鄭煒煒 宋 革 鐘小英 張清健 祝曉麗 譚玉梅 姜榮華

廣東省計劃生育科學(xué)技術(shù)研究所，廣東省計劃生育?？漆t(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心（廣州，510060）

供精人工授精（AID）是通過非性交方式將供者精液置于女性生殖道內(nèi)，以期精子與卵母細(xì)胞自然結(jié)合，達(dá)到妊娠目的而采取的一種輔助生殖技術(shù)。隨著精子冷凍技術(shù)的日益成熟，人類精子庫的相繼成立，AID技術(shù)得以廣泛應(yīng)用。該項技術(shù)在給人們帶來福音的同時也帶來了挑戰(zhàn)，其安全性值得關(guān)注。本研究通過對2007年4月～2013年4月在本中心實施AID助孕者的臨床資料進(jìn)行總結(jié)分析，探討冷凍精液凍存時間對AID結(jié)局及子代安全性的影響。

1 資料與方法

1.1 對象與分組

2007年4月～2013年4月在廣東省計劃生育?？漆t(yī)院實施AID助孕的6038對夫婦共14290個AID周期的臨床資料。女方年齡20～45（29.59±4.06）歲，不孕年限1～22（4.96±3.14）年。全部病例符合國家衛(wèi)生計生委關(guān)于輔助生殖技術(shù)規(guī)范的要求，具備AID適應(yīng)證，排除禁忌證后實施AID治療。按供精精液凍存時間分為0.5～1年，＞1～3年，＞3～5年，＞5～7年和＞7～10年5組。

1.2 精液來源和質(zhì)量控制

精液來源于廣東省計劃生育?？漆t(yī)院人類精子庫和浙江省計劃生育研究所人類精子庫。精液冷凍儲存時間為0.5～10年，選擇宮頸內(nèi)人工授精（ICI）術(shù)式時前向運動精子總數(shù)≥20×106，選擇宮腔內(nèi)人工授精（IUI）術(shù)式時前向運動精子總數(shù)≥10×106。若精液處理后不達(dá)標(biāo)則需重新追加供精標(biāo)本。

1.3 卵泡監(jiān)測和AID手術(shù)時機

采用陰道超聲診斷儀（Aloka－SSD1400）連續(xù)監(jiān)測卵泡發(fā)育和子宮內(nèi)膜情況，結(jié)合尿黃體生成素（LH）、宮頸黏液，以及性激素測定等方法確定排卵時間，選擇授精時機。月經(jīng)規(guī)則，排卵正常者行自然周期人工授精；卵泡發(fā)育不良、排卵障礙或多個自然周期助孕失敗者使用個體化的方案誘導(dǎo)排卵，藥物包括氯米芬、他莫昔芬、來曲唑、人絕經(jīng)期促性腺激素、卵泡刺激素和人絨毛膜促性腺激素（hCG）。

1.4 人工授精及隨訪

當(dāng)優(yōu)勢卵泡直徑＞18mm，子宮內(nèi)膜厚度≥7 mm，尿LH 峰出現(xiàn)，或注射hCG 6500～10 000U后24～36h行首次人工授精，超聲確認(rèn)排卵后再次行人工授精。每個周期常規(guī)授精2次，個別病例在排卵前或排卵后行單次授精，或圍排卵期授精3次。AID術(shù)后常規(guī)給予黃體功能支持。術(shù)后第10個月追蹤新生兒情況，包括分娩孕周、分娩方式、新生兒體重、性別和健康狀況等。

1.5 AID治療成功的診斷標(biāo)準(zhǔn)

AID術(shù)后第14～16天若無月經(jīng)來潮（注射hCG者需停藥超過7d），血 －h(huán)CG＞5U／L或尿hCG檢測（＋）為生化妊娠，術(shù)后第30～35天超聲檢查發(fā)現(xiàn)孕囊為臨床妊娠，確定妊娠位置、孕囊數(shù)和活胎數(shù)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS18.0軟件包對資料進(jìn)行統(tǒng)計分析，正態(tài)分布計量資料采用方差分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 供精精液凍存時間與AID結(jié)局及子代出生缺陷的關(guān)系

不同精液凍存時間組前向運動精子總數(shù)無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），各組臨床妊娠率、流產(chǎn)率無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）；2794例臨床妊娠中共發(fā)生子代出生缺陷33例（包括胎兒畸形引產(chǎn)8例），出生缺陷率為1.33%，各組出生缺陷發(fā)生率無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。見表1。

表1 供精精液凍存時間與AID結(jié)局及子代出生缺陷發(fā)生率的關(guān)系

2.2 子代出生缺陷發(fā)生情況

將33例出生缺陷進(jìn)行分類，結(jié)果顯示先天性心臟畸形比例最高（10／33），其次是唇腭裂（7／33）和先天性腦積水（3／33）等，其他畸形包括先天性膽道閉鎖、肛門閉鎖、多指畸形等15種。33例出生缺陷中8例在妊娠28周前實施引產(chǎn)術(shù)，引產(chǎn)兒均具有醫(yī)學(xué)指征，分別為重度唇腭裂1例、胎兒肺囊腺瘤1例、胎兒淋巴水囊瘤1例、唐氏綜合征2例、胎兒心臟畸形3例。已出生的25例出生缺陷患兒中有2例合并2處出生缺陷，分別為先天性心臟病合并腦積水和先天性心臟病合并膽道閉鎖，均于出生后2d內(nèi)死亡；2例腦積水患兒出生后死亡；1例先天性膽道閉鎖患兒出生后6個月死亡，其余出生缺陷兒均存活。33例出生缺陷均發(fā)生于不同編號的供精精液，出生缺陷多發(fā)生在供精精液凍存時間為0.5～3年，不同精液冷凍時間組出生缺陷發(fā)生率并無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。見表2。

