易穎，金旭紅，張壽

(?？谑腥嗣襻t(yī)院骨科中心，海南海口570208)

·綜述·

人BMSCs復(fù)合載體支架修復(fù)軟骨缺損的研究進展

易穎，金旭紅，張壽

(海口市人民醫(yī)院骨科中心，海南海口570208)

我們廣泛查閱近年來有關(guān)人骨髓間充質(zhì)干細胞及載體支架材料研究與應(yīng)用的文獻，并選擇常見的幾種細胞載體支架材料分別進行闡述。人骨髓間充質(zhì)干細胞作為最實現(xiàn)性的細胞源，將在軟骨組織工程的研究及應(yīng)用中發(fā)揮重要的作用。理想的支架材料在種子細胞修復(fù)軟骨缺損中起到事半功倍的作用。人骨髓間充質(zhì)干細胞復(fù)合現(xiàn)有支架材料仍存在許多問題。將人骨髓間充質(zhì)干細胞復(fù)合自體脫鈣骨基質(zhì)，成軟骨誘導(dǎo)促進軟骨缺損的修復(fù)，因其良好的穩(wěn)定性與免疫學(xué)性能，值得今后更深入地研究。

人骨髓間充質(zhì)干細胞；支架材料；永生化；脫鈣骨基質(zhì)；軟骨缺損

由于外傷、創(chuàng)傷后慢性損傷、退行性變、關(guān)節(jié)退化等原因造成的關(guān)節(jié)軟骨受損在臨床上日趨常見。根據(jù)國際軟骨修復(fù)協(xié)會建立的軟骨損傷評價體系，將軟骨損傷按嚴重程度分為五級。其中特別是缺損完全穿透軟骨，到達軟骨下骨更是臨床難題。而關(guān)節(jié)軟骨本身的再生修復(fù)能力十分微弱[1]，一旦受損，組織破壞往往從關(guān)節(jié)表面持續(xù)延展的關(guān)節(jié)深層。這樣繼續(xù)發(fā)展將導(dǎo)致關(guān)節(jié)性病變或骨關(guān)節(jié)炎，更嚴重的晚期只能進行關(guān)節(jié)置換治療[2]。以往常用的骨髓刺激技術(shù)、自體或異體骨軟骨移植、骨膜軟骨膜移植等治療方法因存在著纖維化、退化或者二期骨化的問題，都難以取得理想的效果[3]。組織工程再生醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展為其提供了一條新的思維方向。因此，如何修復(fù)軟骨缺損成為目前組織工程研究的熱點之一。

組織工程研究由種子細胞、支架材料、組織構(gòu)建和細胞生長調(diào)節(jié)因子四大基本要素構(gòu)成[4]。目前軟骨細胞組織工程研究的熱點及難點主要包括：尋找理想的種子細胞及其培養(yǎng)擴增方法、提供適當(dāng)?shù)募毎d體支架及固定方法和明確各種細胞因子的調(diào)控機理并誘導(dǎo)種子細胞分化等。

1 種子細胞的選擇

軟骨再生的潛在細胞源包括：同源軟骨細胞、間充質(zhì)干細胞、胚胎干細胞和誘導(dǎo)多能干細胞等。間充質(zhì)干細胞是最常用的軟骨組織工程種子細胞，具有良好的多向分化潛能和增值能力。它可以從骨髓、臍血等全身多處組織中分離提取，在一定的誘導(dǎo)條件下能夠分化為成骨細胞、成軟骨細胞、脂肪細胞等[5]。其中，骨髓是間充質(zhì)干細胞的重要來源，具有取材簡便、來源充足、免疫原性弱、分化能力強等特點[6-9]，是最實現(xiàn)性的細胞源。

以骨髓間質(zhì)干細胞為基礎(chǔ)的全層軟骨缺損修復(fù)已經(jīng)在動物模型中有廣泛嘗試，但在臨床上應(yīng)用于臨床軟骨修復(fù)的病例少見。在軟骨再生治療上還處于初期發(fā)展階段是由于來自以下的幾個挑戰(zhàn)。

