王 磊,劉修恒,陳 暉,陳志遠(yuǎn),翁小東,邱 濤,劉 林

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院泌尿外科,武漢 430060)

腎臟缺血/再灌注損傷(ischemic and reperfusion injury,IRI)是腎缺血組織在得到血液再灌注后發(fā)生的組織細(xì)胞損傷加重的一種病理現(xiàn)象，是臨床上不可避免的病理過(guò)程之一，有學(xué)者認(rèn)為，腎臟IRI對(duì)移植腎功能的影響要大于人類白細(xì)胞抗原系統(tǒng)配型不合[1]。研究表明，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)/Smads信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在腎臟中非常重要，而Smad-7作為該通路中的內(nèi)源性抑制因子，發(fā)揮著重要作用[2]。目前，關(guān)于臭氧后處理對(duì)大鼠腎臟IRI后Smad-7表達(dá)的影響尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究欲探討臭氧后處理對(duì)腎臟IRI后Smad-7表達(dá)的影響，并進(jìn)一步探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1模型的建立與分組 選取由武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的健康雄性SD大鼠24只，均為8周齡，體質(zhì)量為220～250 g。采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為3組，每組8只。假手術(shù)組：腹腔注射20 g/L戊巴比妥鈉(40 mg/kg)，麻醉大鼠，然后游離雙側(cè)腎臟，切除右腎后縫合腹壁。IRI組：在游離雙側(cè)腎臟及切除右腎后，用無(wú)創(chuàng)傷血管夾夾閉左腎動(dòng)、靜脈45 min制造缺血，然后開(kāi)放血管夾進(jìn)行再灌注24 h，余同假手術(shù)組。腎臟由暗紅色變成鮮紅色代表再灌注成功。臭氧后處理(ozone postconditioning，OP)組：再灌注后10 d內(nèi)，對(duì)該組大鼠經(jīng)直腸吹入氧氣和臭氧的混合氣體2.5～3.0 mL[臭氧濃度為50 mg/L，0.5 mg/(kg·d)][3]，余同缺血/再灌注組。

1.2儀器與試劑 YKS-1000臭氧發(fā)生儀購(gòu)自珠海依科醫(yī)療器械有限公司，Smad-7和β-actin單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。

1.3樣本采集和處理

1.3.1標(biāo)本采集 分別于IRI 24 h后采集大鼠腹腔靜脈血待測(cè)，處死各組大鼠獲取腎臟組織，一部分迅速置于液氮中保存，另一部分用固定液固定后，常規(guī)石蠟包埋。

1.3.2血清尿素氮和肌酐的檢測(cè) 將采集的大鼠血液標(biāo)本常溫離心，獲取大鼠血清，使用Olympus全自動(dòng)生化分析儀(Au2700)測(cè)定血清尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)和肌酐(creatinine,Cr)水平。

1.3.3腎組織病理學(xué)檢查 取大鼠腎組織，用多聚甲醛固定后脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、脫蠟、蘇木精-伊紅染色，之后在400倍光鏡下觀察其病理改變。

1.3.4蛋白免疫印跡法檢測(cè)Smad-7 從-80 ℃冰箱中取出保存后的腎組織，采用BCA(bicinchoninic acid)試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，取20 μg蛋白上樣，用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜，50 g/L脫脂牛奶封閉2 h后加入1∶1000稀釋的Smad-7兔抗大鼠多克隆抗體，4 ℃下?lián)u床過(guò)夜。之后與辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合的羊抗兔抗體(1∶2000稀釋)結(jié)合，洗膜后化學(xué)發(fā)光法顯色、照相，并作灰度值分析。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠血清Cr和BUN水平的比較 假手術(shù)組相比，IRI組的Cr、BUN水平顯著增高；而與IRI組相比，OP組BUN和Cr顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1)。

2.2各組大鼠腎組織學(xué)觀察結(jié)果 光鏡下可見(jiàn)假手術(shù)組的大鼠腎組織結(jié)構(gòu)改變不明顯。而IRI組可見(jiàn)腎小管上皮細(xì)胞刷狀緣消失，上皮細(xì)胞變性、壞死明顯，腎小管腔明顯擴(kuò)張，管腔內(nèi)可見(jiàn)管型。OP組可見(jiàn)上皮細(xì)胞扁平，僅部分刷狀緣消失，部分管腔明顯擴(kuò)張，偶見(jiàn)管型，與IRI組相比組織病理學(xué)改變明顯減輕。

表1 各組大鼠血清Cr、BUN水平的比較

圖1-1 假手術(shù)組 圖1-2 缺血/再灌注組 圖1-3 臭氧后處理組

2.3各組大鼠腎組織Smad-7表達(dá)的比較 根據(jù)灰度值分析可知，與假手術(shù)組相比，IRI組Smad-7的表達(dá)量顯著降低；而與IRI組相比，OP組中Smad-7的表達(dá)明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖2)。

