李 杰 伍樹松 熊興耀 蘇丁丁* 賀建華*

博落回系罌粟科博落回屬，在我國分布廣泛、資源豐富。其主要生物活性成分為博落回生物堿，均屬異喹啉衍生物類［1］。血根堿(sanguinarine)、白屈菜紅堿(chelerythrine)、原阿片堿(protopine)、別隱品堿(α-allocryptopine)是4種主要的博落回生物堿，在博落回中發(fā)揮主要生理功能［2］。國內(nèi)外研究結(jié)果表明，博落回生物堿能顯著提高早期斷奶仔豬的生長，降低料重比，減少斷奶應(yīng)激反應(yīng)［3-5］;此外，研究發(fā)現(xiàn)飼糧中添加博落回生物堿能顯著提高火雞的生長性能［6］。但在細(xì)胞水平研究博落回生物堿對動(dòng)物生長影響的還很少。為此，本試驗(yàn)旨在通過體外培養(yǎng)豬腸道上皮細(xì)胞(intestinal porcine epithelial cells，IPEC-1)，探討血根堿、白屈菜紅堿、原阿片堿和別隱品堿在不同濃度、不同時(shí)間段對IPEC-1增殖的影響，為博落回生物堿對動(dòng)物生長性能的促進(jìn)作用以及腸道疾病的預(yù)防與治療提供了新的理論依據(jù)和思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株

IPEC-1由中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所動(dòng)物生態(tài)營養(yǎng)健康養(yǎng)殖研究中心惠贈(zèng)。

1.1.2 主要藥品與試劑

血根堿、白屈菜紅堿、原阿片堿、別隱品堿由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)國家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心提純，純度均大于98%［7］。4-甲基偶氮唑鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、胰島素鐵硒傳遞蛋白(ITS)購自Sigma公司。表皮生長因子(EGF)購自Gibco公司。細(xì)胞培養(yǎng)基HAM’S/F-12、胎牛血清(FBS)、杜氏磷酸緩沖液(D-PBS)為Hyclone公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

IPEC-1培養(yǎng)在盛有適量HAM’S/F-12培養(yǎng)基(含5%FBS、1%雙抗、0.1%ITS 和 5 μg/L EGF)的培養(yǎng)皿中，置于二氧化碳培養(yǎng)箱(37℃、5%CO2飽和濕度)內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.2 試驗(yàn)分組

試驗(yàn)分為對照組和試驗(yàn)組，對照組用普通培養(yǎng)基培養(yǎng)，試驗(yàn)組在普通培養(yǎng)基中加入不同濃度(高濃度組分別是 4、2、1、0.5、0.25 μg/mL 的血根堿或白屈菜紅堿，100、50、25μg/mL的原阿片堿或別隱品堿;低濃度組分別是 0.1、0.05、0.025、0.012 5、0.006 25 μg/mL 的血根堿或白屈菜紅堿，25、12.5、6.25、3.125、1.562 5 μg/mL 的原阿片堿或別隱品堿。初期濃度劃分參照以往研究［8］設(shè)定，而后根據(jù)博落回生物堿對IPEC-1的抑制及增殖作用區(qū)分)的博落回生物堿進(jìn)行培養(yǎng)，各組不同濃度梯度均設(shè)8個(gè)重復(fù)。博落回生物堿溶于DMSO之后用培養(yǎng)基稀釋成所需濃度，DMSO在培養(yǎng)基中的終濃度低于0.1%。

1.2.3 MTT 細(xì)胞增殖試驗(yàn)

取對數(shù)生長期的IPEC-1用D-PBS洗滌2次，0.25%胰蛋白酶消化，加入HAM’S/F-12培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，以1×104個(gè)細(xì)胞每孔接種于96孔板內(nèi)，前培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)基，對照組加入普通培養(yǎng)基100μL，試驗(yàn)組加入含不同濃度博落回生物堿的培養(yǎng)基100μL，每組設(shè)8個(gè)重復(fù)孔;繼續(xù)培養(yǎng)12或24 h后，每孔加入5 mg/mL的MTT溶液10μL，4 h后終止培養(yǎng)，每孔加入0.065 4 mol/L鹽酸異丙醇溶液 100μL，吹打后振蕩10 min，用酶聯(lián)免疫檢測儀在570 nm波長處測定各孔吸光值(OD)。細(xì)胞活率計(jì)算公式如下:

