曹明雅（綜述），趙志明（審校）

（河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，河北 石家莊 050000）

生長分化因子9在卵泡生長發(fā)育中的調(diào)控

曹明雅（綜述），趙志明*（審校）

（河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，河北 石家莊 050000）

生長分化因子9；卵泡；卵母細(xì)胞；綜述文獻(xiàn)

生長分化因子9（growth differentiation factor 9，GDF-9）是卵源性的生長因子，亦是由卵母細(xì)胞通過旁分泌方式產(chǎn)生，在卵泡生長和發(fā)育的調(diào)節(jié)中具有重要作用，屬于轉(zhuǎn)化生長因子β（transforminggrowth factor-β，TGF-β）超家族?，F(xiàn)對GDF-9在卵泡生長發(fā)育中的調(diào)控作用、甾體激素的合成及其在不孕治療過程中對卵母細(xì)胞質(zhì)量的影響等進(jìn)行綜述。

1 GDF-9的結(jié)構(gòu)與表達(dá)部位

GDF-9是TGF-β超家族的成員之一。人類GDF-9基因定位于5q31.3上，含有1.6kb的內(nèi)含子及2個外顯子，與已知的該家族其他成員相比，具有高度同源性的GDF-9多肽序列由包括1～27個氨基酸編碼的信號肽序列、318個氨基酸殘基的前結(jié)構(gòu)域和含有135個殘基的成熟結(jié)構(gòu)域共454個氨基酸組成。但GDF-9的成熟結(jié)構(gòu)域僅有6個保守的半胱氨酸殘基，而TGF-β家族中有7個保守的半胱氨酸殘基，因此GDF-9是以異源二聚體形式存在還是共價結(jié)合的同源二聚體形式存在仍存在爭議，有待進(jìn)一步研究。

GDF-9主要由卵巢產(chǎn)生并表達(dá)于特定細(xì)胞而發(fā)揮作用。但在人類及不同物種之間其表達(dá)的時間和定位不同。人類的性腺組織及非性腺組織中均可表達(dá)GDF-9mRNA［1］。在靈長類動物的卵巢中，卵母細(xì)胞、丘顆粒細(xì)胞以及壁層顆粒細(xì)胞中均有GDF-9表達(dá)。一篇以成年雌性恒河猴為研究對象的文獻(xiàn)也報道［2］，在促性腺激素高峰至排卵期間，GDF-9表達(dá)于所有的卵母細(xì)胞、丘顆粒細(xì)胞及其腔壁顆粒細(xì)胞，并且還檢測到了GDF-9蛋白在卵泡液中也有表達(dá)。與之相反，在嚙齒類動物中則顆粒細(xì)胞上未檢測到GDF-9的表達(dá)而僅于卵母細(xì)胞上檢測到。對體外培養(yǎng)的人類顆粒細(xì)胞采用定量逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng)與免疫印跡法（Western Blot）檢測發(fā)現(xiàn)其也可表達(dá)GDF-9。

2 GDF-9與卵泡的發(fā)育

卵泡的發(fā)育主要由2個階段構(gòu)成，即不依賴促性腺激素階段（主要是指原始卵泡和初級卵泡階段）和依賴促性腺激素階段（主要是指竇卵泡階段）。對正常的卵泡發(fā)育來說，GDF-9是必需的，并且通過特異性表達(dá)于人類及大多數(shù)哺乳動物的卵巢組織而與其一同維持卵巢功能并發(fā)揮作用。

