田俊波，董自強，曾 文，梁 云

(三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，湖北 宜昌 443003)

膀胱癌DNA甲基化的研究進展

田俊波，董自強，曾 文，梁 云

(三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，湖北 宜昌 443003)

在惡性腫瘤中，相關(guān)的癌基因或抑癌基因由于異常的甲基化導(dǎo)致了其表達的升高或降低這一生物學(xué)改變普遍存在。膀胱癌作為泌尿系統(tǒng)腫瘤中死亡率和復(fù)發(fā)率很高的惡性腫瘤，其相關(guān)基因的甲基化狀況也是很多學(xué)者研究的熱點，本文將就其相關(guān)研究進展做一綜述。

膀胱癌；DNA甲基化；惡性腫瘤

DNA甲基化（DNA methylation）是一種表觀遺傳修飾，該種修飾影響著DNA和其他分子的相互作用，并且通過細胞分裂和增殖遺傳。它在胚胎的早期發(fā)育、干細胞的分化和特定組織的基因表達起著重要的作用[1]。越來越多的研究表明，DNA甲基化異常在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色。膀胱癌是泌尿系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤，因此，DNA甲基化與膀胱癌的研究成為了近年來的研究重點。

1 DNA甲基化的生物學(xué)特點

DNA甲基化即CPG雙核苷酸上胞嘧啶的第五位碳原子經(jīng)DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶作用轉(zhuǎn)變?yōu)?-甲基胞嘧啶。在真核DNA中，5-甲基胞嘧啶是一種很常見的堿基修飾，而且在CPG雙核苷酸序列上包含了90%的甲基化位點[2]。在人類基因組轉(zhuǎn)錄區(qū)，CpG相互聚集，稱為CpG島(CpG islands)。CpG島一般至少長為0.5 kb，其中富含G:C和CpG內(nèi)容，并且發(fā)現(xiàn)了大約70%的人類基因啟動子[3]。在正常細胞和腫瘤細胞中其基因的CPG島甲基化狀況絕然不同，前者幾乎大部分處于非甲基化狀態(tài)，后者則常表現(xiàn)為異常甲基化。DNA甲基化模式以發(fā)育階段和細胞分化為特征，也本質(zhì)的與多發(fā)病變相關(guān)聯(lián)，已經(jīng)成為了惡性腫瘤發(fā)生的一個標(biāo)志[4]。

2 膀胱癌與DNA甲基化的關(guān)系

在腫瘤的形成過程中常常伴有DNA異常甲基化的改變，一般分為CpG島DNA高甲基化和全基因水平DNA低甲基化這兩種狀況[5]。很多基因的CpG島異常甲基化伴隨著膀胱癌的發(fā)生發(fā)展，在膀胱癌的組織標(biāo)本、膀胱癌細胞系、患者尿液標(biāo)本中檢測多種基因的異常甲基化。

3 相關(guān)DNA甲基化與膀胱癌發(fā)生的機制研究

3.1 人類RUNT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子3(Human runt-related transcription factor 3，RUNX3)RUNX3是RUNX基因家族成員之一，它定位于人染色體1號斷臂1p36，具有很強的腫瘤抑制活性，并且參與了上皮細胞增殖和細胞凋亡的調(diào)控，目前在很多人類的實體腫瘤中發(fā)現(xiàn)了RUNX3基因失活的狀況。在轉(zhuǎn)化因子TGF-β信號傳導(dǎo)過程中，RUNX3起著至關(guān)重要的作用，TGF-β主要調(diào)控細胞周期的G1期，減弱TGF-β的敏感性能引起與細胞凋亡相關(guān)的生長停滯[6]。Jeong等[7]研究觀察到，在非肌層浸潤性膀胱癌(Non-muscle invasive bladder cancer，NMIBC)患者中，RUNX3啟動子甲基化發(fā)生在腫瘤樣本中的比率是69%，而在其鄰近的正常膀胱上皮中是47%。Kaplan-Meier評估分析在NMIBC患者中，正常鄰近膀胱上皮RUNX3基因甲基化與病程進展呈時間顯著相關(guān)(P=0.017)。提示RUNX3基因參與了膀胱癌的發(fā)生發(fā)展，RUNX3啟動子甲基化狀況有望成為膀胱癌預(yù)后的生物標(biāo)記。

