王 維 蘇 寧 鐘志敏 彭婭婭 梁廣鐵

廣東省廣州市第一人民醫(yī)院生殖健康與不孕癥專科（510180）

輔助生殖技術(shù)（ART）主要是運(yùn)用醫(yī)學(xué)技術(shù)對卵細(xì)胞、精子、受精卵和胚胎進(jìn)行人工操作，以達(dá)到受孕目的，而早期胚胎的體外培養(yǎng)是該技術(shù)中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)［1］。國內(nèi)外學(xué)者在該領(lǐng)域已經(jīng)進(jìn)行了大量卓有成效的研究，但到目前為止，大多數(shù)研究者都將注意力集中在培養(yǎng)液配方改良上，而忽略了胚胎的培養(yǎng)方法對胚胎體外培養(yǎng)的貢獻(xiàn)。事實(shí)上胚胎在體內(nèi)的發(fā)育環(huán)境是動(dòng)態(tài)的，受精卵從輸卵管壺腹部向子宮腔移動(dòng)，受精卵周圍的化學(xué)環(huán)境和物理環(huán)境也在不斷發(fā)生變化［2－4］。微流控芯片的出現(xiàn)為解決以上問題提供了新的思路至上。微流控芯片技術(shù)是一種以在微米尺度空間內(nèi)對流體進(jìn)行操控為主要特征的科學(xué)技術(shù)，一方面，微流控通道具有與體內(nèi)微血管相似的尺寸，在這個(gè)尺度下流體所具有的層流特性便于實(shí)現(xiàn)精確的流體控制；另一方面，微管道的形狀和尺寸可以靈活設(shè)計(jì)，從而更好地模擬生理環(huán)境，有效模擬組織或器官的結(jié)構(gòu)和功能［5］。前期研究報(bào)導(dǎo)了一系列基于微流控芯片的精子分選、受精以及胚胎發(fā)育等單元操作技術(shù)［6－8］，在這些工作基礎(chǔ)上，本研究旨在設(shè)計(jì)創(chuàng)新一種動(dòng)態(tài)的物理培養(yǎng)系統(tǒng)--微流控培養(yǎng)系統(tǒng)，模擬體內(nèi)動(dòng)態(tài)環(huán)境，以連續(xù)灌流方式實(shí)現(xiàn)胚胎與外界物質(zhì)交換，觀察與檢測胚胎體外發(fā)育情況，以便支持并改善早期胚胎的體外發(fā)育效果。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選擇購自廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心無特定病原菌（SPF級，三級動(dòng)物）6～8周齡體重28～32g的KM雌性小鼠45只、8～10周齡體重35～40g的KM雄性小鼠50只，常規(guī)飼養(yǎng)。

1.1.2 試劑 聚二甲基硅氧烷（PDMS）購自美國Dow Corning公司；SU－8 3025光刻膠購自美國 Microchem公司；孕馬血清促性腺激素（PMSG）、人絨毛膜促性腺激素（hCG）購自杭州動(dòng)物藥品廠；體外受精－胚胎培養(yǎng)所需試劑取卵－胚胎處理液（GMOPS PLUS）、洗精受精液（G－IVF PLUS）、卵裂胚培養(yǎng)液（G－1PLUS）、囊胚培養(yǎng)液（G－2PLUS）、超純培養(yǎng)油（OVOIL）購自瑞典Vitrolife公司。

1.2 微流控芯片的設(shè)計(jì)與構(gòu)建

使用制圖軟件CorelDraw畫出微流控芯片的結(jié)構(gòu)圖，采用軟刻蝕工藝［9］制造如圖1所示的微流控芯片，芯片尺寸為76mm×34mm。整個(gè)微流控芯片系統(tǒng)包含四層結(jié)構(gòu)，基底層為平板玻璃，其余各層為PDMS材質(zhì)。圖2顯示了裝置的三維示意圖?！盎讓印笔且粚硬ＡВ钦麄€(gè)芯片培養(yǎng)系統(tǒng)的基底?！岸ㄎ粚印卑?6個(gè)突起的八扇瓣的受精卵－胚胎定位孔，定位孔是由八個(gè)扇瓣形成開放的圓柱狀結(jié)構(gòu)，直徑為2mm，每個(gè)相鄰扇瓣之間的間隙是50 μm，每個(gè)扇瓣的高度為250μm。第三層為通道層，與微量注射泵相連。受精卵、胚胎培養(yǎng)時(shí)的物質(zhì)交換均在此層實(shí)現(xiàn)。“通道層”包含了培養(yǎng)液入口通道，受精卵－胚胎定位池，廢液出口通道?！绊攲印笔且粚覲DMS蓋板，覆蓋定位池以避免水分的揮發(fā)、防止污染，保持培養(yǎng)環(huán)境的穩(wěn)定。

