杜 樂 周 艷 林艷云 柏強善 張 彬 安廣洲 苗 霞 丁桂榮 郭國禎（中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學軍事預防醫(yī)學院放射醫(yī)學教研室 西安 7003）

2（中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學學員旅 西安 710032）

隨著無線通訊事業(yè)的飛速發(fā)展和移動電話在全世界范圍內(nèi)的普及，射頻輻射對人類健康的影響已經(jīng)成為生物電磁學和環(huán)境醫(yī)學研究的熱點問題[1-3]。研究表明，睪丸是電磁輻射的敏感靶器官之一。一定參數(shù)的射頻輻射可以引起睪丸結構和功能的損傷，造成性功能和生育能力下降[4]。

支持細胞（Sertoli 細胞）是位于生精上皮的壁細胞，該細胞位于管壁基底膜并延伸至曲細精管管腔，沿著支持細胞胞體，精原細胞發(fā)育至成熟精子的所有形態(tài)、生理變化過程都在此發(fā)生。作為與生精細胞接觸的惟一體細胞，支持細胞在生精過程中發(fā)揮至關重要的調(diào)控作用[5]。其主要作用是在精子生成過程中，Sertoli細胞為精子發(fā)生提供物理支撐和穩(wěn)定的微環(huán)境，并為精細胞提供營養(yǎng)和發(fā)育所需的細胞因子[6]。研究表明，支持細胞能分泌多種細胞因子，其中研究較多的是干細胞因子(SCF)和膠質(zhì)細胞系來源的神經(jīng)生長因子(GDNF)。據(jù)報道，SCF和GDNF能夠促進精原干細胞的增殖與分化[7-11]。

本研究以建系的小鼠睪丸支持細胞(TM4)為實驗對象，對其進行連續(xù)5 d的1950 MHz GSM信號輻照，探討該條件下射頻輻射對TM4細胞增殖和分泌功能的影響，為明確射頻輻射對人類生殖健康的影響提供理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

HERAcell 240i 細胞培養(yǎng)箱(Thermo)，DMEM/F12 1:1(Thermo)，胎牛血清（杭州四季青），T25細胞培養(yǎng)瓶(Nunc)，96 孔細胞培養(yǎng)板(Nest)，電熱恒溫水浴箱（上海醫(yī)療器械廠），CCK-8（碧云天），Model680 酶標儀(Bio-Rad)，BrdU試劑盒(merk)，兔抗小鼠Ki67抗體(Abcam)，山羊抗兔熒光二抗（博士德），熒光倒置顯微鏡(Leica)，ELISA試劑盒(Bio-Swamp)，美國Bection Dickinson公司流式細胞儀(BD FACSAria)，光學顯微鏡(Olympus)，臺式低溫高速離心機(Zentrifugen)，超凈工作臺（蘇州凈化設備公司）。

1.2 TM4細胞培養(yǎng)及傳代

TM4細胞由第四軍醫(yī)大學病理生理學教研室的張遠強教授惠贈。細胞于37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)液為DMEM/F12 1:1（含10%胎牛血清、100 μg·mL?1青霉素、100 μg·mL?1鏈霉素、2.50 mmol·L?1谷氨酰胺和15 mmol·L?1HEPES），每2 d換液一次。當細胞密度為80%?90%時，用胰酶消化傳代。

1.3 射頻電磁場輻照系統(tǒng)

輻照系統(tǒng)(sXc-1950 MHz)購自瑞士IT’IS公司，主要包括4部分：一個射頻輻射發(fā)生器，一個專制的功能發(fā)生器，一個狹窄的帶狀放大器和兩個矩形的波導腔。每個波導腔可放置6個細胞培養(yǎng)皿（直徑35 mm），一個波導腔產(chǎn)生射頻電磁場，用于細胞輻照；另一個波導腔不產(chǎn)生射頻電磁場，用于細胞假輻照。通過計算機隨機選擇輻照組和假輻照組，并對整個細胞暴露系統(tǒng)進行比吸收率(0?4.0 W·kg?1)定量和全反饋控制。該系統(tǒng)以1950 MHz頻率穩(wěn)定運轉(zhuǎn)。整個輻照過程中，細胞處于(37±0.1) ℃、5%CO2的環(huán)境中。輻照組和假輻照組溫度差控制在0.1 ℃以內(nèi)。

