談忠鳴，李志峰,吳 斌,胡建利,祁 賢,顧 玲,鮑倡俊,湯奮揚(yáng),朱葉飛

恙蟲病(Scrub typhus)是由恙蟲病東方體(Orientiatsutsugamushi)引起的，臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、頭痛、斑丘疹、焦痂、淋巴結(jié)腫大，嚴(yán)重時(shí)可致命的自然疫源性蟲媒傳染病。恙蟲病流行地域甚廣[1]，西至阿富汗、巴基斯坦，北至俄羅斯，東到韓國(guó)、日本，南到澳大利亞區(qū)域內(nèi)的大部分國(guó)家。恙蟲病不僅對(duì)各國(guó)的公共衛(wèi)生構(gòu)成嚴(yán)重威脅，還是威脅各國(guó)旅游者健康的重要危險(xiǎn)因素[2]。

恙蟲病東方體的血清生物分型主要有Gilliam、Karp、Kato、Kawasaki等型，其中Gilliam、Karp、Kato三株為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)參考株，Kawasaki株于80年代初在日本分離到[3]。郭恒彬等于1995年運(yùn)用PCR/RFLR方法從江蘇地區(qū)標(biāo)本中檢測(cè)到恙蟲病東方體的目標(biāo)基因，并通過測(cè)序確認(rèn)為Kawasaki株恙蟲病東方體[4]，次年在當(dāng)?shù)匦《芾w恙螨中分離出Kawasaki株[5]，證實(shí)江蘇地區(qū)恙蟲病東方體的優(yōu)勢(shì)生物型為Kawasaki株。

傳統(tǒng)恙蟲病檢測(cè)以免疫學(xué)方法為主，如外斐氏試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)和補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(CFT)。這些方法針對(duì)恙蟲病東方體的抗體進(jìn)行檢測(cè)及分型，操作繁瑣，對(duì)實(shí)驗(yàn)室要求較高。且抗體出現(xiàn)時(shí)間較晚，不適合早期快速診斷。恙蟲病病人急性期血液中恙蟲病東方體含量普遍較少，針對(duì)核酸的巢式PCR檢測(cè)方法雖然靈敏度和特異性均較高[6]，但易產(chǎn)生假陽(yáng)性。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR最早由美國(guó)AB公司推出，是一種靈敏度和特異性較高，可實(shí)時(shí)觀測(cè)并對(duì)標(biāo)本進(jìn)行定量的核酸檢測(cè)方法。該方法快速、簡(jiǎn)單、省時(shí)、省樣，是應(yīng)對(duì)傳染病突發(fā)疫情的主要檢測(cè)方法，已應(yīng)用在恙蟲病病人的早期快速診斷中[7-8]?，F(xiàn)有熒光定量PCR方法多以恙蟲病東方體56 kD外膜蛋白基因序列設(shè)計(jì)引物和探針[7-8]，56 kD外膜基因序列上包含4段可變區(qū)域，不同生物型別和菌株間存在一定的變化。恙蟲病東方體的熱休克蛋白(GroEL)基因是恙蟲病東方體基因組中一段高度保守的序列[9]，本研究擬以GroEL基因?yàn)槟康幕颍O(shè)計(jì)引物和探針，建立檢測(cè)恙蟲病東方體的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法。

1 材料與方法

1.1立克次體DNA 恙蟲病東方體基因組DNA(Gilliam株、Karp株、Kato株)由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病所張麗娟主任醫(yī)師惠贈(zèng)，斑點(diǎn)熱立克次體、斑疹傷寒立克次體和貝氏柯克斯體基因組DNA由中國(guó)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院立克次體學(xué)實(shí)驗(yàn)室溫博海教授惠贈(zèng)，恙蟲病東方體基因組DNA(Kawasaki株)、查菲埃立克體基因組DNA、無形體基因組DNA由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2其他病原DNA 鉤端螺旋體(15種血清型)、羊種布魯氏菌，均由本實(shí)驗(yàn)室保存。用QIAGEN公司的DNA提取試劑盒(QIAamp DNA mini kit, Qiagen)提取核酸，操作步驟參照說明手冊(cè)，核酸-80℃保存待用。

1.3引物及探針設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank中已有的恙蟲病東方體Gilliam、Karp、Kato及Kawasaki株的GroEL基因序列，運(yùn)用primer express 3.0軟件設(shè)計(jì)上、下游引物和探針：groEL FP：5′-AAT GAT ACA TCT AAG TTA GGA ACT GCA AA -3′； groEL RP： 5′-AAG TTG TAT CTT TAA TTG CYT CAC GAA -3′； groEL-Probe： FAM 5′-AAA GTT AAT TCT CGT TGT GAA CAG -3′ TAMAR(簡(jiǎn)并堿基Y=C/T)。