3.2 死亡相關(guān)蛋白激酶1(Death-associated protein kinase-1，DAPK)DAPK是一種依賴鈣調(diào)蛋白調(diào)節(jié)的蛋白激酶，位于人染色體9q34，是一種正性調(diào)節(jié)細胞凋亡的基因，其低表達或缺失是參與細胞癌變的重要機制之一。Zbigniew等[8]用MSP法在膀胱原位癌標(biāo)本中有64.3%(27/42)檢測到了DAPK的異常甲基化，而在其對照組患者的血清樣本中并未發(fā)現(xiàn)DAPK的甲基化。同時，DAPK基因的高甲基化在膀胱癌G1期患者比率為71.4%，處于G2、G3期患者的比率為55%，提示DAPK基因的高甲基化與病理分級分期具有顯著差異且相關(guān)。

3.3 長散在重復(fù)序列1(Long interspersed nuclear elements1，LINE1) LINE1是一種分布在人類基因組中的內(nèi)源性的易變基因序列，它占據(jù)整個人類基因組的5%，其具備核酸內(nèi)切酶和反轉(zhuǎn)錄酶的活性。LINE1啟動子區(qū)低甲基化能引起其反轉(zhuǎn)錄活性激活導(dǎo)致抑癌基因的失活，進而引起腫瘤的發(fā)生，這一現(xiàn)象在與結(jié)腸癌發(fā)生相關(guān)的抑癌基因APC中很常見[9]。LINE1序列的低甲基化現(xiàn)象出現(xiàn)在多種腫瘤中，包括前列腺癌、結(jié)腸癌、膀胱上皮癌、卵巢癌、惡性生殖細胞瘤、宮頸癌。因此LINE1基因的低甲基化可以作為腫瘤診斷的標(biāo)記物[10]。Wilhelm等[11]通過對不同年齡和不同吸煙狀況的465例對照組和285例膀胱癌患者的外周血提取基因LINE1的甲基化水平進行PCR檢測，并根據(jù)LINE1甲基化水平分組對比，發(fā)現(xiàn)LINE1低甲基化組相對于高甲基化組，患膀胱癌的概率提高了2.08倍，提示LINE1基因的低甲基化與膀胱癌的發(fā)生相關(guān)。

3.4 RAS相關(guān)區(qū)域家族1基因(RASSF1A)作為眾所周知的Ras相關(guān)結(jié)構(gòu)域家族基因1的A型異構(gòu)體，RASSF1A是一種抑癌基因，它處于人染色體3p21。腫瘤發(fā)生過程與RASSF1A密切相關(guān)，一般是由于其啟動子區(qū)的CpG島發(fā)生高甲基化引起了基因的低表達，導(dǎo)致了RAS抑制效應(yīng)低下[12]。RASSF1A的甲基化已經(jīng)在許多人類的實體瘤中被發(fā)現(xiàn)，其發(fā)生頻率波動在30%～50%。在Gao等[13]的研究中，為證實RASSF1A的甲基化對于膀胱癌患者的診斷意義，他們對10個研究組中包含了543例患者和217例對照者的樣本進行了元分析，發(fā)現(xiàn)在尿液和腫瘤組織中檢測到的RASSF1A的甲基化對于膀胱癌來說是一個潛在的危險因素，而且在膀胱癌患者患者中RASSF1A的甲基化的概率是對照組的8.4倍。

3.5 P16、P15、P14抑癌基因 這3個基因是定位于人染色體9p21區(qū)的抑癌基因，其編碼蛋白產(chǎn)物通過激活Rb和P53蛋白產(chǎn)物從而抑制細胞周期從G1期向S期過渡或者直接引起細胞凋亡，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用[14]，所以這3個基因的異常甲基化也與膀胱癌的多發(fā)有著很高的相關(guān)性。在Kawamoto等[15]用MSP法對65例患者(其中45例膀胱癌患者和19例膀胱癌復(fù)發(fā)患者)的原發(fā)腫瘤和復(fù)發(fā)腫瘤組織的P16、P14基因的甲基化水平進行檢測發(fā)現(xiàn)，這兩個基因的甲基化比率分別為17.8%和31.1%，而且相對于表淺性膀胱癌，侵入性膀胱癌的甲基化程度更高，經(jīng)過生存分析顯示P14基因甲基化與患者預(yù)后密切相關(guān)。Chen等[16]通過對臺灣(104例)、香港(82例)、北京(24例)膀胱癌患者的腫瘤組織用MSP法進行p14、p15等一些抑癌基因的甲基化檢測發(fā)現(xiàn)其甲基化比率分別是61.8%(P14)、24.5(P15)、87.5%(P14)，很好地顯示了這些抑癌基因甲基化與膀胱癌的相關(guān)性。