圖1 微流控芯片示意圖（側(cè)面）

圖2 微流控芯片三維示意圖

1.3 生殖細(xì)胞的準(zhǔn)備和體外受精［10］

1.3.1 精子的準(zhǔn)備 選擇8周齡以上、體重＞35g、雄性特征明顯的雄鼠，頸部脫臼致死，剖開腹部取出附睪及輸精管，置于1ml G－MOPS液中，洗滌組織塊后，移入盛有已平衡過夜的1ml G－IVF PLUS液的培養(yǎng)皿中，將附睪尾剪開數(shù)個(gè)小口，輕輕擠壓使精子擠入G－IVF PLUS受精液，置于37℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中1h，使精子繼續(xù)獲能。將精子懸液整倍稀釋，觀察精子活力和用精子計(jì)數(shù)板計(jì)算精子濃度。

1.3.2 卵母細(xì)胞的收集 選擇6周齡以上、體重＞28g的健康雌鼠，每只雌鼠腹腔注射10UPMSG，間隔48h后再腹腔注射5UhCG。將上述處理的雌鼠于注射hCG后13～17h，頸部脫臼致死，剖開腹部取其輸卵管置于1ml G－MOPS液中，自輸卵管壺腹部取出卵冠丘復(fù)合體（OCCC），將OCCC移入已平衡過夜的G－IVF PLUS受精液的微滴中清洗3遍后，移入250μl G－IVF PLUS受精液滴中，然后放入培養(yǎng)箱等待獲能的精子。

1.3.3 體外受精 獲能結(jié)束后，將精子加入已經(jīng)含有OCCC的G－IVF PLUS受精液滴中，并最終使受精液中精子的濃度為0.5×106～1×106／ml，置于37℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中受精5～6h。

1.3.4 受精率的檢測 受精結(jié)束后，用撿卵針將卵子移入預(yù)熱的G－MOPS液滴中，并輕輕吹打以洗掉透明帶上粘附的精子，反復(fù)洗3～5次后，將卵子移入G－1PLUS培養(yǎng)液滴中，觀察卵子雌雄原核來評價(jià)是否受精，并分離具有雌雄原核的受精卵備用。

1.4 微流控培養(yǎng)系統(tǒng)與微滴培養(yǎng)方法對照實(shí)驗(yàn)

1.4.1 對照組實(shí)驗(yàn)（常規(guī)微滴培養(yǎng)法） 在進(jìn)行早期培養(yǎng)的前一天晚上，將G－1PLUS培養(yǎng)液在直徑為35mm的培養(yǎng)皿上做成20μl的小滴，用石蠟油覆蓋，置于37℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中平衡過夜。早期培養(yǎng)時(shí)，首先用3個(gè)預(yù)平衡的培養(yǎng)液滴清洗受精卵3遍，然后將受精卵移入剩余的液滴，每個(gè)液滴放10個(gè)受精卵，將培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱（37℃、飽和濕度、5%CO2）進(jìn)行培養(yǎng)，每24h更換一次培養(yǎng)液。培養(yǎng)72h后將＞8細(xì)胞的胚胎移至G－2PLUS囊胚培養(yǎng)液中，操作同前。分別在培養(yǎng)24、48、72和96h后觀察記錄胚胎的發(fā)育情況。

1.4.2 微流控芯片裝置上胚胎培養(yǎng) 芯片和聚四氟乙烯毛細(xì)管在使用之前80℃烘烤1h，微量注射器在75%酒精中浸泡6h后用滅菌蒸餾水沖3次。移卵前夜，整個(gè)微流控芯片裝置放入150mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，以高壓滅菌水覆蓋（121℃，15min高壓），紫外照射30min左右，放入培養(yǎng)箱（37℃、飽和濕度、5%CO2）中平衡過夜。移卵前，微流控芯片裝置用G－IVF液預(yù)處理，以改善親水性。使用時(shí)在超凈工作臺(tái)上將芯片與注射器通過毛細(xì)管連接。然后用G－1PLUS培養(yǎng)液清洗一遍，再加入G－1PLUS培養(yǎng)液使其充滿管道。用微量移液器吸取體外受精獲得的受精卵，加入定位單元，盡量保證每個(gè)單元中僅有一個(gè)受精卵。定位完成后裝置以PDMS蓋板覆蓋，放入培養(yǎng)箱（37℃、飽和濕度、5%CO2）中培養(yǎng)。微量注射泵抽取1ml G－1PLUS培養(yǎng)液，以一定的速度持續(xù)灌流。培養(yǎng)72h后，換取1ml G－2 PLUS培養(yǎng)液繼續(xù)灌流。實(shí)驗(yàn)期間，分別在培養(yǎng)24 h、48h、72h和96h后觀察記錄胚胎的發(fā)育情況。

