吳桂平 付 鑫* 張彥紅 鄒慕蔚 鄧會(huì)明 晏 寧

（沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院心內(nèi)科，遼寧 沈陽(yáng) 110035）

MAPK對(duì)RBP4誘導(dǎo)炎性反應(yīng)的調(diào)節(jié)機(jī)制及研究

吳桂平 付 鑫* 張彥紅 鄒慕蔚 鄧會(huì)明 晏 寧

（沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院心內(nèi)科，遼寧 沈陽(yáng) 110035）

目的 探討MAPK對(duì)視黃醇蛋白4（RBP4）誘導(dǎo)炎性反應(yīng)的調(diào)節(jié)機(jī)制。方法 利用大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞作為研究對(duì)象，首先檢測(cè)了RBP4對(duì)白細(xì)胞介素-2、白細(xì)胞介素-6以及TNF-α的mRNA水平的調(diào)節(jié)作用，其次，通過PI3K特異性抑制劑（wortmannin）作用下，檢測(cè)PI3K的mRNA水平，同時(shí)檢測(cè)RBP4對(duì)白細(xì)胞介素-2、白細(xì)胞介素-6以及TNF-α的mRNA水平的調(diào)節(jié)作用變化。結(jié)果 RBP4能夠顯著上調(diào)白細(xì)胞介素-2、白細(xì)胞介素-6以及TNF-α的mRNA水平（P＜0.05）。在wortmannin作用下，PI3K的mRNA水平顯著下調(diào)，白細(xì)胞介素-2、白細(xì)胞介素-6以及TNF-α的mRNA水平顯著下調(diào)（P＜0.05）。在過表達(dá)PI3K病毒作用下，白細(xì)胞介素-2、白細(xì)胞介素-6以及TNF-α的mRNA水平顯著上升（P＜0.05）。結(jié)論 本實(shí)驗(yàn)初步研究得出MAPK對(duì)RBP4誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)具有調(diào)節(jié)作用。

視黃醇蛋白4；MAPK；PI3K；炎性反應(yīng)

視黃醇蛋白-4（RBP4）是負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)維生素A的載體蛋白，在正常狀態(tài)下，RBP4主要產(chǎn)生于肝臟，但脂肪組織也會(huì)產(chǎn)生RBP4[1]。有研究顯示，在2型糖尿病中發(fā)現(xiàn)RBP4水平顯著上升。臨床調(diào)查顯示，RBP4在血液中的含量與心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)因子低密度脂蛋白（LDL）也有緊密的關(guān)系。動(dòng)脈粥樣硬化疾病的發(fā)病機(jī)制目前尚未解決，但當(dāng)前的研究發(fā)現(xiàn)，該疾病的初期具有血管內(nèi)皮炎性反應(yīng)的癥狀。動(dòng)脈粥樣硬化前期，RBP4能夠誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的炎性反應(yīng)，而PI3K/ MAPK信號(hào)通路在血管內(nèi)皮細(xì)胞的炎性反應(yīng)、增殖等方面均具有關(guān)鍵作用，本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上，旨在研究MAPK對(duì)RBP4誘導(dǎo)炎性反應(yīng)的調(diào)節(jié)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

原代培養(yǎng)大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞在10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37 ℃，5% CO2待傳至4～6代則用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 試劑及儀器

Trizol（Invertrogen），SYBR Green（Toyobo），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Toyobo），0. 25% 胰酶（上海生工）、新生牛血清（維森特）、細(xì)胞孵育箱（THERMO公司）、超凈工作臺(tái)（安泰）、SD大鼠（ 南京青龍山）。

1.3 RNA 提取

取傳至4～6代大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，吸棄培養(yǎng)液，添加1 mL冰浴PBS，利用移液器反復(fù)輕微吹打細(xì)胞，致細(xì)胞脫落，1000 rpm/min離心細(xì)胞收取，轉(zhuǎn)至1.7 mL離心管，加入1 mL Trizol溶液，加入0.2 mL氯仿。Vortex混勻，5 min室溫靜置，然后11000 rmp離心，時(shí)間為15 min。將上層的水相轉(zhuǎn)入到1.5 mL EP管，添加等體積異丙醇，Vortex混勻，然后放于-20 ℃冰箱中，過0.5 h后，11000 rmp離心，10 min。小心把上清倒掉，保留沉淀。添加1 mL 75%的乙醇，然后洗滌RNA沉淀，最后7000 rmp離心6 min。棄上清，靜置5 min。