1.4引物和探針濃度優(yōu)化 探針濃度固定在10 pmol/μL，上下游引物反應(yīng)濃度分別采用10、20、30、40 pmol/μL，檢測(cè)陽(yáng)性對(duì)照DNA,根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果(Ct)及擴(kuò)增曲線選擇最優(yōu)引物濃度。采用優(yōu)化后的引物濃度，探針濃度分別采用10、15、20 pmol/μL，根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果(Ct)及擴(kuò)增曲線選擇最優(yōu)引物濃度。所有反應(yīng)均設(shè)2孔進(jìn)行平行檢測(cè)。

1.5反應(yīng)體系及反應(yīng)程序 20 μL反應(yīng)體系包含10 μL通用PCR反應(yīng)混合物(TaqMan Universal PCR Master Mix，Roche)，引物和探針各1μL，DNA模板2 μL，去離子水補(bǔ)足。循環(huán)程序?yàn)?0 ℃ 2 min和95 ℃ 10 min后，95 ℃ 15 s和60 ℃ 1 min循環(huán)50次。

1.6標(biāo)準(zhǔn)品制備 克隆引物擴(kuò)增Kawasaki株GroEL基因片段(540 bp)，引物序列：groEL-c FP：5′-GTT GAA GTW GTT AAA GG， groEL-c RP：5′-TTT TTC TTT WTC ATA ATC-3′ (簡(jiǎn)并堿基W=A/T)。PCR產(chǎn)物切膠回收純化后連接PMD18-T載體，挑選克隆子，PCR驗(yàn)證并測(cè)序確認(rèn)?；厥召|(zhì)粒，260 nm測(cè)定DNA含量，計(jì)算拷貝數(shù)，-80 ℃保存待用。

1.7敏感性分析 10倍系列稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，7個(gè)連續(xù)稀釋度，每個(gè)稀釋度3次重復(fù)試驗(yàn)。收集并分析每個(gè)濃度的實(shí)驗(yàn)結(jié)果并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，評(píng)估此方法的最小檢測(cè)標(biāo)本濃度。

1.8特異性分析 采用本熒光定量PCR方法分別檢測(cè)恙蟲病東方體Gilliam、Karp、Kato及Kawasaki株、斑點(diǎn)熱立克次體、斑疹傷寒立克次體和貝氏柯克斯體、查菲埃里克體、無形體、鉤端螺旋體(15種血清型)、羊種布魯氏菌的DNA樣本，驗(yàn)證本方法的特異性。

1.9重復(fù)性分析 批內(nèi)重復(fù)：4個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品分別檢測(cè)4次，求平均值、標(biāo)準(zhǔn)差及變異系數(shù)；批間重復(fù)：4個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，1 w內(nèi)重復(fù)檢測(cè)4次，求平均值、標(biāo)準(zhǔn)差及變異系數(shù)。

1.10臨床標(biāo)本檢測(cè) 對(duì)本實(shí)驗(yàn)室保存的82份疑似恙蟲病病人標(biāo)本(血標(biāo)本78份、焦痂4份)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。同時(shí)采用常規(guī)巢式PCR檢測(cè)，陽(yáng)性產(chǎn)物回收并測(cè)序分析，以驗(yàn)證該方法對(duì)患者標(biāo)本中的恙蟲病東方體檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

2 結(jié) 果

2.1引物探針濃度的優(yōu)化 當(dāng)上下游引物濃度分別為30 pmol/μL、探針濃度為15 pmol/μL時(shí)，擴(kuò)增Ct值較小，且熒光信號(hào)較強(qiáng)，曲線較平滑。

2.2敏感性分析 質(zhì)粒濃度為7.76×10-1ng/μL，10倍系列稀釋做標(biāo)準(zhǔn)品(7.76×10-1～7.76×10-7ng/μL)，3次平行重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致(見圖1)，質(zhì)粒濃度對(duì)應(yīng)Ct值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線r2=0.998，r=0.999，斜率為-3.37(見圖2)。標(biāo)準(zhǔn)品最低檢測(cè)濃度為7.76×10-10ng/μL，通過計(jì)算，只需樣品中有21.8拷貝/μL即可檢測(cè)出信號(hào)。