1.1 年齡對種子細胞的影響在臨床上，隨著時間不斷磨損導(dǎo)致的退行性關(guān)節(jié)病變以及長期缺乏活動導(dǎo)致的關(guān)節(jié)退變的老年患者在關(guān)節(jié)軟骨缺損的病例中占有不小的比例。這說明年齡與其具有非常重要的關(guān)系，年長的患者體細胞質(zhì)量低下。隨著年齡的增長，患者體內(nèi)骨髓間充質(zhì)干細胞的含量、質(zhì)量和活性等是否也隨之下降？國內(nèi)外研究者目前看法并不一致。早在二十世紀末，Nishida等[10]研究提示隨著年齡增長骨髓間充質(zhì)干細胞自我更新能力逐漸下降。Pittenger等[11]研究人骨髓間充質(zhì)干細胞的增殖能力與成骨方向分化的潛能，發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細胞的增殖能力與年齡及性別之間沒有明顯的關(guān)系。近年又有學(xué)者研究顯示骨髓間充質(zhì)干細胞的含量質(zhì)量活性等隨著年齡的增長而下降[12]。若采用同種異體骨髓間充質(zhì)干細胞修復(fù)老年患者的關(guān)節(jié)軟骨缺損又存在免疫排斥反應(yīng)。

1.2 種子細胞的免疫學(xué)特點在自體種子細胞取材有限或適應(yīng)證受限的情況下，可以考慮采用同種異體細胞。骨髓間充質(zhì)干細胞具有低免疫原性，并且可以直接抑制活化的效應(yīng)性CD4+T細胞增殖和激活并維持Treg細胞的潛能[13]。在異體間質(zhì)干細胞分化成為功能性的軟骨細胞，它們就會逐漸失去免疫抑制效應(yīng)，其免疫原性得到增強。為了增加細胞數(shù)量而長時間的體外培養(yǎng)過程中，種子細胞的表型可能會發(fā)生自發(fā)的改變。這表明異體之間的間質(zhì)干細胞因其免疫學(xué)的特點或許并不適用于軟骨組織的修復(fù)。雖然低溫冷凍可降低軟骨細胞免疫原性，但也會導(dǎo)致軟骨細胞活性丟失。目前研究多采用冷凍一周內(nèi)的新鮮組織細胞移植，可盡量降低免疫排斥反應(yīng)又能維持更長時間關(guān)節(jié)軟骨的功能[14]。Froncois等[15]發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細胞不僅可遞呈可溶性抗原，而且可介導(dǎo)CD8+T細胞免疫反應(yīng)。骨髓間充質(zhì)干細胞在體外可抑制細胞增殖，但體內(nèi)試驗卻未能抑制移植物抗宿主反應(yīng)。當(dāng)間充質(zhì)干細胞在體外誘導(dǎo)分化成成軟骨細胞的過程中，其生物學(xué)特性發(fā)生了改變，原高表達的負性協(xié)同刺激分子下調(diào)，而多種原不表達的正性協(xié)同刺激分子不同程度的進行上調(diào)抗原提呈細胞的抗原遞呈作用，將抗原信息傳遞給T細胞，引起T細胞活性。

1.3 種子細胞的永生化與致瘤性骨髓間充質(zhì)干細胞在培養(yǎng)過程中存在著細胞老化、干細胞樣特征丟失的現(xiàn)象。有研究者提出“永生化”的概念。Tsai等[16]將端粒末端轉(zhuǎn)移酶反轉(zhuǎn)錄酶的片段phTERT-IRES2-EGFP轉(zhuǎn)染入KP細胞，建立了3A6細胞系，發(fā)現(xiàn)新建立的細胞系與原始骨髓間充質(zhì)干細胞相比，其增生能力、干細胞樣特征均提高，多次傳代導(dǎo)致細胞自動分化，干細胞樣特征丟失的問題也得到一定解決。國外學(xué)者在體外利用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，將尤因肉瘤易位癌基因家族蛋白基因植入人的間充質(zhì)干細胞后，細胞的形態(tài)從紡錘體的外形變?yōu)樾A形或多角形，而后者其實是腫瘤細胞的形態(tài)之一。且原本間充質(zhì)干細胞應(yīng)有的表型如CD10、CD13等消失。相反，尤因肉瘤細胞的表型如CD54、CD99、CD117、CD271表達強度有明顯的上調(diào)。這表明尤因家族腫瘤可能來自于人間充質(zhì)干細胞[17]。還有更多的實驗提示間充質(zhì)干細胞可能與惡性腫瘤的關(guān)系密切，其惡性轉(zhuǎn)化及移植后潛在的致瘤性引起普遍關(guān)注，人們越來越關(guān)心間充質(zhì)干細胞移植治療的安全性；上述問題目前還知之甚少，都有待深入闡釋。