1.4.3 微流控培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)液流速的優(yōu)化 以5、10、20和30μl／h四種不同流速作為試驗(yàn)流速，并分別以這四種流速對小鼠的受精卵進(jìn)行體外培養(yǎng)，以囊胚出現(xiàn)比率為檢測目標(biāo)，對培養(yǎng)效果進(jìn)行觀察和比較，來評估培養(yǎng)液流速對胚胎發(fā)育的影響。每組培養(yǎng)縱向重復(fù)3次，取平均值參與最終比較。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，微流控培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)液不同流速獲得囊胚數(shù)之間的比較采用單因素方差分析，兩種培養(yǎng)系統(tǒng)獲得的各種胚胎發(fā)育率之間的比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 微流控培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)液流速的優(yōu)化

4種不同流速各培養(yǎng)48個(gè)小鼠受精卵，由表1可知，流速為10μl／h時(shí)對胚胎的培養(yǎng)效果最好，培養(yǎng)96h后獲得的囊胚率最高，與其他3種流速比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。后期試驗(yàn)采取的流速為10μl／h。

表1 不同流速對小鼠體外受精胚胎發(fā)育的影響（培養(yǎng)96h）

2.2 微流控培養(yǎng)系統(tǒng)與微滴培養(yǎng)法對小鼠體外受精胚胎發(fā)育的比較

由表2可見，受精卵在微流控培養(yǎng)系統(tǒng)2～4細(xì)胞發(fā)育率與微滴培養(yǎng)系統(tǒng)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝1.021，P＞0.05）。而微流控培養(yǎng)系統(tǒng)與微滴培養(yǎng)系統(tǒng)的5～8細(xì)胞發(fā)育率、桑葚胚發(fā)育率和囊胚發(fā)育率相比，各級胚胎的發(fā)育均有顯著改善，兩組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝5.141，P＜0.05；χ2＝4.325，P＜0.05；χ2＝5.519，P＜0.05）。

表2 不同培養(yǎng)方法對胚胎發(fā)育的影響

3 討論

胚胎質(zhì)量是影響人類ART成功率的一個(gè)重要因素，而對其起關(guān)鍵性作用的是胚胎體外培養(yǎng)條件，包括培養(yǎng)液成分和培養(yǎng)體系。根據(jù)胚胎不同發(fā)育時(shí)期對營養(yǎng)成分的不同需求，序貫培養(yǎng)系統(tǒng)的發(fā)明有效地彌補(bǔ)了單一培養(yǎng)液的不足，使獲得高質(zhì)量囊胚進(jìn)行移植成為現(xiàn)實(shí)，無疑在很大程度上提高了ART的成功率。然而，物理微環(huán)境也可能是影響體外胚胎發(fā)育的重要因素，但往往易被人們忽略。胚胎之所以能在體內(nèi)很好發(fā)育主要原因在于保證其正常發(fā)育的環(huán)境是一個(gè)既能合理提供營養(yǎng)又能及時(shí)清理廢物的動(dòng)態(tài)培養(yǎng)環(huán)境［11］。隨著胚胎的體外培養(yǎng)系統(tǒng)的發(fā)展，模擬體內(nèi)著床前胚胎經(jīng)歷的機(jī)械性的和生化的環(huán)境，將能夠提高對調(diào)節(jié)正常胚胎生長發(fā)育機(jī)制的理解，也可能改善實(shí)驗(yàn)室內(nèi)體外培養(yǎng)的胚胎發(fā)育潛能［12］。早在1973年，Hoppe等［13］就探討了培養(yǎng)箱中連接搖動(dòng)器產(chǎn)生的物理刺激對小鼠卵母細(xì)胞受精的影響，結(jié)果表明，培養(yǎng)液體積及搖動(dòng)時(shí)間對受精率并無顯著影響。2010年，Matsuura等［14］探討了傾斜胚胎培養(yǎng)系統(tǒng)（TECS）對小鼠胚胎培養(yǎng)的影響，發(fā)現(xiàn)在特定的培養(yǎng)條件下，TECS可顯著提高小鼠胚胎發(fā)育潛能。Cabrera等［15］首次將微流體裝置用于培養(yǎng)小鼠1－細(xì)胞胚胎，其孵化囊胚數(shù)和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)數(shù)均顯著高于靜置培養(yǎng)體系，且與體內(nèi)來源的囊胚相似。此外，也有報(bào)道表明，微流體培養(yǎng)體系不僅有利于小鼠植入前胚胎發(fā)育，而且提高了胚胎的種植率和繼續(xù)妊娠率，有效降低了流產(chǎn)率［16］。

