崔國艷, 顏 娜, 韓 冰

(1. 長治醫(yī)學(xué)院 微生物學(xué)教研室， 山西 長治 046000; 2. 北京大學(xué)口腔醫(yī)院 特診科， 北京 100081; 3. 北京大學(xué) 口腔醫(yī)學(xué)院， 北京 100081)

靜電紡絲技術(shù)是目前制備超細(xì)纖維最重要的方法之一，在傳感器、防護(hù)服和電子元件等領(lǐng)域，尤其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域用來制作藥物傳輸與緩控釋放的載體及創(chuàng)傷敷料等有著廣泛的應(yīng)用[1-2]。導(dǎo)致組織再生手術(shù)失敗的最主要原因是術(shù)后細(xì)菌感染，尤其是在牙周手術(shù)中,由于骨骼替代物、手術(shù)感染和術(shù)后繼發(fā)感染往往導(dǎo)致牙周炎的發(fā)生，這些炎癥并發(fā)癥嚴(yán)重影響了骨組織再生的治療[3-5]。如今，載抗炎藥物的局部緩釋系統(tǒng)由于其長期治療效果和副作用少等優(yōu)點(diǎn)[6-7]，正成為生物醫(yī)學(xué)治療的熱點(diǎn)。目前應(yīng)用的各種引導(dǎo)骨再生(guided bone regeneration, GBR)生物膜大都只起機(jī)械性的阻擋作用，療效欠佳，而且在操作及后期使用中經(jīng)常出現(xiàn)暴露、創(chuàng)口感染等問題，嚴(yán)重影響成功率，因此開發(fā)具有抗菌活性的GBR膜尤為重要[8-9]。

聚乳酸/聚乙醇酸(PLGA)納米纖維膜具有良好的生物降解性能、力學(xué)性能和生物相容性，在生物體內(nèi)可逐步降解為水和二氧化碳，對人體無害、無積累[10]，然而其降解后形成的局部酸性也會導(dǎo)致周圍器官和組織產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，這也是人工合成的可降解聚酯類聚合物作為生物材料使用時(shí)所共有的缺陷。鹽酸四環(huán)素是一種廣譜抗生素, 沒有免疫反應(yīng)，滲透能力強(qiáng)，具有抗膠原酶活性、抑制骨吸收、消炎和預(yù)防組織破壞等作用，常用于預(yù)防手術(shù)后感染[11-12]。本文將其作為抗菌添加劑，以期制備一種安全、穩(wěn)定、高效的聚乳酸聚乙醇酸抗菌納米纖維，為其在再生醫(yī)學(xué)和組織工程材料領(lǐng)域的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要材料和儀器

聚乳酸/聚乙醇酸(PLGA，質(zhì)均相對分子質(zhì)量Mw=50 000，美國Sigma公司),鹽酸四環(huán)素(Tet, 美國Sigma公司),四氫呋喃(THF)，N-N二甲基甲酰胺(DMF)。改良Eagle′s培養(yǎng)基(MEM)、胰蛋白酶和胎牛血清(美國Gibco公司)；人成骨樣細(xì)胞(MG-63)(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院)，CO2恒溫培養(yǎng)箱(日本SANYO公司)，紫外光分光光度計(jì)(Perkin-Elmer公司)，水平離心機(jī)(德國Heraeus公司)，靜電紡絲機(jī)(北京化工大學(xué))，日立S- 4700 FEG掃描電子顯微鏡，熒光顯微鏡(日本Nikon E800公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1載藥納米纖維膜的制備

將PLGA溶于四氫呋喃和N-N二甲基甲酰胺(體積比為1∶1)的混合溶液中,磁力攪拌,以形成均一的聚合物溶液;將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%、5%、10%的Tet溶解在少量的甲醇中，然后滴入PLGA溶液中，超聲波充分?jǐn)嚢璧玫揭环N均質(zhì)的前驅(qū)體溶液。