2 細胞載體支架的選擇

以生物材料作細胞生長的三維支架，利用組織工程技術(shù)生產(chǎn)用于移植治療的軟骨組織成為當(dāng)前研究熱點。支架材料作為人工的細胞外基質(zhì)，主要作用是模擬細胞在體內(nèi)的生長空間，為細胞形成軟骨提供一個繼續(xù)增殖分化的微環(huán)境。它為軟骨細胞提供三維空間結(jié)構(gòu)，有利于細胞的粘附、增殖，為細胞的生長提供良好的生長環(huán)境。理想的支架材料要具備良好的生物相容性、生物降解性、良好的三維空隙結(jié)構(gòu)、較好的承載能力與彈性以及不易脫落等特點[18]。目前尚無一種具有明確優(yōu)勢的組織工程支架具備以上所有特點，到目前為止，任何組織工程替代物都難以完全的模擬天然軟骨的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)[19]。

目前常用的支架材料按其來源分為人工合成支架材料、天然支架材料、復(fù)合支架材料和納米生物材料。

2.1 人工合成支架材料由于在人工合成過程中能直觀地設(shè)計和調(diào)控其微結(jié)構(gòu)、機械強度等材料性能，并且易于生產(chǎn)，人工合成高分子支架材料是目前應(yīng)用程度最廣、研究最多的支架材料。目前常用的人工合成的高分子支架材料主要包括以下[20]：聚乳酸、聚乙醇酸、β-磷酸三鈣、聚羥基乙酸、聚氧化乙烯等。研究者們通常將這些生物材料制成網(wǎng)狀或海綿狀，多孔的設(shè)計具有的特點是其材料的內(nèi)部三維空間與細胞生存的環(huán)境相類似，使得細胞能高效率地進行新陳代謝。早在上世紀九十年代，Vacanti等[21]首先以聚羥基乙酸、聚乳酸作為軟骨細胞體外培養(yǎng)基質(zhì)材料，通過組織工程方法成功獲得新生軟骨。但其降解過快，降解產(chǎn)物在局部聚集影響局部酸堿平衡，從而產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，影響種子細胞的生長增殖。同樣其他人工合成支架材料也存在如親水性弱、表面活性不足、粘附性弱、具有一定免疫原性等缺點。

2.2 天然生物支架材料目前應(yīng)用于軟骨組織工程的天然支架材料主要有：天然基質(zhì)材料、膠原材料、殼聚糖、纖維蛋白、透明質(zhì)酸等。天然生物支架材料來源于生物體本身，具有組織相容性較好、毒性較小、易降解且降解產(chǎn)物易被人體吸收而不產(chǎn)生炎癥反應(yīng)等優(yōu)點，所以在組織工程中作為細胞培養(yǎng)的支架材料具有人工合成材料所不可比擬的優(yōu)勢。

2.2.1 天然基質(zhì)材料采用脫鈣松質(zhì)骨基質(zhì)作為支架材料相對生物合成高分子材料，從1965年首次提出了脫鈣骨基質(zhì)具有成骨誘導(dǎo)能力，到1979年提出骨形態(tài)發(fā)生蛋白學(xué)說，目前脫鈣松質(zhì)骨已廣泛運用于組織工程研究。脫鈣松質(zhì)骨的主要成分是膠原，它保留了天然的骨蛋白和生長因子[22]，與細胞聯(lián)合應(yīng)用中具有骨誘導(dǎo)、骨傳導(dǎo)及骨發(fā)生能力[23]?？讖酱笮∫话憧刂圃?00～500 μm。材料具有生物降解性，其降解產(chǎn)物能被正常吸收，不對周圍環(huán)境造成影響。pH值的變化小，不產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。在骨缺損研究中，骨形態(tài)發(fā)生蛋白能誘導(dǎo)間充質(zhì)干細胞分化為成骨細胞，進而生成新的骨組織[24]，并且能影響到鄰近骨細胞，促進其分泌膠原支架。尤其取自體骨更能最大程度上降低抗原性，抑制免疫排斥反應(yīng)，因此可以作為修復(fù)骨缺損及骨組織工程的支架材料，為骨缺損的治療開辟了一條新途徑。2007年，骨蛋白提取物作為新一代的脫鈣骨基質(zhì)修復(fù)材料開始成為熱點。骨蛋白提取物是從長骨皮質(zhì)骨中提取的淺黃白色、絮狀的膠原基質(zhì)凍干產(chǎn)物，含有Ⅰ型膠原及其他難溶性蛋白，如轉(zhuǎn)化生長因子等。Baas等[25]和Ding等[26]分別進行狗和羊等動物實驗中均無與骨蛋白提取物有關(guān)的并發(fā)癥發(fā)生，表現(xiàn)出良好的生物相容性。在臨床應(yīng)用中，骨蛋白提取物已開始應(yīng)用于關(guān)節(jié)翻修、脊柱融合、骨缺損等手術(shù)中。