1.4 輻照程序

將TM4細胞制備成1.5×103個·mL?1的細胞懸液，接種于35 mm培養(yǎng)皿，每皿接種3 mL。細胞接種后24 h，更換新鮮培養(yǎng)液，并將其隨機分為2組，分別置于輻照裝置的兩個小室中：一個小室產(chǎn)生GSM信號，用于細胞輻照；另一個小室不產(chǎn)生GSM信號，用于假輻照。輻照參數(shù)為：GSM-Talk信號，1950 MHz連續(xù)波，比吸收率為3 W·kg?1，輻照時間為5 d。

1.5 CCK-8檢測細胞增殖情況

TM4細胞輻照結束后，細胞用 0.25%胰酶消化為單細胞懸液，離心(800 r·min?1, 5 min)，收集細胞沉淀，用含10%血清的DMEM/F12 1:1 培養(yǎng)液重懸，制成單細胞懸液后進行細胞計數(shù)，將細胞密度調(diào)整至1×104個·mL?1。用移液器吸取100 μL稀釋后的細胞懸液接種到96 孔板上，每組8個復孔，總共接種5塊96孔板，分別檢測細胞輻照后1?5 d的增殖情況。將接種后的96孔板置于37 ℃、5%CO2孵箱中，于培養(yǎng)24 h后，取一塊96孔板，每孔加入10 μL CCK-8溶液，低速震蕩10 min，37 ℃孵育4 h后，在酶標儀上，選擇450 nm波長，測定各孔吸光度值（OD值）。后面4 d的加試劑時間，試劑量，測定方法同第1 d。計算每組OD值，算術平均數(shù)繪制折線圖。

1.6 BrdU檢測細胞增殖情況

按照BrdU試劑盒說明進行操作。根據(jù)CCK-8檢測結果，選取輻照后1 d和3 d的細胞（輻照組和假輻照組）進一步檢測細胞輻照后增殖情況，在輻照后1 d，每組取兩個皿，0.25%胰酶消化為單細胞懸液，離心(800 r·min?1, 5 min)，收集細胞沉淀，用含10%血清的DMEM/F12 1:1 培養(yǎng)液重懸，制成單細胞懸液后進行細胞計數(shù)，將細胞密度調(diào)整至1×105個·mL?1，每組接種100 μL于96孔板中，每組設3個樣品復孔，1個空白對照和1個背景孔?？瞻讓φ湛字患?00 μL培養(yǎng)液（不加細胞懸液），背景孔只加100 μL細胞懸液（不加BrdU標記物）。在每個樣品孔中加20 μL BrdU工作貯存液。在孵箱中溫育2?24 h。去除孔中內(nèi)容物：將96孔板顛倒并用紙巾輕輕將殘液除去。在每孔中加200 μL固定液。室溫下溫育30 min。去除孔中內(nèi)容物：將96孔板顛倒，在紙巾上扣擊板將殘液除去。然后將板置于4 ℃條件下1周。用抗體稀釋液將100×抗BrdU抗體稀釋100倍，在每孔中加100 μL稀釋后的溶液，室溫下溫育1 h。在每孔中加滿1×洗劑液洗3次。在紙巾上輕輕去除殘液。在每孔加 100 μL共軛稀釋液，室溫下溫育30 min。洗劑同前。在所有板孔中加滿dH2O，將96孔板顛倒，在紙巾上扣擊板將殘液除去。在每孔中加100 μL底物溶液，室溫避光溫育15 min。在每孔中加100 μL終止液，加樣順序同加底物順序。用分光光度計在雙波長450?540 nm（或450?595 nm）下測定每孔的吸光度（OD值）。每組OD值=樣品孔的平均OD值?空白孔OD值?背景孔OD值。

1.7 免疫熒光檢測細胞增殖標志物表達情況

輻照后，將細胞接種于12孔板內(nèi)的無菌蓋玻片上，接種量為800個細胞/孔，在輻照后第3 d，此時每孔的細胞量大約為50%?60%，用多聚甲醛室溫固定30 min；PBS洗3次，每次5 min；0.15%TritonX-100室溫透化10?15 min；PBS洗3次，每次5 min ；5%山羊血清室溫封閉15?20 min；PBS洗3次，每次5 min ；加一抗：兔抗小鼠Ki67（用PBS稀釋Ki67，稀釋比為1: 50），放入濕玻璃皿中4 ℃孵育過夜。取出濕玻璃皿至常溫復溫0.5 h，PBS洗3次，每次5 min；常溫、避光條件下孵育二抗：山羊抗兔488（用PBS稀釋二抗，稀釋比為1:500）1 h；PBS洗3次，每次5 min；常溫避光條件下孵育DAPI(用PBS稀釋DAPI，稀釋比為1:20) 5 min；PBS洗2次，每次5 min；在熒光顯微鏡下觀察和拍攝圖片。