將前驅(qū)體溶液裝入一個20 mL(內(nèi)徑為0.7 mm)配備一個無污染鋼針頭的玻璃注射器中。靜電紡工藝參數(shù)為：電壓15～20 kV，接收距離15～20 cm，流速0.3～0.5 mL/h，以滾筒(d=9 cm，2 500～3 000 r/min)為接收裝置進(jìn)行靜電紡絲，制備出加載鹽酸四環(huán)素的PLGA納米纖維膜，常溫下真空干燥1周以完全去除殘液，避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2PLGA/Tet納米纖維膜形貌的表征

制備的納米纖維膜真空干燥后，噴金，掃描電鏡觀察其微觀形貌。用ImageJ[13]軟件測量納米纖維的直徑，隨機(jī)選取100根纖維計(jì)算纖維的平均直徑。在發(fā)射波長為360～400 nm處，用熒光顯微鏡觀察鹽酸四環(huán)素在納米纖維表面的分布狀況。

1.2.3體外釋放率

稱取不同理論載藥量的納米纖維膜各10 mg，溶解在2 mL THF和DMF(體積比為1∶1)的混合溶液中，然后添加10 mL PBS緩沖溶液 (pH=7.4)，超聲振蕩，至藥物完全溶解。離心(5 000 r/min)20 min，將水相吸出。采用分光光度計(jì)在360 nm波長處測定其吸光度。對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算藥物濃度。標(biāo)準(zhǔn)曲線可通過檢測標(biāo)準(zhǔn)濃度的鹽酸四環(huán)素溶液的吸光度來獲得。

稱取不同載藥量的納米纖維膜各10 mg，浸入含5 mL PBS的溶液(pH=7.4)中，置于轉(zhuǎn)速為120 r/min，溫度為37 ℃的恒溫水浴振蕩器中。在設(shè)定的時(shí)間間隔取出5 mL的釋放液，然后補(bǔ)加同等體積的新鮮PBS溶液。將取出的釋放液采用分光光度法在360 nm波長處測其吸光度，對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算載藥纖維的藥物濃度及釋藥量，然后計(jì)算累積釋藥百分率并作累積釋藥曲線。

1.2.4體外抑菌性能檢測

將凍干保存的金黃色葡萄球菌 (ATCC 33592)在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在625 nm處調(diào)整菌液濃度使其吸光度值介于0.1和0.2之間，然后將其分裝到5 mL離心管中，稱取3種不同載藥量的納米纖維膜各0.1 mg，分別加入離心管中，37 ℃孵育，并不斷振蕩，24 h后所得結(jié)果用SPSS 10.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

用改良的Kirby-Bauer紙片擴(kuò)散法[14]分析其抑菌性能。將3種不同載藥量的納米纖維膜及陰性對照裁成1 cm×1 cm大小，置于瓊脂平板上，于37 ℃下培養(yǎng)4 h,使膜中的藥物擴(kuò)散到瓊脂中。將平皿在37 ℃下干燥2 h，取出膜后向瓊脂平板上加入100 μL金黃色葡萄球菌的菌液, 于37 ℃培養(yǎng)12 h和48 h后，觀察菌落的生長情況。

1.2.5體外生物相容性檢測

將不同載藥量納米纖維膜切成直徑約為10 mm的圓片, 浸入細(xì)胞培養(yǎng)液24 h，然后覆蓋于24孔板底部。MG-63細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA消化，以104/孔密度接種于膜上，標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下孵育(37 ℃，5%CO2)，每2～3 d換液。于第3天和7天取出, 用PBS溶液(pH=7.4)洗去殘余培養(yǎng)液,2.5%戊二醛固定，4 ℃下靜置適當(dāng)時(shí)間。采用梯度乙醇脫水(20%、50%、70%、90%),每個濃度梯度脫水10 min,然后用100%乙醇脫水2次，每次10 min，臨界點(diǎn)干燥,噴金，采用掃描電鏡觀察試樣形貌。