3.6 Wnt抑制因子1(WIF-1)Wnt信號通路在人類早期發(fā)育、疾病以及惡性腫瘤的發(fā)生中扮演著重要角色，而WIF-1是一種能與Wnt蛋白結(jié)合而抑制Wnt信號通路的分泌型蛋白拮抗劑，已有研究報道表明WIF-1的表達下調(diào)與其啟動子的高甲基化與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[17]。Urakami等[18]用MSP法檢測到在膀胱腫瘤組織中WIF-1基因CpG島啟動子甲基化比率比膀胱周圍黏膜更高，WIF-1甲基化和WIF-1的mRNA的表達呈負相關(guān)。

4 DNA甲基化與膀胱癌的診斷

尿路細胞學(xué)檢查以及膀胱鏡是目前應(yīng)用于膀胱癌檢查的最普遍的方法，然而由于尿路細胞學(xué)檢查敏感性差、膀胱鏡檢查價格高、有侵入性等缺點，使得它們不能很好的作為一種普查手段。當(dāng)前，基于PCR技術(shù)的DNA甲基化檢測法逐漸成熟，將其應(yīng)用于DNA甲基化的檢測已經(jīng)越來越多。Reinert等[19]應(yīng)用RT-PCR技術(shù)對184例非浸潤性膀胱癌患者的390份尿沉渣細胞的EOMES、HOXA9、POU4F2、TWIST1、VIM and ZNF154基因甲基化水平檢測，其敏感性在90%左右，特異度在50%左右，該檢測由于只需要患者尿液樣本，易收集無創(chuàng)傷，十分可取。

5 DNA甲基化應(yīng)用于膀胱癌的治療

一些腫瘤的抑癌基因或者癌基因的啟動子區(qū)或調(diào)節(jié)區(qū)發(fā)生了甲基化而失活，從而引起腫瘤的發(fā)生，如果DNA的甲基化能被逆轉(zhuǎn)，這些基因便可重新表達。目前眾所周知的DNA甲基化抑制劑是5-氮胞苷和5-氮-2'脫氧胞苷(5-Aza-CdR)，它們的主要靶點是甲基化轉(zhuǎn)移酶，通過抑制該酶的活性，使目的基因的甲基化程度隨著細胞分裂周期進行性的減少[20]。Christine B Yoo等[21]對膀胱癌T24細胞用5-Aza-CdR處理后，發(fā)現(xiàn)5-Aza-CdR不僅抑制了T24的生長，還能夠誘導(dǎo)p16的重新表達。這類去甲基化藥物將在臨床的腫瘤治療中有著廣闊的前景。

6 展望

目前DNA甲基化的機制在表觀遺傳學(xué)中研究比較深入，很多抑癌基因的異常甲基化都參與了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。DNA甲基化具有可逆性，這一點既可以用于診斷，也可用于治療。然而，隨著DNA甲基化與膀胱癌關(guān)系的研究日趨深入，還有很多問題，如能否找到更具敏感性和特異性的甲基化基因？能否發(fā)現(xiàn)更多的藥物來預(yù)防甲基化或者逆轉(zhuǎn)甲基化？若這些問題得以解決，也許能給膀胱癌的診斷、治療和風(fēng)險評估等帶來更好的應(yīng)用前景。

[1]Yim RL,Kwong YL,Wong KY,et al.DNA methylation of tumor suppressive miRNAs in non-Hodgkin's tymphomas[J].Front Genet,2012,3(233):1-8.

[2]郭萬松,楊 波,叢憲玲,等.DNA甲基化與膀胱癌研究進展[J].中國實驗診斷學(xué),2009,13(8):1123-1128.