2.3特異性分析 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示本方法可檢測(cè)出恙蟲病東方體Gilliam株、Karp株、Kato株和Kawasaki株，其他標(biāo)本均未檢測(cè)出熒光信號(hào)，表明該方法中設(shè)計(jì)的引物和探針具有很高的特異性。(見圖3)

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線

圖2質(zhì)粒濃度對(duì)數(shù)數(shù)值對(duì)應(yīng)反應(yīng)Ct值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

Fig.2StandardcurvebasedonthelogvalueofplasmiddensityandCtvalues

(r2=0.998, r=0.999, slope=-3.37)

圖3實(shí)時(shí)熒光PCR特異性分析

Fig.3Specificityanalysisofreal-timePCR

Results of fourOrientiatsutsugamushistrains were positive, and those of the other bacteria were negative.

2.4重復(fù)性分析 對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品10倍系列稀釋，進(jìn)行批內(nèi)及批間重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示不同濃度下標(biāo)準(zhǔn)差均小于0.5%，變異系數(shù)均小于1.5%，說明本方法具有良好的重復(fù)性(見表1)。

表1 實(shí)時(shí)熒光PCR批內(nèi)及批間重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

2.5檢測(cè)臨床病人標(biāo)本 對(duì)本實(shí)驗(yàn)室保存的疑似恙蟲病病人標(biāo)本檢測(cè)，全血標(biāo)本78份、焦痂4份中，用常規(guī)巢式PCR檢測(cè)出26份陽(yáng)性，其中兩份為弱陽(yáng)性，焦痂全部為陽(yáng)性。PCR陽(yáng)性產(chǎn)物回收并測(cè)序，結(jié)果顯示全部為恙蟲病東方體。熒光PCR檢測(cè)全部82份臨床標(biāo)本，25份陽(yáng)性，一份巢式PCR弱陽(yáng)性標(biāo)本未檢測(cè)出，與常規(guī)巢式PCR相比，檢出率為96.15%(25/26)。

3 討 論

恙蟲病東方體的常規(guī)分子檢測(cè)方法以巢式PCR為主，靈敏性和特異性均較高，但因有兩次擴(kuò)增，操作略顯繁瑣，且容易污染。因此，實(shí)驗(yàn)室迫切需要方便、快速的檢測(cè)方法。熒光定量PCR靈敏度和特異性較高，已成為處理突發(fā)傳染病疫情的主要檢測(cè)手段，并已應(yīng)用于恙蟲病病人的早期快速診斷中。

現(xiàn)有的檢測(cè)恙蟲病東方體的熒光定量PCR多以56 kD外膜蛋白基因?yàn)榘谢颉?6 kD外膜蛋白是恙蟲病東方體表面含量豐富的蛋白之一，其基因主要編碼菌體表面膜蛋白，有組和株的抗原決定簇，為型特異性抗原，序列中包含開放閱讀框和4段可變區(qū)域，是恙蟲病東方體常用的檢測(cè)和分型基因[10]。分子伴侶GroEL是一個(gè)60 kD熱休克蛋白，其編碼基因是序列高度保守的管家基因，普遍存在于所有立克次體中，GroEL基因進(jìn)行進(jìn)化樹分析顯示立克次體屬和埃立克體屬相近，與柯科斯體屬和巴爾通體屬親緣很遠(yuǎn)，這與16S rRNA基因進(jìn)化樹分析結(jié)果一致，但屬間差異更大，可用于流行株的甄別鑒定[9]。所以選擇序列上較為保守的GroEL基因?yàn)榘谢蛟O(shè)計(jì)引物和探針對(duì)恙蟲病東方體進(jìn)行檢測(cè)，從理論上講，其特異性必定很高。

本研究以GroEL基因設(shè)計(jì)的引物和探針，可檢測(cè)出恙蟲病東方體Gilliam株、Karp株、Kato株和Kawasaki株，而對(duì)立克次體目中的斑點(diǎn)熱立克次體、斑疹傷寒立克次體、貝氏柯克斯體、無形體、查菲埃里克體和其他細(xì)菌的檢測(cè)結(jié)果為陰性，說明該引物和探針具有高度的特異性。以克隆質(zhì)粒做為標(biāo)準(zhǔn)品，建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線的循環(huán)閾值(Ct)與模板拷貝數(shù)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(r=0.999),靈敏度試驗(yàn)顯示最低檢出濃度為21.8拷貝/μL，以一般2 μL上樣量計(jì)算，體系中有44個(gè)拷貝即可檢出信號(hào)，說明本方法敏感性較高。重復(fù)性實(shí)驗(yàn)顯示本方法具有良好的重現(xiàn)性。對(duì)臨床標(biāo)本的檢測(cè)及與測(cè)序結(jié)果比較顯示，本方法可快速檢測(cè)早期恙蟲病病人的臨床標(biāo)本。