2.2.2 膠原材料膠原作為細胞外基質(zhì)的主要成分，含有利于細胞粘附的基團。膠原是主要的支持組織的結(jié)構(gòu)蛋白，其中Ⅰ型膠原以粗纖維形式存在，可以形成較大的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)使組織具有較強的抗張能力，而Ⅲ型膠原的結(jié)構(gòu)是以細纖維為主，組織通過細纖維而具有較強的可擴張能力。Ⅲ型膠原分布于全身各處，多見于皮膚、血管、肺、心臟等，一般是跟隨Ⅰ型膠原的出現(xiàn)而出現(xiàn)的。軟骨外基質(zhì)占軟骨比重的一半左右，軟骨外基質(zhì)的主要成分是由軟骨細胞所分泌的Ⅱ型膠原。在軟骨組織工程中，Ⅱ型膠原往往提示軟骨細胞生長是否良好。在進行軟骨細胞培養(yǎng)時，Ⅱ型膠原能為細胞的生長和增殖提供良好的微環(huán)境。膠原蛋白作為支架材料有利于細胞的粘附、增殖和分化，并能刺激軟骨細胞分泌軟骨基質(zhì)Ⅱ型膠原和糖胺聚糖。膠原的降解產(chǎn)物氨基酸可以被機體完全吸收，其最大缺點是力學(xué)強度不夠，被大大限制了應(yīng)用，所以通常都是將膠原與其他材料復(fù)合或作為支架的表面修飾物以增加支架的細胞粘附性。

2.2.3 殼聚糖殼聚糖是常用的天然高分子材料，在生物的相容性和降解性上性能優(yōu)異。再者，研究者根據(jù)實驗需要選擇相關(guān)的生物活性，只需要改造其側(cè)鏈的修飾基團。一般地，多糖類大多可以作為軟骨細胞載體。有學(xué)者將軟骨細胞植入由殼聚糖制成立體支架，培養(yǎng)一段時間后顯示有糖胺多糖及Ⅱ型膠原生成，這說明殼聚糖能維持軟骨細胞的表型穩(wěn)定性。殼聚糖使植入的種子細胞與宿主組織一體化。國外學(xué)者發(fā)現(xiàn)殼聚糖能使軟骨種子細胞的形態(tài)學(xué)長時間內(nèi)不易發(fā)生變化，并能使支架的粘附性和結(jié)構(gòu)保持穩(wěn)定。Hao等[27]用殼聚糖結(jié)合軟骨細胞修復(fù)羊的軟骨缺損，24周的培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，羊的軟骨缺損得到完全修復(fù)。另外，單純的殼聚糖水凝膠，不結(jié)合細胞，也有助于對軟骨缺損進行修復(fù)。

2.3 復(fù)合支架材料隨著組織工程學(xué)技術(shù)的深入，單一的支架材料通常因為局限性，并不能滿足軟骨缺損修復(fù)的現(xiàn)實要求。復(fù)合多種支架材料可以發(fā)揮各自優(yōu)點,可以促進組織工程產(chǎn)品的修復(fù)重建效果。復(fù)合材料是指將不同的材料按需要復(fù)合，或者利用物理、化學(xué)、生物等方式或仿生學(xué)原理改變或模擬現(xiàn)有材料的特性，使新生材料擁有需要的優(yōu)勢，規(guī)避劣勢。復(fù)合材料可以是天然材料之間的復(fù)合或人工合成材料之間的復(fù)合，以可以使兩者之間的交叉復(fù)合。目的只為得到具有我們需要的相關(guān)的支架材料。值得特別提出的是，目前剛起步的納米生物材料。納米技術(shù)在骨移植替代物有納米羥基磷灰石、納米骨漿、納米脫鈣骨基質(zhì)、納米級類骨磷灰石晶體等。納米材料的結(jié)構(gòu)優(yōu)勢在于有大量的界面或自由表面。結(jié)構(gòu)單元之間存在一定的相互作用，互相影響。用納米材料制成的支架其靶向性能和延展性能都具有優(yōu)勢。將納米材料與其他材料復(fù)合能改變材料的力學(xué)性能。若復(fù)合生長因子，可能會大大地提高其作用。將其進行一定的技術(shù)處理或表面修飾，處理后的納米材料或許是最理想的支架材料。