細(xì)胞活率(%)={1-［(對照組OD-試驗(yàn)組 OD)/對照組 OD］}×100。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)經(jīng)過Excel進(jìn)行初步處理后，用SPSS 19數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)(SPSS 19，IBM公司，美國)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，所有數(shù)據(jù)均經(jīng)過3次以上重復(fù)試驗(yàn)。顯著性分析采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，使用鄧肯氏法多重比較(Duncan’s Multiple Range test)。P＜0.05 表示為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 高濃度博落回生物堿對IPEC-1增殖的影響

為探討4種博落回生物堿對IPEC-1的毒性影響，本試驗(yàn)首先使用了較高濃度的博落回生物堿處理IPEC-1。不同濃度的血根堿、白屈菜紅堿、原阿片堿、別隱品堿處理IPEC-1 12 h后，通過MTT染色檢測細(xì)胞存活率。結(jié)果如表1、表2所示，高濃度的博落回生物堿能抑制IPEC-1的生長。本研究中，0.25～4 μg/mL 的血根堿、0.25～4 μg/mL的白屈菜紅堿、100μg/mL的原阿片堿或100μg/mL的別隱品堿對IPEC-1的增殖有顯著的抑制作用(P＜0.05)。隨著濃度的降低，這種抑制趨勢隨之減弱，25～50μg/mL的原阿片堿和別隱品堿對IPEC-1的生長無顯著影響(P＞0.05)，且具有一定的上升趨勢。

2.2 低濃度博落回生物堿對IPEC-1增殖的影響

為探討低濃度博落回生物堿對IPEC-1增殖的影響，本試驗(yàn)隨后降低了博落回生物堿的處理濃度。結(jié)果如表3、表4所示，IPEC-1經(jīng)低濃度的血根堿、白屈菜紅堿、原阿片堿或別隱品堿處理12 h后，細(xì)胞數(shù)目增加，其中 0.006 25～0.1 μg/mL 的血根堿、0.006 25～0.1 μg/mL 的白屈菜紅堿、3.125～ 25 μg/mL 的 原 阿 片 堿 或 1.562 5 ～25μg/mL的別隱品堿對IPEC-1增殖具有顯著的促進(jìn)作用(P＜0.05)。隨著博落回生物堿濃度的不斷下降，這種促進(jìn)作用又慢慢減弱，由表3、表4可知，血根堿對IPEC-1增殖的促進(jìn)作用在0.012 5μg/mL時(shí)達(dá)到峰值，白屈菜紅堿、原阿片堿 和 別 隱 品 堿 則 分 別 為 0.025、6.25 和12.5 μg/mL，1.562 5 μg/mL 的 原 阿 片 堿 處 理IPEC-1 12 h對細(xì)胞無顯著影響(P＞0.05)。

表2 高濃度原阿片堿和別隱品堿對IPEC-1增殖(細(xì)胞活率)的影響Table 2 Effects of high concentrations of protopine and allocryptopine on IPEC-1 proliferation(cell viability) %

表3 低濃度血根堿和白屈菜紅堿對IPEC-1增殖(細(xì)胞活率)的影響Table 3 Effects of low concentrations of sanguinarine and chelerythrine on IPEC-1 proliferation(cell viability) %

2.3 延長博落回生物堿處理時(shí)間對 IPEC-1增殖的影響

為探討博落回生物堿促進(jìn)IPEC-1增殖的作用周期，本試驗(yàn)通過延長低濃度博落回生物堿對IPEC-1的作用時(shí)間，觀察其對IPEC-1的影響。結(jié)果如表3、表4所示，IPEC-1細(xì)胞經(jīng)低濃度博落回生物堿處理24 h后，細(xì)胞密度與對照組差異減少，僅0.1μg/mL的白屈菜紅堿、25μg/mL的原阿片堿和25μg/mL的別隱品堿表現(xiàn)出顯著性差異(P＜0.05)，其余各組與對照組相比均無顯著性差異(P＞0.05)。