2.1 GDF-9對原始卵泡及竇前卵泡的調(diào)控：卵泡發(fā)育由原始卵泡的卵母細(xì)胞產(chǎn)生GDF-9開始。對于早期卵泡發(fā)育GDF-9是必需的，缺失GDF-9的雌性小鼠其卵泡發(fā)育大多停滯在初級卵泡（單層顆粒細(xì)胞）階段［3］。在人類的卵巢組織中加入重組GDF-9進(jìn)行體外培養(yǎng)后，大量的始基卵泡啟動生長，卵泡閉鎖減少，卵泡更多的存活、生長并發(fā)育至次級卵泡階段［4］。這說明GDF-9不僅能夠?qū)υ悸雅莸哪技M(jìn)行誘導(dǎo)，還能夠促進(jìn)初級卵泡過渡到小竇前卵泡期。對未發(fā)育成熟的大鼠給予重組GDF-9后，大鼠的卵巢質(zhì)量增加，初級卵泡數(shù)及小竇前卵泡數(shù)也增加，分別為30%和60%，而原始卵泡的數(shù)量減少了29%［5］。此外，GDF-9還對早期卵泡的進(jìn)一步生長與分化起著重要作用，卵母細(xì)胞分泌的內(nèi)源性GDF-9是一種重要的有絲分裂原。

應(yīng)用RNA干擾技術(shù)體外阻斷GDF-9由竇前卵泡過渡到竇卵泡期的表達(dá)，無論是竇前卵泡的基礎(chǔ)發(fā)育還是卵泡刺激素誘導(dǎo)下的發(fā)育均受阻；可能原因是 GDF-9被阻斷后，細(xì)胞凋亡蛋白酶 3（Caspase-3）被激活，而激活Caspase-3促使竇前卵泡發(fā)生凋亡。相反，增加外源性GDF-9則可以對竇前卵泡發(fā)育起促進(jìn)作用而對抗Caspase-3對其促凋亡的作用。因此，GDF-9可能通過這種對竇前卵泡抗凋亡的調(diào)控，在其向早期竇卵泡的生長發(fā)育過程中起到促進(jìn)作用［6］。

2.2 GDF-9對促性腺激素依賴階段卵泡的調(diào)控：在該階段，影響卵泡發(fā)育的主要因素有卵泡膜細(xì)胞、顆粒細(xì)胞、卵丘及卵母細(xì)胞，GDF-9正是通過對這些細(xì)胞發(fā)揮作用而影響卵泡發(fā)育的。GDF-9對顆粒細(xì)胞的增殖有明顯促進(jìn)作用［7－8］。同時，GDF-9亦能夠給予卵母細(xì)胞最適宜生長的內(nèi)環(huán)境，這是通過調(diào)節(jié)卵丘擴展中起關(guān)鍵作用的酶的活性，有利于形成含豐富透明質(zhì)酸的細(xì)胞外基質(zhì)實現(xiàn)的。另外，重組GDF-9直接上調(diào)和卵丘膨脹相關(guān)的透明質(zhì)酸酶2及前列腺素內(nèi)過氧化物酶2、腫瘤壞死因子誘導(dǎo)蛋白6及正五聚蛋白 3的合成，而使尿激酶纖溶酶原激活物mRNA合成被抑制，GDF-9對這些基因表達(dá)的調(diào)控，最終影響了卵丘的擴張及晚期卵泡的發(fā)育［］。

3 GDF-9對顆粒細(xì)胞影響

卵源性GDF-9能夠刺激小竇卵泡至排卵前卵泡的顆粒細(xì)胞增生［10］，因此，顆粒細(xì)胞是其重要的靶細(xì)胞。對大鼠進(jìn)行體外研究，發(fā)現(xiàn)GDF-9反義核苷酸可以下調(diào)顆粒細(xì)胞上促卵泡生成素（follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）受體mRNA的表達(dá)，使基礎(chǔ)狀態(tài)以及促卵泡生成素刺激下的竇前卵泡的生長被抑制，同時還可以激活細(xì)胞蛋白凋亡酶增加竇前卵泡的凋亡，但外源性GDF-9的加入可以對抗該作用。加入GDF-9后卵泡的發(fā)育數(shù)增加，GDF-9通過激活GDF-9磷脂酸激酶3通路，抑制顆粒細(xì)胞的凋亡和閉鎖，從而保護(hù)顆粒細(xì)胞免受凋亡，促進(jìn)竇前到竇卵泡的生長。這一結(jié)果提示顆粒細(xì)胞上FSH受體發(fā)生異常，使其對FSH受體的反應(yīng)性下降，從而影響竇前期和早竇狀卵泡的生長，是由于GDF-9缺陷造成，因此FSH受體要正常發(fā)揮作用足量的GDF-9是必需的［11］。反之，F(xiàn)SH也能調(diào)節(jié)GDF-9受體的表達(dá)，還能調(diào)節(jié)環(huán)氧合酶 2（環(huán)氧合酶（cyclooxygenase，COX-2）表 達(dá)，并 且 雌 二 醇（estradiol，E2）和FSH協(xié)同增強 GDF-9受體在培養(yǎng)的顆粒細(xì)胞中的表達(dá)［12－13］，從而影響顆粒細(xì)胞的增殖、分化，卵丘的擴散，類固醇激素的合成以及卵母細(xì)胞的成熟排卵和黃體化。