圖2-1 蛋白免疫印跡結(jié)果顯示Smad-7的表達(dá)水平

圖2-2 Smad-7與內(nèi)參的相對(duì)比值

3 討 論

臭氧的醫(yī)療用途開(kāi)始于外科創(chuàng)傷治療，其機(jī)制主要是廣譜殺菌、抗炎、促成局部組織再生，隨后，臭氧的醫(yī)療用途逐步涉及到心血管、內(nèi)分泌、腫瘤等多個(gè)臨床科室[4]。在腎移植中，IRI是影響移植腎存活率的重要因素之一，尤其在再灌注后產(chǎn)生大量的活性氧，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步加重?fù)p害[5]。目前關(guān)于臭氧對(duì)IRI保護(hù)作用的報(bào)道較多，但都集中于預(yù)處理，本團(tuán)隊(duì)的前期研究也已經(jīng)證實(shí)，臭氧預(yù)處理能夠保護(hù)大鼠腎臟IRI，其機(jī)制與減輕脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)、減少炎性因子合成有關(guān)[6]。雖然該方法具有保護(hù)作用，但在實(shí)際臨床工作中，由于組織器官發(fā)生缺血的不可預(yù)見(jiàn)性，使得臭氧預(yù)處理的應(yīng)用受到了很大的限制，而臭氧后處理可以克服這個(gè)困難。Smads蛋白是在細(xì)胞內(nèi)參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的一類蛋白質(zhì)，在新近的研究中發(fā)現(xiàn)其是TGF-β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的下游調(diào)節(jié)因子，其中Smad-7是該信號(hào)通路中最重要的抑制因子[7]，對(duì)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定有積極作用。有研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)停滯、凋亡以及間質(zhì)纖維化，與其細(xì)胞內(nèi)Smad-7負(fù)調(diào)控作用的不足有關(guān)[8]。但也有研究表明該負(fù)調(diào)控作用有缺點(diǎn)，當(dāng)缺乏配體時(shí)，Smad-7主要位于核內(nèi)，而有配體存在時(shí)，Smad-7需轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)中才能與受體結(jié)合發(fā)揮作用，但該調(diào)控機(jī)制反應(yīng)較慢，因此有學(xué)者建議將外源性Smad-7基因轉(zhuǎn)到培養(yǎng)的腎小管細(xì)胞中，來(lái)拮抗TGF-B1誘導(dǎo)的G1停滯，減低細(xì)胞凋亡。目前對(duì)于Smad-7在大鼠腎臟IRI后的表達(dá)情況少有報(bào)道。本研究欲觀察臭氧后處理對(duì)大鼠腎臟IRI損傷后Smad-7表達(dá)情況的影響，并對(duì)其保護(hù)機(jī)制作進(jìn)一步探討。

腎臟IRI損傷的機(jī)制至今尚未完全闡明，主要學(xué)說(shuō)包括氧自由基作用、白細(xì)胞作用、鈣超載、活性因子作用等方面。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，移植腎臟缺血/再灌注后引起的腎細(xì)胞凋亡是IRI的重要原因[9]，在本實(shí)驗(yàn)中，與假手術(shù)組相比，IRI組和OP組的Cr、BUN水平均顯著升高，而OP組能夠明顯減輕因IRI導(dǎo)致的Cr、BUN的上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明臭氧后處理可以改善腎功能。組織病理學(xué)檢查結(jié)果也提示，假手術(shù)組無(wú)明顯改變；IRI組可見(jiàn)腎小管上皮細(xì)胞刷狀緣消失，上皮細(xì)胞變性、壞死明顯，腎小管腔明顯擴(kuò)張，管腔內(nèi)可見(jiàn)管型。而OP組與IRI組相比組織病理學(xué)改變明顯減輕，可見(jiàn)上皮細(xì)胞扁平，僅部分刷狀緣消失，部分管腔明顯擴(kuò)張，偶見(jiàn)管型。蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，假手術(shù)組相比，IRI組的Smad-7的表達(dá)量明顯降低；而OP組可以明顯上調(diào)Smad-7的表達(dá)量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

本研究結(jié)果證明了臭氧后處理能明顯提高腎臟缺血/再灌注組織中Smad-7的表達(dá)，來(lái)發(fā)揮腎臟保護(hù)作用，但是對(duì)于臭氧后處理通過(guò)什么途徑上調(diào)Smad-7的表達(dá)、是否與TGF-β1有關(guān)，需要在今后的研究中進(jìn)一步證實(shí)。

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