3 討論

博落回生物堿因其具有抗菌、殺蟲、抗腫瘤、改善肝功能、增強(qiáng)免疫力等多方面的藥理作用而備受關(guān)注［9］，近年來，國內(nèi)外研究表明博落回生物堿還能有效提高動(dòng)物的生長性能。研究發(fā)現(xiàn)，博落回生物堿具有促生長作用的主要原因可能是通過與腸道接觸而發(fā)揮抗菌和抗炎作用［10］，從而降低斷奶仔豬腹瀉率、保障腸道健康。而Lenfeld等［11］研究認(rèn)為，博落回中含有的四苯并菲陡生物堿具有抑制膽堿脂酶活性、刺激唾液分泌、利尿、外周抗腎上腺素解交感作用［12］和通過抑制芳香族氨基酸脫羧酶來調(diào)節(jié)色氨酸-5-羥色胺代謝途徑，而增加飼養(yǎng)動(dòng)物的采食量［13］，這2種作用的結(jié)合是它提高動(dòng)物生長性能的原因。

表4 低濃度原阿片堿和別隱品堿對IPEC-1增殖(細(xì)胞活率)的影響Table 4 Effects of low concentrations of protopine and allocryptopine on IPEC-1 proliferation(cell viability)

本試驗(yàn)通過體外培養(yǎng)IPEC-1，探討了博落回生物堿對在豬腸上皮細(xì)胞增殖的影響，以期為探討博落回生物堿對動(dòng)物生長性能的影響提供新的研究思路。IPEC-1是分離自未吮乳的新生仔豬小腸上皮細(xì)胞，屬于非轉(zhuǎn)化性最初的連續(xù)培養(yǎng)小腸細(xì)胞系，具有典型的豬小腸上皮細(xì)胞特性［14］，而小腸(包括十二指腸、空腸與回腸)是機(jī)體營養(yǎng)物質(zhì)最主要的消化、吸收器官，營養(yǎng)物質(zhì)被分解后通過小腸吸收進(jìn)入血液和淋巴液，進(jìn)而參與機(jī)體代謝［15］。有研究表明，腸上皮細(xì)胞的增殖與腸黏膜重量和絨毛高度的改變有著緊密的聯(lián)系，而小腸絨毛高度的增加是小腸吸收功能增強(qiáng)的重要標(biāo)志［16］。因此，腸上皮細(xì)胞的增殖可以增強(qiáng)小腸的消化、吸收、免疫屏障等功能，并提高應(yīng)對應(yīng)激反應(yīng)的能力，進(jìn)而提高動(dòng)物的生長性能。

研究表明，博落回生物堿能夠?qū)?xì)胞線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核膜等膜性結(jié)構(gòu)造成破壞，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［17］。本研究中，IPEC-1經(jīng)高濃度的博落回生物堿處理后，細(xì)胞活率顯著下降，這在一定程度上印證了博落回生物堿的細(xì)胞毒性。然而，當(dāng)處理濃度降低時(shí)，博落回生物堿不僅未體現(xiàn)出對IPEC-1的毒性作用，反而促進(jìn)了該細(xì)胞的增殖，隨著濃度的進(jìn)一步降低，這種促進(jìn)作用又逐漸減弱。此外，隨著作用時(shí)間的延長，博落回生物堿對IPEC-1增殖的促進(jìn)作用也隨之減弱。這在一定程度上表明，博落回生物堿對IPEC-1可能具有某種營養(yǎng)作用，能參與細(xì)胞的代謝。濃度范圍內(nèi)有顯著的增殖作用，說明其提高動(dòng)物生長性能可能是通過促進(jìn)小腸細(xì)胞增殖分化更新，來增強(qiáng)小腸消化、吸收、免疫屏障和應(yīng)激反應(yīng)等作用的途徑實(shí)現(xiàn)的。

4 結(jié)論

①高濃度的博落回生物堿對IPEC-1的增殖有顯著的抑制作用，其細(xì)胞毒性的濃度分別為血根堿＞0.25 μg/mL，白屈菜紅堿＞0.25 μg/mL，原阿片堿＞100μg/mL，別隱品堿＞100μg/mL。

②低濃度的博落回生物堿對IPEC-1的增殖有顯著的促進(jìn)作用，且具有一定的濃度范圍。其中血根堿、白屈菜紅堿、原阿片堿和別隱品堿濃度分別在 0.012 5、0.025、6.25 和 12.5 μg/mL 時(shí)對IPEC-1增殖的促進(jìn)作用達(dá)到峰值。

③博落回生物堿對IPEC-1的增殖具有一定的作用周期。

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