將卵丘顆粒細(xì)胞包裹的卵母細(xì)胞去除明顯增加了丘顆粒細(xì)胞凋亡率，而加入裸卵則顯著降低其凋亡率，并且發(fā)現(xiàn)丘顆粒胞的凋亡率與其跟卵母細(xì)胞之間的距離呈梯度增加的關(guān)系，這說明卵丘顆粒細(xì)胞的凋亡與卵母細(xì)胞分泌的某些細(xì)胞因子有關(guān)，GDF-9可能通過促進(jìn)顆粒細(xì)胞中蛋白激酶B磷酸化抑制顆粒細(xì)胞凋亡［14］。

4 GDF-9對卵母細(xì)胞的影響

GDF-9缺乏的卵母細(xì)胞不能進(jìn)行減數(shù)分裂［15］。對GDF-9缺失的小鼠進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，其卵泡大多于初級階段停止發(fā)育，觀察超微結(jié)構(gòu)顯示卵母細(xì)胞的高爾基體發(fā)生異常，核周細(xì)胞器呈退化表現(xiàn)，皮質(zhì)激素?zé)o法正常合成，與周圍細(xì)胞之間異常的縫隙連接，穿越透明帶時減少的微管，最終導(dǎo)致卵周隙損害，使卵母細(xì)胞死亡。同時，GDF-9的缺失還可以間接影響卵母細(xì)胞從生長、發(fā)育至成熟的過程，主要是通過上調(diào)抑制素α（存在于卵泡顆粒細(xì)胞上）及kit配體的表達(dá)而實現(xiàn)［16］。由于卵母細(xì)胞與顆粒細(xì)胞之間存在雙向聯(lián)系，所以卵母細(xì)胞可以通過調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞的功能來調(diào)控卵泡內(nèi)的微環(huán)境，從而滿足其自身生長的需要。促性腺激素可以促進(jìn)正常卵母細(xì)胞中GDF-9的產(chǎn)生。由于這種卵源性因子的參與，卵母細(xì)胞和卵丘細(xì)胞之間形成了雙向的調(diào)節(jié)，推測其表達(dá)水平異?？赡苡绊懧涯讣?xì)胞－卵丘復(fù)合體的結(jié)構(gòu)和功能，從而導(dǎo)致卵母細(xì)胞質(zhì)量和發(fā)育潛能受損［3］。

5 GDF-9激素合成

GDF-9可以影響卵巢內(nèi)的卵泡膜細(xì)胞上類固醇激素合成。將小鼠的GDF-9基因敲除，則其卵泡膜細(xì)胞分化缺陷，存在于卵泡膜上的促黃體生成素（luteotropic，LH）受體、ckit受體（Ⅲ型蛋白酪氨酸激酶受體超家族成員）和17α-羧化酶等分化標(biāo)志物缺乏，從而阻礙卵泡膜細(xì)胞的分化，但在給予外源性GDF-9后，用 Western Blot法測定卵巢勻漿中的17α-羧化酶量，發(fā)現(xiàn)顯著增加。表明GDF-9還能夠通過影響卵巢卵泡膜細(xì)胞類固醇激素和相關(guān)因子的產(chǎn)生，影響卵泡的發(fā)育和分化。GDF-9影響卵泡類固醇激素的生成，尤其對卵泡膜細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)具有重要作用［2］。

