馬紅英，周海燕，沙建平

·綜述與講座·

血紅素氧合酶在幽門螺桿菌定植黏附中的作用研究進展

馬紅英，周海燕，沙建平

幽門螺桿菌;血紅素氧合酶;定植

幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，H.pylori)為一種定植于胃黏膜的革蘭陰性微需氧菌，其感染呈慢性趨勢，是慢性胃炎、胃十二指腸潰瘍的重要致病因素，并與胃黏膜相關(guān)淋巴組織(MALT)淋巴瘤和胃癌密切相關(guān)，世界衛(wèi)生組織更是將其列為一類致癌因子［1］，在發(fā)展中國家感染率可達70%以上，中國人群感染H.pylori的人數(shù)約有6億。H.pylori的高感染率使其對人類健康構(gòu)成嚴重危害，但其在胃內(nèi)復(fù)雜環(huán)境下黏附定植的機制仍不很清楚，闡明其定植機制對有效預(yù)防和治療H.pylori感染具有重要的指導(dǎo)意義。

1 病原微生物的黏附定植是H.pylori感染致病的重要前提

H.pylori能夠在極低pH值、眾多胃蛋白酶等不利因素下成功定植，病原微生物的黏附定植是其感染致病的重要前提，其鐵代謝相關(guān)蛋白發(fā)揮至關(guān)重要的作用。最新研究發(fā)現(xiàn)，維持胃黏膜中金屬離子的動態(tài)平衡是H.pylori能夠在復(fù)雜環(huán)境中黏附定植的必備條件之一。大量動物實驗顯示，多種與鐵、銅、鎳等金屬離子代謝相關(guān)的蛋白成分都與H.pylori的定植感染密切相關(guān)［2-5］，其中與鐵代謝相關(guān)的蛋白在H.pylori的最終黏附定植中扮演著更為重要的角色。Koga等［6］發(fā)現(xiàn)，當(dāng)增加食物中鐵離子含量時，H.pylori在小型豬胃黏膜的定植率明顯提高。Waidner等［7］在敲除H.pylori鐵蛋白基因pfr后，發(fā)現(xiàn)該敲除株難以在蒙古沙鼠胃黏膜定植。Gancz等［8］的研究表明，H.pylori的鐵吸收調(diào)節(jié)蛋白(ferric uptake regulator，F(xiàn)ur)與H.pylori在胃內(nèi)的成功定植密切相關(guān)，F(xiàn)ur突變株的定植率可較野生株降低100倍，因為其是H.pylori鐵代謝中的主要調(diào)節(jié)因子，在鐵攝取、利用、儲存過程中都發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。由此可見，H.pylori的鐵代謝相關(guān)蛋白在其黏附定植中是至關(guān)重要的，其代謝機制也是研究的重點，但其中許多關(guān)鍵問題并未完全闡明。

2 未知功能蛋白HP0318(HugZ)與血紅素氧合酶(hem in oxygenase，HO)的關(guān)系

在H.pylori血紅素鐵代謝途徑中起關(guān)鍵作用的HO一直未發(fā)現(xiàn)，而筆者的前期研究證實，H.pylori中的HugZ具有HO的功能，并與 H.pylori的適應(yīng)性定植密切相關(guān)，推測HugZ即為H.pylori的血紅素氧合酶。

HO作為血紅素代謝過程中的限速酶，其降解血紅素釋放出的鐵是細菌的主要鐵源之一［9］。目前在多種革蘭陰性致病菌中都發(fā)現(xiàn)了HO，如空腸彎曲菌、鼠疫耶爾森菌、腦膜炎奈瑟氏菌、志賀(氏)菌、霍亂弧菌及白喉桿菌等，其在細菌的黏附定植中都發(fā)揮著不可替代的作用［10-11］。有研究發(fā)現(xiàn)，在敲除白喉桿菌和腦膜炎奈瑟氏菌中的HO編碼基因后，細菌難以在宿主體內(nèi)生存定植［12-13］。而最近對與H.pylori感染類似的革蘭陰性微需氧菌空腸彎曲菌的研究也發(fā)現(xiàn)，鐵的獲取是其在宿主腸道內(nèi)定植及持續(xù)感染的重要條件之一，其中高保守的血紅素氧合酶cj1613c發(fā)揮著關(guān)鍵的作用［14］。早期研究發(fā)現(xiàn)，H.pylori基因組中包含與其他細菌血紅素鐵攝取利用系統(tǒng)同源的基因位點，推測H.pylori同樣具有HO功能的相關(guān)蛋白，但至今仍未發(fā)現(xiàn)。

郭剛等［15］通過蛋白組學(xué)二維電泳技術(shù)，比較臨床分離的1株幽門螺桿菌在蒙古沙土鼠體內(nèi)從原代(M0)到穩(wěn)定傳代(M13)細菌的蛋白組學(xué)變化，發(fā)現(xiàn)有若干蛋白改變，HugZ就是其中之一，并且該蛋白與H.pylori在沙鼠中的適應(yīng)性定植密切相關(guān)，其突變株在胃內(nèi)的定植密度較原始株減少約5倍。為了驗證HugZ的具體功能，闡明其與H.pylori黏附定植的關(guān)系，之后筆者又進行了一系列體外生物化學(xué)實驗，發(fā)現(xiàn)該蛋白可與血紅素結(jié)合并催化其降解為膽綠素，釋放出CO和鐵。同時，通過微生物基因組學(xué)比較，發(fā)現(xiàn)HugZ基因與在空腸彎曲菌中發(fā)現(xiàn)的cj1613c有62.7%的同源性。因此，推測 HugZ即為在 H.pylori鐵代謝中發(fā)揮重要作用的HO。