1.4 RT-PCR

NanoDrop定量后按照TOYOBO 的RT-PCR試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：37 ℃ 25 min（RT-PCR反應(yīng)）；85 ℃ 5 s（酶失活反應(yīng)）。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量Q-PCR

用Primer Premier 5.0的軟件設(shè)計(jì)、并合成了相關(guān)基因引物，上海博尚生物技術(shù)有限公司合成引物，其特異性利用融解曲線進(jìn)行分析驗(yàn)證。cDNA表達(dá)豐度采用Ct值進(jìn)行檢測(cè)，β-actin的Ct值作為內(nèi)參。反轉(zhuǎn)錄結(jié)束之后，利用SYBR Green（Toyobo）按說(shuō)明書進(jìn)行熒光定量PCR。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。所有數(shù)據(jù)采用mean±SE顯示，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間的差異比較，用兩樣本的均數(shù)t檢驗(yàn)，P＜0.05定為統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著性的差異。

2 結(jié) 果

2.1 RBP4誘導(dǎo)大鼠胸主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生炎性反應(yīng)

實(shí)驗(yàn)組以4 μg/mL的RBP4加入DMEM培養(yǎng)基孵育大鼠胸主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞5 min，然后換用無(wú)RBP4的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)1 d后，進(jìn)行RNA抽取及熒光定量PCR。對(duì)照組加入等量的生理鹽水孵育5 min，然后換用無(wú)RBP4的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)1 d后，進(jìn)行RNA抽取及熒光定量PCR。表1結(jié)果顯示，相比于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組的炎性基因白細(xì)胞介素-2、白細(xì)胞介素-6以及TNF-α均顯著上調(diào)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。

表1 兩組炎性基因mRNA表達(dá)的對(duì)比情況（）

表1 兩組炎性基因mRNA表達(dá)的對(duì)比情況（）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05

組別 IL-6 IL-2 TNF-α對(duì)照組 1.0±0.1 1.1±0.1 0.9±0.1實(shí)驗(yàn)組 4.1±0.1* 3.9±0.2* 5.2±0.2*

2.2 PI3K抑制劑減弱了RBP4對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞炎性反應(yīng)

實(shí)驗(yàn)組添加10 mmol/L的PI3K抑制劑于大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞孵育10 min，然后以4 μg/mL的RBP4加入DMEM培養(yǎng)基孵育大鼠胸主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞孵育5 min，換用無(wú)RBP4的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)1 d后，進(jìn)行RNA抽取及熒光定量PCR。模型組參照2.1的實(shí)驗(yàn)組加藥方法。對(duì)照組參照2.1對(duì)照組的加藥方法。表2結(jié)果顯示，相比于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組的炎性基因白細(xì)胞介素-2、白細(xì)胞介素-6以及TNF-α均顯著上調(diào)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。

表2 三組炎性基因mRNA表達(dá)的對(duì)比情況（）

表2 三組炎性基因mRNA表達(dá)的對(duì)比情況（）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05

組別 IL-6 IL-2 TNF-α對(duì)照組 1.1±0.2 1.0±0.2 1.0±0.2模型組 4.2±0.3 3.8±0.1 4.8±0.1實(shí)驗(yàn)組 1.4±0.1* 1.4±0.1* 1.5±0.1*

2.3 過表達(dá)PI3K病毒增強(qiáng)了RBP4對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞炎性反應(yīng)

實(shí)驗(yàn)組添加PI3K過表達(dá)病毒5 μL于大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞孵育24h，然后以4μg/mL的RBP4加入DMEM培養(yǎng)基孵育大鼠胸主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞孵育5min，換用無(wú)RBP4的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)1天后，進(jìn)行RNA抽取及熒光定量PCR。模型組參照2.1的實(shí)驗(yàn)組加藥方法。對(duì)照組參照2.1對(duì)照組的加藥方法。表3結(jié)果顯示，相比于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組的炎性基因白細(xì)胞介素-2、白細(xì)胞介素-6以及TNF-α均顯著上調(diào)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。

表3 三組炎性基因mRNA表達(dá)的對(duì)比情況（）

表3 三組炎性基因mRNA表達(dá)的對(duì)比情況（）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05

組別 IL-6 IL-2 TNF-α對(duì)照組 1.0±0.3 1.0±0.1 0.9±0.1模型組 4.1±0.2 3.6±0.3 4.9±0.3實(shí)驗(yàn)組 7.0±0.3* 6.0±0.2* 6.8±0.2*