2 結(jié)果分析

2.1 納米纖維形貌的表征

圖1示出同一紡絲工藝下，添加不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)Tet的納米纖維膜掃描電鏡照片。

圖1 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)Tet納米纖維的SEM照片(×5 000)Fig.1 SEM images of PLGA/ Tet nano-fibrous at different mass fraction(×5 000)

由圖1可見，添加不同比例的Tet后仍能制備出均勻、連續(xù)、表面光滑的聚乳酸/聚乙醇酸納米纖維，各纖維膜中纖維交錯重疊，光滑均一，沒有明顯的珠狀膨大結(jié)構(gòu)或纖維黏連現(xiàn)象，呈現(xiàn)出三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，且纖維表面觀察不到藥物結(jié)晶的存在，表明該藥物已滲入納米纖維中。不同載藥量的纖維直徑無顯著差異，平均直徑在360～470 nm之間。

2.2 熒光顯微鏡形貌觀察

盡管得到了光滑均一的PLGA/Tet納米纖維膜,還不能確認(rèn)Tet是否均勻分布在納米纖維上，需熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，如圖2所示。由圖可直觀地看出，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%鹽酸四環(huán)素很好地負(fù)載在PLGA納米纖維內(nèi)部，纖維表面光滑均一，表明鹽酸四環(huán)素成功包裹于納米纖維內(nèi)部。

圖2 10%鹽酸四環(huán)素在PLGA/Tet納米 纖維膜上的熒光顯微圖Fig.2 Fluorescence micrograph of 10% Tet loaded PLGA fibrous membrane

2.3 PLGA /Tet納米纖維的體外釋藥性能

不同載藥量PLGA/Tet納米纖維膜的體外釋藥曲線見圖3。

圖3 不同載藥量PLGA/ Tet納米纖維膜的 體外釋藥曲線Fig.3 In vitro release profiles of Tet from PLGA/Tet electrospun nanofibers of different drug loadings

由圖可見，不同載藥量的納米纖維膜初期釋藥速率很快，隨著時(shí)間的延長，藥物的釋放速度趨于平緩。其中載藥量為10%的納米纖維突釋現(xiàn)象最明顯，在24 h內(nèi)的釋放量可達(dá)80%以上。且3種載藥量的納米纖維藥物釋放持續(xù)時(shí)間都在27 d以上。突釋現(xiàn)象是由于纖維表層的藥物擴(kuò)散阻力小，易擴(kuò)散到溶液中，故導(dǎo)致瞬時(shí)釋放；當(dāng)大部分藥物釋放后，表面及靠近表面的藥物已釋放完畢，其余藥物只能從纖維內(nèi)部向表面擴(kuò)散再釋放，故導(dǎo)致后期釋藥速率減緩[15-16]。隨著藥物含量的增加，突釋現(xiàn)象越明顯。這可能是由于隨著藥物含量的增大，擴(kuò)散的濃度梯度增大，更有利于藥物擴(kuò)散到媒介中。對于抗菌藥物而言,一定量的突釋是有利的,因?yàn)槌跗诟邼舛鹊乃幬锟蓺⑺廊肭值募?xì)菌，而后期持續(xù)釋放的抗生素也是必要的,可防止其進(jìn)一步的入侵以預(yù)防術(shù)后感染[17]。

2.4 體外抗菌活性

不同載藥量的PLGA納米纖維膜體外抗金黃色葡萄球菌性能如圖4所示。

圖4 37 ℃共孵育12 h和48 h的抑菌活性的分析結(jié)果Fig.4 Bacteria inhibition zone at 37 ℃ for 12 h and 48 h respectively at sites of membranes. (a) Different drug loadings of nanofibers; (b) Bacteria inhibition zone of 12 h; (c) Bacteria inhibition zone of 48 h