3 HugZ蛋白的結(jié)構(gòu)與生物學(xué)功能

解析HugZ與血紅素結(jié)合的復(fù)合物(HugZ-Hemin)的晶體結(jié)構(gòu)，可進一步確定HugZ的生物學(xué)功能，分析其血紅素結(jié)合位點及催化活性位點，為闡明其在H.pylori黏附定植中的作用提供有力證據(jù)。

目前，真核生物中的HO已較明確，細菌中的HO雖然具有同樣的催化功能，但其具體的空間結(jié)構(gòu)及作用機制各不相同，因為不同的細菌面對的是不一樣的生存環(huán)境。已有研究發(fā)現(xiàn)［16］，銅綠假單胞菌、白喉桿菌和腦膜炎奈瑟氏菌的HO與人類HO結(jié)構(gòu)相似，鼠疫耶爾森菌及金黃色葡萄球菌的HO晶體結(jié)構(gòu)卻完全不同。作為在胃黏膜這一特殊環(huán)境中定植的HO，HugZ極可能有自己獨特的空間構(gòu)象及作用機制。研究HugZ與HugZ-Hemin的三維結(jié)構(gòu)，有助于明確其功能，從而進一步探討其在H.pylori黏附定植中的作用。目前國內(nèi)外尚未見關(guān)于H.pylori中HO的研究報道，筆者查找了酶學(xué)方面研究的資料，并結(jié)合HugZ晶體結(jié)構(gòu)的信息，探討這個蛋白可能的血紅素結(jié)合位點及催化活性位點，在此基礎(chǔ)上進一步研究和解釋其生物學(xué)功能。同時，筆者認為通過定點突變及基因敲除等手段構(gòu)建突變體，以體外生物化學(xué)實驗驗證其血紅素結(jié)合能力及催化活性，在動物實驗中探討HugZ與H.pylori黏附定植的關(guān)系，可以進而研究其在H.pylori定植中的具體作用。

［1］ Huang CH，Chiou SH.Clinical proteomics identifes potential biomarkers in Helicobacter pylori for gastrointestinal diseases［J］.World JGastroenterol，2014，20(6):1529-1536.

［2］ Xiao D，Zhang H，He LH，et al.High natural variability bacteria identification and typing:Helicobacter pylori analysis based on peptidemass fingerprinting［J］.JProt，2014，98:112-122.

［3］ Panthel K，Dietz P，Haas R，etal.Two-component systems of Helicobacter pylori contribute to virulencemouse infectionmodel［J］.Infect Immun，2003，71(9):5381-5385.

［4］ Waidner B，Melchers K，St?hler FN，etal.The Helicobacter pylori CrdRS two-component regulation system(HP1364/HP1365)is required for copper-mediated induction of the copper resistance determinant CrdA［J］.JBacteriol，2005，187(13):4683-4688.

［5］ St?hler FN，Odenbreit S，Haas R，et al.The novel Helicobacter pylori CznABCmetal efflux pump is required for cadmium，zinc，and nickel resistance，ureasemodulation，and gastric colonization.［J］.Infect Immun，2006，74(7):3845-3852.

［6］ Koga T，Shimada Y，Sato K，et al.Contribution of ferrous iron to maintenance of the gastric colonization of Helicobacter pylori in miniature pigs［J］.Microbiol Res，2002，157(4):323-330.

［7］ Waidner B，Greiner S，Odenbreit S，etal.Essential role of ferritin Pfr in Helicobacter pylori iron metabolism and gastric colonization［J］.Infect Immun，2002，70(7):3923-3929.

［8］ Gancz H，Censini S，Merrell DS.Iron and pH homeostasis intersect at the level of Fur regulation in the gastric pathogen Helicobacter pylori［J］.Infect Immun，2006，74(1):602-614.

［9］ Wilks A，Burkhard KA.Heme and virulence:how bacterial pathogens regulate，transportand utilize heme［J］.Nat Prod Rep，2007 24(3):511-522

［10］ Schmitt MP.Utilization of host iron sources by corynebacterium diphtheriae:identification of a gene whose product is homologous to eukaryotic heme oxygenases and is required for acquisition of iron from heme and hemoglobi［J］.J Bacteriol，1997，179(3): 838-845.

［11］Ratliff M，Zhu W，Deshmukh R，et al.Homologues of neisserial heme oxygenase in gram-negative bacteria:degradation of heme by the product of the pigA gene of pseudomonas aeruginosa［J］.J Bacteriol，2001，183(21):6394-6403.

［12］Kunkle CA，Schmitt MP.Comparative analysis of hmuO function and expression in corynebacterium species［J］.JBacteriol，2007，189(9):3650-3654.

［13］Zhu W，Wilks A，Stojiljkovic I.Degradation of heme in gram-negative bacteria:the productof the hemO gene ofneisseriae is a heme oxygenase［J］.JBacteriol，2000，182(23):6783-6790.

［14］Ridley KA，Rock JD，Li Y，et al.Heme utilization in campylobacter jejuni［J］.JBacteriol，2006，188(22):7862-7875.

［15］郭剛，童文德，曾浩，等.幽門螺桿菌適應(yīng)性定植蒙古沙鼠前、后的蛋白質(zhì)組學(xué)研究［J］.微生物學(xué)報，2007，47(3): 461-464.

［16］Unno M，Matsui T，Ikeda-Saito M，et al.Structure and catalytic mechanism of heme oxygenase［J］.Nat Prod Rep，2007，24(3): 553-570.

R517.9

A

10.3969/j.issn.1009-0754.2014.05.036

2014-03-27)

(本文編輯:施 莼)

200081 上海，解放軍第四一一醫(yī)院門診部(馬紅英、周海燕);解放軍第四二一醫(yī)院消化科(沙建平)

沙建平，電子信箱:shajianping99@sina.com