表2 ADI助孕子代出生缺陷類型在不同精液凍存時間組的分布（例）

3 討論

精液冷凍是輔助生育中的重要技術(shù)之一，精液冷凍技術(shù)結(jié)合人工授精所進(jìn)行的AID為無精子癥以及先天性遺傳疾病不育患者帶來福音。然而，凍融后的精液質(zhì)量以及凍存時間的長短是否會對AID結(jié)局和子代的健康造成影響仍令人擔(dān)憂。在精子凍存過程中，各種因素不僅可以破壞精子的物質(zhì)結(jié)構(gòu)，而且還影響精子的功能。因此評估精液冷凍后的受精能力及子代安全性十分必要。

精子冷凍實際上是精子脫水，同時冷凍保護劑滲入精子內(nèi)取代水分的過程。目前的研究認(rèn)為冷凍過程中冰晶形成是造成精子結(jié)構(gòu)受損和喪失活動力的關(guān)鍵。冰晶形成將細(xì)胞局限在一個狹窄空間內(nèi)，造成精子膜受損、精子微結(jié)構(gòu)變化、精子DNA斷裂、精子線粒體功能及結(jié)構(gòu)受損，而這些變化不僅影響到精子活動力，同時也影響到精子受精能力及精子遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性，嚴(yán)重者可能導(dǎo)致精子DNA鏈斷裂，影響受精能力或?qū)е略缙谌焉锪鳟a(chǎn)［1］。國內(nèi)外均無關(guān)于精液冷凍儲存時間的管理條例，冷凍精液儲存時間長短對受精能力的影響也少有報道。Clarke等［2］采用精子頂體反應(yīng)和透明帶結(jié)合試驗對在液氮中儲存28年的精子進(jìn)行功能測試，證明長時間的儲存并未損傷精子功能。Yogev等［3］也證明精子液氮冷凍儲存0.5～14.4年，并不改變其前向運動總數(shù)，而前向運動精子總數(shù)被認(rèn)為是評估AID妊娠率的最重要參數(shù)［4］。本研究中采用的精子凍存時間為0.5～10年，比較各時間段前向運動精子總數(shù)及臨床妊娠率，認(rèn)為凍存時間的長短并不影響其受精能力，與上述報道一致，且臨床妊娠率為19.55%，與普通人群自然受孕率類似。普通人群自然流產(chǎn)約占全部妊娠的10%～15%，且多數(shù)為早期流產(chǎn)（＜12孕周）［5］。文獻(xiàn)報道AID助孕后流產(chǎn)率為 6.79% ～ 17.70%［6－7］，本 研 究 流 產(chǎn) 率 為12.88%，且多為早期流產(chǎn)，與文獻(xiàn)報道一致。在本研究中觀察到隨著凍存時間延長，其流產(chǎn)率有下降趨勢（P＞0.05），分析其原因可能是長時間凍存精液的AID周期較少所致，如精液凍存時間在＞7～10年共計22周期，妊娠6例，無流產(chǎn)發(fā)生。

目前我國出生缺陷發(fā)生率為5.6%，每年新增出生缺陷90萬例。我國出生缺陷監(jiān)測（監(jiān)測期為滿28孕周至出生后7d）數(shù)據(jù)表明，2000～2011年先天性心臟病、多指（趾）、唇裂伴或不伴腭裂、神經(jīng)管缺陷、先天性腦積水等是我國圍產(chǎn)兒前10位高發(fā)畸形［8］。國外一項關(guān)于AID助孕后妊娠11 535個周期的研究顯示，自然流產(chǎn)率為17.7%，出生缺陷發(fā)生率1.7%（包括新生兒和引產(chǎn)的胎兒）［7］。Hoy等［9］報道澳大利亞1552例AID助孕后出生缺陷發(fā)生率3.6%。本研究中出生缺陷發(fā)生率為1.33%，出生缺陷的種類主要為先天性心臟病、唇腭裂和先天性腦積水等，與國內(nèi)外的研究報道一致。本研究出生缺陷發(fā)生主要集中在精液凍存時間為0.5～3年，與該時間段AID周期數(shù)多，妊娠例數(shù)多有關(guān)。精液凍存＞5～10年總共妊娠25例，出生缺陷發(fā)生率為0，符合AID出生缺陷率發(fā)生概率。出生缺陷的發(fā)生受多種因素的影響，如夫婦雙方職業(yè)，不良生活習(xí)慣，孕婦孕期的飲食、用藥，環(huán)境因素等。對出生缺陷病例進(jìn)行詳細(xì)的隨訪和分析發(fā)現(xiàn)，33例出生缺陷均發(fā)生于不同編號的供精精液，這些精液用于其他婦女AID，并未發(fā)生出生缺陷，孕期也無特殊狀況發(fā)生。

本研究顯示冷凍精液用于AID安全有效，凍存時間的長短并不影響AID的妊娠率、流產(chǎn)率和子代出生缺陷率。由于本研究中長時間儲存精液樣本量較少，最長凍存時間僅為10年，并且對輔助生殖技術(shù)安全性的評估需要長期臨床觀察和追蹤隨訪。因此，本研究存在一定的局限性，期待著更大樣本量，更長時間的前瞻性研究對該問題進(jìn)行深入細(xì)致地探討。

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［4］ Freour T，Jean M，Mirallia S，et al.Predictive value of CASA parameters in IUI with frozen donor sperm［J］.Int J Androl，2009，32（5）：498－504.

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［9］ Hoy J，Venn A，Halliday J，et al.Perinatal and obstetric outcomes of donor insemination using cryopreserved semen in Victoria Australia［J］.Hum Reprod，1999，14（7）：1760－1764.