武繼偉

何首烏為蓼科多年生草本植物的塊根。一直以來被認為具有益壽延年、延緩衰老之功效，系著名的滋補中藥［1］。研究表明，何首烏中的主要水溶性成分為2，3，5，4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D 葡萄糖苷(2，3，5，4’-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside，THSG，二苯乙烯苷)［2］。2000年藥典將測定THSG化合物的含量作為何首烏及其制劑的質控標準。典靈輝等［3］發(fā)現何首烏的乙酸乙酯提取物能促進大鼠顱骨成骨細胞的增殖，并根據粗提物含量測定結果推測發(fā)揮這種作用的物質基礎可能是THSG。本研究旨在從細胞水平證實THSG對成骨細胞增殖、分化的影響并初步探明其作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 THSG由本實驗室提取，經

HPLC檢測純度＞98%;DMEM培養(yǎng)基、優(yōu)質胎牛血清(Hyclone公司);胰蛋白酶、青霉素G、硫酸慶大霉素(Ameresco公司);MTT試劑、BCA試劑盒(碧云天生物技術研究所);堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性檢測試劑盒(南京生物建成公司出品);Elisa試劑(Invitrogen公司);其余試劑為國產分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 細胞分離、培養(yǎng)與傳代:大鼠成骨細胞按照文獻所述的方法進行分離、培養(yǎng)和傳代［4］，實驗采用第3～4代細胞。將大鼠成骨細胞以5×104個/皿的密度接種于6孔板中，或以2×104個/孔的密度接種于96孔板中，培養(yǎng)板中的細胞隨機分組，進行相應的干預處理。

1.2.2 實驗分組與處理

1.2.2.1 細胞增殖測定:采用 MTT試劑盒檢測細胞增殖活性。待細胞70%～80%融合時，除陰性對照組外，其余各組加入加入不同濃度的 THSG(0.01、0.03、0.1、0.3、1、3 和10 mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，每孔加入20 ml MTT(5 mg/ml)，培養(yǎng)4 h，吸棄培養(yǎng)基，每孔加入二甲亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO)150 μl，振蕩10 min，使甲臢充分溶解，在酶標儀上于490 nm波長測定光密度OD值。OD值大小與活細胞數成正比，細胞存活率以對照組為100%，給藥組的細胞存活率=給藥組的光吸收值(OD)/對照組光吸收值(OD)×100%。

1.2.2.2 細胞ALP活性比測定:于不同濃度二苯乙烯苷干預后第3天檢測ALP活性比，采用PBS液漂洗皿中細胞 3 次，每皿中加入 0.1%TritonX 100 500 μl，置于4℃冰箱內12 h，期間將培養(yǎng)皿中裂解液置于－30℃冰箱中反復凍融3次。依據試劑盒說明書流程，檢測單位體積裂解液中的ALP活性，同時使用BCA試劑盒檢測細胞裂解液中的總蛋白濃度做內參調平，計算每克樣本中ALP的活性。

1.2.2.3 Elisa方法檢測:應用雙抗體夾心酶標免疫分析法測定標本中c-fos和c-jun水平。在包被單抗的微孔中依次加入c-fos/c-jun抗原、生物素化的抗大鼠c-fos/c-jun抗體、HRP標記的親和素，經過徹底洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的c-fos/c-jun呈正相關。用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度(OD值)，計算樣品濃度。給藥組c-fos/c-jun的表達水平=給藥組的光吸收值(OD)/對照組光吸收值(OD)×100%。

1.3 統計學分析 應用SPSS 12.0統計軟件，計量資料以表示，進行one-way ANOVA分析，兩兩比較采用LSD法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 THSG對細胞增殖活性影響 MTT檢測結果顯示:與對照組比較，在濃度0.03～10 mg/ml范圍隨濃度內，隨著THSG濃度的升高，成骨細胞增殖活性明顯增高(P＜0.05 或 ＜0.01)。見圖1。