3 討 論

RBP4是一種炎性糖蛋白，通過提高趨化性，細(xì)胞附著和細(xì)胞 遷移和重組，組織結(jié)構(gòu)重塑，參與到血管內(nèi)皮功能障礙中來(lái)，作為對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞受損的反應(yīng)。RBP4的蛋白表達(dá)可見于動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中的巨噬細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，在動(dòng)脈粥樣硬化損傷的早期以最高表達(dá)見于巨噬細(xì)胞中[2]。內(nèi)皮功能障礙和動(dòng)脈粥樣硬化中的RBP4參與炎癥和動(dòng)脈過程，表明RBP40有可能在內(nèi)皮功能障礙和動(dòng)脈粥樣硬化中起作用。這些在體外的根瘤形成過程模仿一些在體內(nèi)變化的特點(diǎn)，這些變化發(fā)生在受傷后的VSMCs中，在這里媒介平滑肌細(xì)胞分化，遷移和作用于再狹窄和內(nèi)膜的形成過程[3]。在體外還研究發(fā)現(xiàn)，RBP4促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的趨化性，細(xì)胞黏著，擴(kuò)展和遷移，這表明RBP4在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成過程中起作用，在這一過程中平滑肌細(xì)胞被誘導(dǎo)遷移過內(nèi)膜，作為對(duì)外源信號(hào)的反應(yīng)。RBP4也通過促進(jìn)分支小管的形成來(lái)調(diào)整血管內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)，表明RBP4通過激發(fā)VSMCs的遷移和重組在血管再生術(shù)中起作用[4]。這些在體外的研究有免疫組織化學(xué)的分析作支持，它們揭示了體內(nèi)RBP4在人體動(dòng)脈粥樣硬化斑的平滑肌細(xì)胞中的蛋白表達(dá)。一些研究表明，提高血清中RBP4含量水平獨(dú)立地關(guān)聯(lián)于冠心病的出現(xiàn)及其程度，甚至發(fā)現(xiàn)在有心肌梗死的患者病例中含有更高水平的RBP4。另外還發(fā)現(xiàn)，提高血清中RBP4含量除了與心血管死亡有關(guān)外，還與其他各種原因有關(guān)。最后，在1型和2型糖尿病患者中也發(fā)現(xiàn)了RBP4含量的升高，與非糖尿病人群相比，這增大了患心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)。在1型糖尿病患者中，提高RBP4循環(huán)和蛋白尿之間的正相關(guān)，表明了RBP4在進(jìn)行性血管損傷導(dǎo)致微脈管疾病中的作用。

綜上所述，MAPK能夠介導(dǎo)RBP4對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的炎性反應(yīng)，為今后研究動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生機(jī)制提供了一定的理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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The Regulation of MAPK on the Inflammatory Response induced by RBP4

WU Gui-ping, FU Xin, ZHANG Yan-hong, ZOU Mu-wei, DENG Hui-ming, YAN Ning
(Department of Cardiology, Shenzhou Hospital Affiliated to Shenyang Medical College, Shenyang 110035, China)

Objective To explore the mechanisms of regulation of MAPK on the inflammatory response induced by retinol protein 4 (RBP4). Methods The rat aortic endothelial cells as an object of study, first detected RBP4 dialogue interleukin-2, the regulatory role of interleukin-6, and TNF-α mRNA levels, and secondly, the role of PI3K specific inhibitor (wortmannin) , the detection of mRNA levels of PI3K simultaneous detection of the changes of the regulatory role of RBP4 interleukin-2, interleukin-6 and of TNF-α mRNA levels. Results RBP4 significant upregulation of interleukin-2, interleukin-6, as well as of TNF-α mRNA levels (P＜0.05). Wortmannin role of PI3K mRNA level significantly lowered, interleukin-2, interleukin-6 as well as of TNF-α the mRNA level significantly significantly lowered (P＜0.05) in the over-expression of PI3K virus, interleukin-2, interleukin prime -6, and TNF-α mRNA levels increased significantly (P＜0.05). Conclusions In this study, preliminary studies MAPK-induced inflammatory response of RBP4 has a regulatory role.

RBP4; MAPK; PI3K; Inflammatory

R541.4

：B

：1671-8194（2014）07-0009-02

沈陽(yáng)市科技計(jì)劃項(xiàng)目（計(jì)劃文號(hào)：沈科發(fā)[2011]21號(hào)；項(xiàng)目編號(hào)：F11-262-9-41；合同編號(hào)：11318）

*通訊作者：E-mail:fuxin678@163.com