[3]Kang GH.CpG island hypermethylation in gastric carcinoma and its premalignant lesions[J].The Korean Journal of Pathology,2012, 46(1):1-9.

[4]BarreraV,PeinadoMA.Evaluation of single CpG sites as proxies of CpG island methylation states at the genome scale[J].Nucleic Acids Research,2012,40(22):11490-11498.

[5]Janine GB,Nicole B,Zhenyu Z,et al.Fidelity index determination of DNAmethyltransferases[J].Plos one,2013,8(5):63866.

[6]KoHJ,KimBY,JungCH,et al.DNA methylation of RUNX3 in papillary thyroid cancer[J].Korean J Intern Med,2012,27(4):407-410.

[7]Jeong P,Min BD,Ha YS,et al.RUNX3 methylation in normal surrounding urothelium of patients with non-muscle-invasive bladder cancer:potential role in the prediction of tumor progression[J].Eur J Surg Oncol,2012,38(11):1095-1100.

[8]Jab?onowski Z,Reszka E,Gromadzińska J,et al.Hypermethylation of p16 and DAPK promoter gene regions in patients with non-invasive urinary bladder cancer[J].Arch Med Sci,2011,7(3):512-516.

[9]Schernhammer ES,Giovannuccci E,Kawasaki T,et al.Dietary folate and B vitamins in relation to LINE-1 hypomethylation in colon cancer[J].NIH PublicAccess,2010,59(6):794-799.

[10]Ogino S,Kawasaki T,Nosho K,et al.LINE1 hypomethylation is inversely associated with microsatellite instability and CpG island methylator phenotype in colorectalcancer[J].International journal of cancer,2008,122:2767-2773.

[11]Wilhelm CS,Kelsey KT,Butler R,et al.Implications of LINE1 methylation for bladder cancer risk in women[J].Clin Cancer Res, 2010,16(5):1682-1689.

[12]Shivakumar L,Minna J,Sakamaki T,et al.The RASSF1A tumor suppressor blocks cell cycle progression and inhibits cyclinD1 accumulation[J].Mol Cell Biol,2002,22(12):4309.

[13]Gao TY,Wang SK,He BS,et al.The association of RAS association domain family protein1A(RASSF1A)methylation states and Bladder cancer risk:A systematic review and meta-analysis[J].Plos One,2012,7(11):1-6.

[14]Makoto Endo,Chikashi Kobayashi,Nokitaka Setsu,et al.Prognostic Significance of p14ARF,p15INK4b,and p16INK4a Inactivation in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumors[J].Clinical Cancer Res,2011,17:3771-3782.

[15]Kawamoto K,Enokida H,Gotanda T,et al.p16INK4a and p14ARF methylation as a potential biomarker for human bladder cancer[J]. Biochem Biophys Res Commun,2006,339(3):790-796.

[16]Chen PC,Tsai MH,Yip SKH,et al.Distinct DNA methylation epigenotypes in bladder cancer from different Chinese sub-populations and its implication in cancer detection using voided urine[J].BMC Med Genomics,2011,4:45.

[17]Yang ZY,Wang Y,Fang JS,et al.Downregulation of WIF-1 by hypermethylation in astrocytomas[J].Acta Biochim Biophys Sin, 2010,42(6):418-425.

[18]Urakami S,Shiina H,Enokida H,et al.Epigenetic inactivation of Wnt inhibitory factor-1 plays an important role in bladder cancer through aberrant canonical Wnt/β-catenin signaling pathway[J]. Clinical Cancer Research,2006,12(2):383-391.

[19]Reinert T,Borre M,ChristiansenA,et al.Diagnosis of bladder cancer recurrence based on urinary levels of EOMES,HOXA9, POU4F2,TWIST1,VIM,and ZNF154 Hypermethylation[J].PLoS One,2012,7(10):1-9.

[20]王成祖,張 瑾.DNA甲基化與膀胱癌的研究進展[J].現(xiàn)代醫(yī)學(xué)生物進展,2010,10(16):3178-3180.

[21]YooCB,Jeong SW,Egger G,et al.Delivery of 5-Aza-2'-Deoxycytidine to Cells Using Oligodeoxynucleotides[J].Cancer Research, 2007,67(13):6400-6408.

R737.14

A

1003—6350（2014）02—0228—03

2013-07-10)

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.02.0085

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