圖1 THSG對大鼠成骨細胞增殖活性的影響(*P ＜0.05 或#P ＜0.01)

2.2 THSG對細胞ALP表達影響 2組成骨細胞ALP活性比檢測結果顯示:與對照組比較，在濃度0.03～10 mg/ml范圍隨濃度內，隨著THSG濃度的升高，成骨細胞ALP表達顯著上升(P＜0.05或 ＜0.01)。見圖2。

圖2 THSG對大鼠成骨細胞ALP表達的影響(*P ＜0.05 或#P ＜0.01)

2.3 THSG對c-fos和c-jun蛋白表達的影響 經以上處理第3天時，2組細胞c-fos和c-jun表達較對照組明顯增高(P＜0.05或 ＜0.01)。見表1。

表1 THSG對大鼠成骨細胞c-fos和c-jun表達的影響±s

表1 THSG對大鼠成骨細胞c-fos和c-jun表達的影響±s

注:與對照組比較，*P ＜0.05，#P ＜0.01

c-fos 1.00 ±0.15 1.08 ±0.07* 1.20 ±0.15# 1.35 ±0.09#c-jun 1.00 ±0.25 1.10 ±0.03* 1.30 ±0.12# 1.40 ±0.60#

3 討論

多年來，何首烏的研究大多停留在對何首烏粉、制首烏或何首烏粗提物的功效性探究。采用現代醫(yī)學手段，深入研究其主要成分的藥理作用對中藥走向現代化走向世界具有重要意義。

本實驗采用MTT比色法檢測主要水溶性成分THSG對細胞增殖的影響，具有靈敏度高、重復性好等特點。實驗證明，何首烏的THSG在0.03～10 mg/ml的寬廣范圍內有明確的促進成骨細胞增殖的作用，表現出高效、低毒的特點。

堿性磷酸酶ALP是成骨細胞分化的主要特征性酶之一，可以水解有基磷酸酯，提高局部無機磷離子的濃度，促進鈣化的發(fā)生。對ALP活性的檢測是鑒定成骨細胞和評價其功能活性的重要指標之一。本研究顯示，保持較高的ALP活性是THSG體外促進大鼠成骨細胞分化成熟的典型特征之一。

C-fos和c-jun是與細胞增殖相關的原癌基因，是調控細胞分化和發(fā)育的即刻早期基因，亦稱快速反應基因，因在外界因素刺激后迅速表達而得名［5］。C-fos和c-jun在正常情況下大多數細胞內均有低水平的表達。在外來因素刺激下，c-fos和c-jun經過廣泛的修飾加工后跨核膜進入細胞核內，二者通過亮氨酸拉鏈形式1∶1構成異源二聚體或同源二聚體，與靶基因上調節(jié)區(qū)轉錄激活蛋白1(activator protein 1，AP-1)結合位點相結合后影響靶基因表達，與細胞增殖密切相關。本研究中，THSG顯著誘導c-fos和c-jun，可能是其促進增殖和破骨細胞的分化、成熟的機制之一。

1 呂麗爽.何首烏中二苯乙烯苷的研究進展.食品科學，2006，27:608-615.

2 張純，楊少麟.高效液相色譜法測定何首烏中二苯乙烯甙的含量及其穩(wěn)定性考察.中國中藥雜志，1999，24:357-360.

3 典靈輝，程紀倫，陸江贏，等.德慶何首烏提取物對成骨細胞增殖的影響.安徽農業(yè)科學，2012，40:8885-8886.

4 韓娜，王天兵，寇玉輝，等.人工虎骨粉干預大鼠成骨細胞增殖和Ⅰ型膠原的表達.中國組織工程研究，2012，16:201-205.

5 武密山，趙素芝，任立中，等.柚皮苷對乳鼠成骨細胞增殖及c-fos、cjun表達的影響.中國藥理學通報，2011，27:677-681.