由圖可見，納米纖維與金黃色葡萄球菌在37 ℃共同孵育12 h和48 h后，平皿中放置載藥納米纖維膜的位置出現(xiàn)了抑菌環(huán)，說明藥物擴(kuò)散到培養(yǎng)基中，且有效抑制了金黃色葡萄球菌生長。載藥量為10%的納米纖維膜的抑菌環(huán)直徑最大，這意味著加載Tet的量越多，納米纖維膜釋放的Tet越多，抗菌活性也越強(qiáng)；同時(shí),也證實(shí)了加載Tet的納米纖維膜釋放的Tet保留了它的生物學(xué)性能。相比之下,載藥量為0的納米纖維膜沒有抑菌環(huán)，導(dǎo)致細(xì)菌的增長。另一方面,培養(yǎng)48 h的抑菌環(huán)直徑明顯小于培養(yǎng)12 h的,可能是隨著時(shí)間的延長，突釋減緩，Tet的抑菌能力下降。Kim等[18]報(bào)道加載頭孢西丁鈉的PLGA納米纖維膜也出現(xiàn)同一現(xiàn)象，他們認(rèn)為隨著時(shí)間延長，藥物結(jié)構(gòu)分解,導(dǎo)致抑菌環(huán)減小。盡管抑菌能力下降,但藥物的抗菌活性仍有效且持續(xù)地釋放，因此，只要加載Tet的PLGA納米纖維膜持續(xù)釋放Tet，金黃色葡萄球菌的生長就會受到抑制,在預(yù)防組織再生術(shù)后粘連和感染中發(fā)揮一定作用。

2.5 體外生物相容性分析

圖5示出不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的納米纖維膜和MG-63細(xì)胞體外共培養(yǎng)的電鏡圖片。從圖中可看出，MG-63細(xì)胞分別培養(yǎng)3 d和7 d后，細(xì)胞呈片狀分布在膜上，多個細(xì)胞相互交聯(lián)，說明細(xì)胞在支架上黏附和鋪展良好。細(xì)胞分別培養(yǎng)3 d和7 d時(shí)，隨著Tet加載量越多，細(xì)胞增殖越好。加載10%Tet的纖維膜與加載3%和5%的纖維膜相比，其MG-63細(xì)胞的形態(tài)和密度無顯著差異，這說明PLGA/Tet支架有利于細(xì)胞的黏附和增殖。作為一個藥物緩釋體系，PLGA /Tet膜應(yīng)能夠控制藥物的釋放和吸收，使藥物緩釋，藥效持續(xù)。MG-63細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果表明, 加載不同比例Tet的PLGA/Tet膜都有很好的生物相容性。這與Park等[19]證實(shí)的加載Tet的PLLA支架適于成骨細(xì)胞的黏附和生長結(jié)果一致，因此，可考慮PLGA/Tet膜作為藥物緩釋體系植入體內(nèi)以促進(jìn)組織愈合。

圖5 MG-63在不同載藥量的納米 纖維膜上的黏附和增殖Fig.5 Attachment and proliferation of MG-63 on different drug loadings nanomembrane

3 結(jié) 論

該纖維的紡絲工藝條件為：Tet的添加比例3%、5%、10%，紡絲電壓15～20 kV，接收距離15～20 cm，流速0.3～0.5 mL/h；能夠成功制備出均勻、光滑的PLGA/Tet納米纖維；所制纖維都存在突釋現(xiàn)象，且加載10% Tet的納米纖維的突釋現(xiàn)象最明顯，其釋藥時(shí)間可持續(xù)27 d以上。體外抗菌活性結(jié)果表明：加載Tet的量越多，抗菌活性越強(qiáng)，且培養(yǎng)12 h的抑菌圈直徑大于培養(yǎng)48 h的；體外細(xì)胞相容性測試結(jié)果表明PLGA/Tet支架具有良好的生物相容性，可作為物理屏障分隔受傷的組織和鄰近組織。

FZXB

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