3 人骨髓間充質(zhì)干細胞成軟骨的定向誘導(dǎo)

骨髓間充質(zhì)干細胞分化為軟骨細胞受到多種復(fù)雜因素的影響和調(diào)控，其中很多機制目前還不清楚。體外培養(yǎng)條件下需要控制細胞生活條件，選擇合適的細胞因子，盡量模擬人體內(nèi)成軟骨環(huán)境，構(gòu)建成熟的定向分化系統(tǒng)。骨髓間充質(zhì)干細胞向軟骨細胞誘導(dǎo)方法包括體外高密度微團培養(yǎng)、體外單層細胞培養(yǎng)、體外三維支架環(huán)境誘導(dǎo)、與軟骨細胞體外共培養(yǎng)誘導(dǎo)劑基因轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)等。Noble等[28]于1995年首次成功地誘導(dǎo)了間充質(zhì)干細胞向單一的軟骨細胞分化。隨后的大量研究也證實了骨髓間充質(zhì)干細胞的體內(nèi)體外成軟骨能力[29]。間充質(zhì)干細胞具有多向分化潛能，在人工培養(yǎng)條件下如果不添加細胞因子，會發(fā)生自然分化[30]，出現(xiàn)增殖能力下降，失去原有典型長梭形形態(tài)，向多分支和多角形發(fā)展。轉(zhuǎn)化生長因子-β1對多種細胞的生長和分化都起作用。很早就有實驗證實轉(zhuǎn)化生長因子-β1可以誘導(dǎo)間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化為軟骨細胞,轉(zhuǎn)化生長因子-β1具有促進軟骨細胞增殖、調(diào)節(jié)其分化和胞外基質(zhì)合成的能力,轉(zhuǎn)化生長因子-β1和其他多種生長因子有協(xié)同作用。骨髓間充質(zhì)干細胞在向軟骨細胞分化的過程中，隨著基因的激活，會合成軟骨細胞特有蛋白質(zhì)產(chǎn)物。其中的Ⅱ型膠原和糖胺多糖是細胞外基質(zhì)中的主要成分，可以作為鑒定軟骨細胞的標志物。生長分化因子5是近年發(fā)現(xiàn)的一種生長因子，屬骨形態(tài)發(fā)生蛋白家族成員，也是轉(zhuǎn)化生長因子超家族一員，也稱為軟骨源性形態(tài)發(fā)生蛋白1。它能影響到生長板軟骨細胞肥大時期的長短，從而影響到內(nèi)生軟骨的生長速度。它通過上調(diào)縫隙連接蛋白Cx43的表達來促進人骨髓間充質(zhì)干細胞微團向軟骨定向分化。這在早期骨骼發(fā)育和關(guān)節(jié)形成與發(fā)育中發(fā)揮關(guān)鍵的作用。

4 展望

近年來，干細胞和組織工程技術(shù)的不斷發(fā)展，為解決臨床難題帶來曙光。軟骨組織工程已成為國內(nèi)外學(xué)者的研究熱點。將人骨髓間充質(zhì)干細胞復(fù)合自體脫鈣松質(zhì)骨基質(zhì)，成軟骨誘導(dǎo)促進軟骨缺損的修復(fù)，因其良好的免疫學(xué)性能，值得今后更深入地研究。然而，軟骨組織工程技術(shù)并不完美，在進入臨床應(yīng)用以前還有很多問題等待解決，例如支架容易脫落，細胞在體內(nèi)免疫性狀的改變以及致瘤性的問題。都還需要進一步理解參與軟骨再生的各種因素及其影響因子，同時還要在標準化動物模型研究中衡量積極因素和可能的有害影響。不過，相信隨著對軟骨組織工程研究的深入，大量實驗研究及臨床工作，必將進一步推動軟骨組織工程由動物試驗階段向臨床試驗階段過渡，并最終成功應(yīng)用于臨床。

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R681.3

A

1003—6350（2014）01—0058—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.01.0021

2013-06-26)

海南省自然科學(xué)基金項目（編號：309107）

金旭紅。E-mail：jxh53@sina.com