Kawasaki株為我省的優(yōu)勢(shì)型簇[11]，但不排除今后會(huì)有其他生物型的流行，本研究建立的方法可對(duì)國(guó)內(nèi)流行的恙蟲病東方體主要生物型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室快速檢測(cè)。我實(shí)驗(yàn)室將運(yùn)用該方法對(duì)我省恙蟲病病例進(jìn)行監(jiān)測(cè)，并對(duì)恙蟲病東方體GroEL基因上可能的遺傳變異進(jìn)行追蹤和分析。

參考文獻(xiàn)：

[1]Watt G, Parola P. Scrub typhus and tropical rickettsioses[J]. Curr Opin Infect Dis, 2003, 16: 429-436.DOI: 10.1097/00001432-200310000-00009

[2]Walker DH. Rickettsial diseases in travelers[J]. Travel Med Infect Dis, 2003, 1: 35-40. DOI: 10.1016/S1477-8939(03)00025-5

[3]Tamura A, Yamamoto N, Koyama S, et al. Epidemiological survey ofOrientiatsutsugamushidistribution in field rodents in Saitama Prefecture, Japan, and discovery of new type[J]. Microbiol Immunol, 2001, 45(6): 439-446. DOI: 10.1111/j.1348-0421.2001.tb02643.x

[4]Guo HB, Tang JQ, Li XF, et al. Analysis the target genes of Chinese newOrientiatsutsugamushiby PCR/RFLR and sequencing[J]. Chin J Public Health, 1997, 16(4): 193-196. (in Chinese)

郭恒彬，唐家琪，李先富，等.我國(guó)新型恙蟲病立克次體目標(biāo)基因的PCR/RFLR和序列分析研究[J].中國(guó)公共衛(wèi)生學(xué)報(bào),1997,16:193-196.

[5]Guo HB, Wu GH, Xu MH, et al. Investigation of winter type scrub typhus natural foci[J]. Chin J Epidemiol, 1994, 1(15): 27-30. (in Chinese)

郭恒彬，吳光華.秋冬型恙蟲病自然疫源地的調(diào)查研究[J].中華流行病學(xué)雜志,1994，1:27-30.

[6]Ohashi N, Nashimoto H, Ikeda H, et al. Diversity of immunodominant 56-kDa type-specific antigen ofRickettsiatsutsugamushi[J]. J Biol Chem, 1992, 267: 12728-12735.

[7]Zhu LN, Zhang JB, Chen ML, et al. Detection ofOrientiatsutsugamushiby quantitative real-time PCR assay[J]. Chin J Zoonoses, 2006, 22(3): 228-231. (in Chinese)

朱麗娜，張晶波，陳梅玲，等.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)恙蟲病東方體[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2006,22(3):228-231.

[8]Fu XP, He JR, Zhang JS, et al. Establishment of real-time PCR assays for detection ofOrientiatsutsugamushi56kD gene with a TaqMan-MGB probe[J]. Chin J Vector Biol Ctrl, 2012, 23(2): 108-110. (in Chinese)

付秀萍，賀金榮，張景山，等.TaqMan-MGB探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)恙蟲病東方體方法的建立[J].中國(guó)媒介生物學(xué)及控制雜志，2012,23(2):108-110.

[9]Lee JH, Park HS, Jang WJ, et al. Differentiation of rickettsiae by groEL gene analysis[J]. J Clin Microbiol, 2003, 41: 2952-2960. DOI: 10.1128/JCM.41.7.2952-2960.2003

[10]Enatsu T, Urakami H, Tamura A. Phylogenetic analysis ofOrientiatsutsugamushistrains based on the sequence homologies of 56-kDa type-specific antigen genes[J]. FEMS Microbiol Lett, 1999, 180: 163-169. DOI: 10.1111/j.1574-6968.1999.tb08791.x

[11]Tan ZM, Li ZF, Cu K, et al. Molecular epidemiology of scrub typhus outbreak in Jiangsu Province, China, 2011[J]. J Microbiol Immunol, 2012, 32(9): 769. (in Chinese)

談忠鳴，李志峰，儲(chǔ)凱，等.江蘇地區(qū)2011年恙蟲病暴發(fā)的分子流行病學(xué)研究[J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志,2012,32(9):769.