GDF-9可通過調(diào)節(jié)FSH的活性而影響FSH對顆粒細(xì)胞的作用［17］。在顆粒細(xì)胞未分化前，GDF-9調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞的生長，主要是通過降低FSH的生物學(xué)效應(yīng)，避免顆粒細(xì)胞提前黃素化實現(xiàn)。在小竇卵泡發(fā)育至排卵前卵泡階段，GDF-9對雌孕激素的生成及FSH刺激下的顆粒細(xì)胞生長起促進(jìn)增強的作用，同時又抑制顆粒細(xì)胞的分化，并降低FSH、胰島素生長因子Ⅰ、8.Br.環(huán)磷酸腺苷和FSH共同刺激下的包括E2、孕酮（progesterone，P）、細(xì)胞色素p450膽固醇側(cè)鏈裂解酶和細(xì)胞色素芳香化酶p450、類固醇生成急性調(diào)節(jié)蛋白以及淋巴細(xì)胞歸巢受體等甾體激素的生成［2］，這提示GDF-9可能是一種來源于卵巢，對避免生長卵泡中的顆粒細(xì)胞過早分化起抑制作用的黃素化抑制因子。相反，當(dāng)顆粒細(xì)胞已被FSH／LH激活至排卵前，GDF-9則可以使其分化狀態(tài)發(fā)生改變，上調(diào)其下游靶基因COX-2基因及前列腺素受體mRNA的表達(dá)水平，促進(jìn)卵丘細(xì)胞上孕激素的合成［18］。

6 GDF-9與輔助生殖

目前，促排卵治療在不孕癥中的應(yīng)用主要是通過對促卵泡生成素敏感的竇前卵泡以及竇卵泡應(yīng)用促性腺激素，從而使其募集到更多進(jìn)入發(fā)育池，但對于促卵泡生成素不敏感的竇前及竇卵泡則沒有有效方法。近年來，隨著對GDF-9在卵泡生長、發(fā)育和成熟過程中的作用以及其表達(dá)調(diào)控機制的研究日益深入，是否可以考慮對促性腺激素反應(yīng)不敏感的患者，通過外源性給予GDF-9以促進(jìn)卵泡的發(fā)育，而促使體內(nèi)對促性腺激素發(fā)生反應(yīng)的卵泡數(shù)量增加來解決上述問題。另外，未成熟卵的體外培養(yǎng)在技術(shù)上還存在諸多問題，如卵母細(xì)胞成熟度不高、受精率低、胚胎發(fā)育潛能欠佳、與正常胚胎比細(xì)胞卵裂時更易發(fā)生阻滯和延遲等。在動物卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)體系中進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，外源性加入卵源性因子可以提高囊胚形成率和胎兒存活率［6］。此外，有些研究已經(jīng)嘗試在人類或哺乳動物某一階段卵泡的體外培養(yǎng)中加入重組的具有生物活性的GDF-9，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其對早期卵泡的生長有促進(jìn)作用［19］。GDF9表達(dá)水平變化有望成為卵母細(xì)胞胞質(zhì)成熟和細(xì)胞質(zhì)量的評價指標(biāo)。

綜上所述，GDF-9是由卵母細(xì)胞分泌，并通過自分泌、旁分泌的方式作用于卵巢，協(xié)同維持卵巢的生殖和內(nèi)分泌功能，通過影響顆粒細(xì)胞增殖、卵丘擴展、激素合成、降低顆粒細(xì)胞凋亡率等影響卵母細(xì)胞的質(zhì)量，從而影響體外受精－胚胎移植妊娠率。

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（本文編輯：許卓文）

R711.75

A

1007-3205（2014）10-1231-04

2014－01－20；

2014－02－24

曹明雅（1986－），女，河北石家莊人，河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院醫(yī)學(xué)碩士研究生，從事生殖醫(yī)學(xué)研究。

*通訊作者。E-mail：zhaozhiming73＠163.com

10.3969／j.issn.1007-3205.2014.10.045