本研究為了模擬體內(nèi)輸卵管的結(jié)構(gòu)和功能，設(shè)計(jì)的多層微流控芯片培養(yǎng)系統(tǒng)，其特色在于以帶有微間隙的微柱狀定位孔支撐胚胎的發(fā)育，定位孔藉由間隙與灌注培養(yǎng)液進(jìn)行物質(zhì)交換，避免了流體剪切力對胚胎的損害，通過自動(dòng)控制培養(yǎng)液灌流速度，在一個(gè)密閉的環(huán)境中補(bǔ)充培養(yǎng)液而無需在培養(yǎng)箱外操作，避免了胚胎應(yīng)激，為胚胎提供一個(gè)穩(wěn)定的梯度培養(yǎng)環(huán)境。同時(shí)及時(shí)排除代謝產(chǎn)物，消除代謝物蓄積對胚胎生長發(fā)育的不利影響，有效模擬了輸卵管的內(nèi)部微環(huán)境。通過本試驗(yàn)研究顯示，培養(yǎng)液灌流速度對胚胎培養(yǎng)效果影響顯著。在培養(yǎng)液流速為10μl／h時(shí)，能夠較好地支持小鼠受精卵發(fā)育到囊胚。分析原因可能是：胚胎之間可能分泌一些相互促進(jìn)彼此發(fā)育的物質(zhì)，流速過快使這種促進(jìn)物質(zhì)損失，有可能影響胚胎的發(fā)育的代謝平衡，同時(shí)當(dāng)流速太快時(shí)，胚胎受到液體剪切力的影響，可能抑制了胚胎的發(fā)育。當(dāng)流速太低時(shí)，由于芯片材料PDMS具有透氣性，培養(yǎng)孔內(nèi)液體蒸發(fā)相對較快，影響胚胎發(fā)育微環(huán)境的滲透壓導(dǎo)致胚胎發(fā)育不良。只有在合適的流速時(shí)不會(huì)對胚胎群發(fā)育過程中建立的微環(huán)境造成太大的沖擊，因而獲得較好的培養(yǎng)效果。

試驗(yàn)比較了微流控動(dòng)態(tài)培養(yǎng)系統(tǒng)與傳統(tǒng)微滴靜態(tài)培養(yǎng)方法獲得的2～4細(xì)胞發(fā)育率、5～8細(xì)胞發(fā)育率、桑葚胚發(fā)育率和囊胚形成率，這些指標(biāo)動(dòng)態(tài)地反映了體外受精卵胚胎的發(fā)育狀況。結(jié)果顯示，雖然兩組的2～4細(xì)胞發(fā)育率大致相當(dāng)，但在胚胎逐漸發(fā)育的過程中體現(xiàn)出明顯差異，微流控培養(yǎng)系統(tǒng)5～8細(xì)胞發(fā)育率、桑葚胚發(fā)育率和囊胚形成率均明顯高于對照組微滴培養(yǎng)組。相對于常規(guī)培養(yǎng)方法，本研究發(fā)展的微流控動(dòng)態(tài)培養(yǎng)系統(tǒng)更有利于提高胚胎的發(fā)育潛能，分析其原因可能為：微滴法培養(yǎng)情況下，液滴中胚胎和培養(yǎng)液處于相對靜止?fàn)顟B(tài)，隨著胚胎代謝活動(dòng)的逐漸增強(qiáng)，各類代謝產(chǎn)物的累積速度不同，胚胎毒性物質(zhì)的積累或營養(yǎng)物質(zhì)的消耗等，阻礙了胚胎的發(fā)育。而微流控芯片動(dòng)態(tài)培養(yǎng)可能打破了胚胎局部的環(huán)境梯度，清除胚胎生長過程中有害產(chǎn)物，補(bǔ)充營養(yǎng)物質(zhì)，對胚胎上的機(jī)械受體提供物理刺激激活營養(yǎng)信號通路等，或者是以上多種因素的綜合作用，促進(jìn)了體外受精卵胚胎的發(fā)育。

