鏡室陳建平老師、鄭樹(shù)森老師以及吳金浪主任的悉心指導(dǎo)，特此表示衷心感謝。)

圖2.1粉塵螨體壁下血體腔

Fig.2.1HaemocoeleabovetheintegumentofD.farinae(13500×) (Scalebar=1μm)

Int: Integument體壁; Mt: Mitochondria線粒體; Lv: Lysosome-like vacuole 溶酶體樣液泡; Pha: Phagocyte吞噬細(xì)胞; Ha: Haemocoele血體腔.

圖2.2血體腔內(nèi)可見(jiàn)大量中等電子致密的液泡

Fig.2.2Therearealargenumberofmiddleelectron-densevacuolesinthehaemocoele(5800×) (Scalebar=2μm)

V: Middle electron-dense vacuoles中等電子致密液泡; Mt: Mitochondria線粒體; Ft: Fiber tissues纖維組織; Vd: Vas deferens輸精管; Sp: Spermatozoa精子.

圖2.3部分血體腔內(nèi)發(fā)現(xiàn)少量細(xì)菌和許多糖原顆粒

Fig.2.3Afewbacterias(Ba)andmanyglycogengranules(Gly)werefoundinpartofthehaemocoele(13500×) (Scalebar=1μm)

圖2.4鄰近后中腸壁的血體腔

Fig.2.4Haemocoeleneartheposteriormidgut(23000×) (Scalebar=0.5μm)

PMg: Posterior midgut后中腸; Ha: Haemocoele血體腔; BM: Basement membrane基底膜; Ly: Lysosome溶酶體; Mt: Mitochondria線粒體; Gly: Glycogen granul 糖原顆粒; Ld: Lipid droplet脂滴.

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