綜上所述，胚胎培養(yǎng)過程中的物理微環(huán)境會(huì)影響胚胎質(zhì)量。本研究發(fā)展了一種基于微流控芯片的胚胎動(dòng)態(tài)培養(yǎng)方法，通過控制液體的流動(dòng)達(dá)到更換和調(diào)整培養(yǎng)液，并把胚胎培養(yǎng)的空間盡可能控制在一個(gè)較小區(qū)域，模擬體內(nèi)胚胎輸卵管的機(jī)械和生化環(huán)境實(shí)現(xiàn)了胚胎的動(dòng)態(tài)培養(yǎng)。這種方法能有效提高胚胎的發(fā)育潛能，成為一種新的人類胚胎體外培養(yǎng)的有力工具。在以后的研究中可嘗試連接納米傳感器或探針對培養(yǎng)液或胚胎進(jìn)行在線診斷，如監(jiān)測液體的pH值、溫度波動(dòng)、液體流速及細(xì)胞的體積，以便實(shí)時(shí)監(jiān)控液體滲透壓變化。通過傳感器監(jiān)測，獲得胚胎在發(fā)育過程中需要哪些營養(yǎng)成分的信息，然后根據(jù)胚胎的不同需要選擇特殊的培養(yǎng)基或添加特定的因子，從而設(shè)計(jì)出針對不同胚胎需求的“個(gè)性化”培養(yǎng)基，選擇發(fā)育潛能最高的胚胎進(jìn)行移植，從而提高體外受精－胚胎移植的成功率，改善妊娠結(jié)局。

［1］ 盧惠琳，盧光琇.人類生殖與生殖工程［M］.鄭州：河南科學(xué)技術(shù)出版社出版，2001：98.

［2］ Fauci LJ，Dillon R.Biofluidmechanics of reproduction［J］.Annu Rev Fluid Mech，2006，38（1）：371－394.

［3］ Hardy K，Spanos S.Growth factor expression and function in the human and mouse preimplantation embryo［J］.J Endocrinol 2002，172：221－236.

［4］ Leese HJ，Tay JI，Reischl J，et al.Formation of Fallopian tubal fluid：role of a neglected epithelium［J］.Reproduction，2001，121：339－346.

［5］ Gary D.Smith GD，Shuichi Takayama，et al.Rethinking In Vitro Embryo Culture：New Developments in Culture Platforms and Potential to Improve Assisted Reproductive Technologies［J］.Biol Reprod，2012，86（3）：62，1－10.

［6］ 王維，黎維生，彭婭婭，等.微流控芯片在精子分選中的應(yīng)用［J］.中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2009，32（8）：920－923.

［7］ 王維，梁廣鐵，彭婭婭，等.微流控芯片精子分選法對精子常規(guī)參數(shù)及DNA完整性的影響［J］.中華男科學(xué)雜志，2011，17（4）：301－304.

［8］ 李偉萱，梁廣鐵，嚴(yán)偉，等.微流控芯片子宮［J］.分析化學(xué)，2013，41（4）：467－472.

［9］ 林炳承，秦建華.圖解微流控芯片實(shí)驗(yàn)室［M］.北京：科學(xué)出版社，2008：145－180.

［10］ 納吉.小鼠胚胎操作實(shí)驗(yàn)手冊［M］.孫青原，陳大元譯.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2006：411－425.

［11］ Swain JE，Smith GD.Advances in embryo culture platforms：novel approaches to improve preimplantation embryo development through modifications of the microenvironment［J］.Hum Reprod Update，2011，17（4）：541－557.

［12］ Perin PM，Maluf M，Januario D，et al.Comparison of the efficacy of two commercially available media for culturing one－cell embryos in the in vitro fertilization mouse model［J］.Fertil Steril，2008，90：1503－1510.

［13］ Hoppe PC，Pitts S.Fertilization in vitro and development of mouse ova［J］.Biol Reprod，1973，8（4）：420－426.

［14］ Matsuura K，Hayashi N，Kuroda Y，et al.Improved development of mouse and human embryos using a tilting embryo culture system［J］.Reprod Biomed Online，2010，20（3）：358－364.

［15］ Cabrera L，Heo Y，Ding J，et al.Improved blastocyst development with microfluidics and braille pin actuator enabled dynamic culture［J］.Fertil Steril，2006，87（3）：S43.

［16］ Heo YS，Cabrera LM，Bormann CL，et al.Dynamic microfunnel culture enhances mouse embryo development and pregnancy rates［J］.Hum Reprod，2010，25（3）：613－622.