1.8 ELISA檢測TM4細胞分泌因子表達情況

輻照結束后，收取1?5 d的細胞上清，檢測TM4細胞輻照后1?5 d分泌SCF（或GDNF）的濃度。標準品的稀釋：準備小試管6只，依次編好號碼，先在各小試管中加入標準品稀釋液100 μL，然后取原濃度標準品100 μL加入一只已編好號的試管中，充分混勻；再在該試管中取100 μL加入第二支試管中，充分混勻；再在該試管中取100 μL加入第三只試管中，充分混勻；再在該試管中取100 μL加入第四只試管中，充分混勻；再在該試管中取100 μL加入第五只試管中，充分混勻；然后在該試管中取100 μL，棄掉。第六只試管作為0號標準品。稀釋后各管濃度分別為2400、1200、600、300、150 和0 pg·mL?1。在酶標包被板上設標準品孔，依次加入不同濃度標準品50 μL（每個濃度做2個復孔）。加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品、酶標試劑及生物素標記的抗SCF（或GDNF）抗體，其余各步操作相同）、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品40 μL，然后再加生物素標記的抗SCF（或GDNF）抗體10 μL。加樣：將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。溫育：用封板膜封板后置37 ℃溫育30 min。配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用。洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復5次，拍干。加酶：每孔加入酶標試劑50 μL，空白孔除外。溫育：操作同前。洗滌：操作同前。顯色：每孔先加入顯色劑A 50 μL，再加入顯色劑B 50 μL，輕輕震蕩混勻，37 ℃避光顯色15 min。終止：每孔加終止液50 μL，終止反應（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。測定：以空白孔調(diào)零，在450 nm波長處，依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應在加終止液后15 min以內(nèi)進行。根據(jù)標準曲線方程計算TM4細胞（樣品孔）分泌SCF（或GDNF）的濃度。

1.9 統(tǒng)計學分析

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件包分析，樣本描述用±s表示，兩組間樣本均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗，p＜0.05或p＜0.01時認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 CCK-8檢測GSM-Talk信號連續(xù)輻照5d對TM4細胞增殖的影響

與假輻照組相比，GSM-Talk信號連續(xù)輻照細胞5 d后， TM4細胞增殖在輻照后2?5 d受到明顯抑制，具體見圖1。

圖1 輻照后不同時間TM4細胞增殖情況**, p＜0.01, 與假輻照組相比Fig.1 TM4 cell proliferation at different time points after radiation(**, p＜0.01, vs.control group)

2.2 BrdU檢測GSM-Talk信號連續(xù)輻照5d對TM4細胞增殖的影響

BrdU檢測結果表明，TM4細胞連續(xù)暴露于GSM-Talk信號5 d后，細胞增殖受到抑制，輻照后3 d兩組比較有統(tǒng)計學差異(p＜0.05)，見圖2。

圖2 輻照后第1 天和第3 天TM4細胞增殖情況Fig.2 TM4 cell proliferation at 1 d and 3 d after radiation

2.3 GSM-Talk信號連續(xù)輻照5d對TM4細胞增殖標志物Ki67表達的影響

射頻輻照后第3 d，免疫熒光結果顯示，輻照組TM4細胞增殖標志物Ki67的表達較對照組減弱，見圖3和圖4。

圖3 輻照后第3 d TM4細胞Ki67免疫熒光染色結果 (×200)Fig.3 Ki67 immunofluorescence staining results at 3 d after TM4 cell radiation (×200)

圖4 輻照后第3 天TM4細胞Ki67熒光強度結果Fig.4 Ki67 fluorescence intensity results at 3 d after TM4 cell radiation

2.4 GSM-Talk信號連續(xù)輻照5d后TM4細胞上清中細胞因子水平變化

TM4細胞輻照后2?5 d，細胞上清中SCF濃度明顯低于假輻照組，有統(tǒng)計學差異(p＜0.05)，輻照后第1 d和第3 d，輻照組細胞上清中GDNF的濃度明顯高于假輻照組，有統(tǒng)計學差異(p＜0.05)，見圖5和圖6， 提示該條件下的射頻輻射可影響TM4細胞的分泌功能。

圖5 輻照后不同時間TM4細胞上清中SCF濃度變化Fig.5 The concentration of SCF in TM4 cell supernatant at different time points after radiation

圖6 輻照后不同時間TM4細胞上清中GDNF濃度變化Fig.6 The concentration of GDNF in TM4 cell supernatant at different time points after radiation

3 討論

睪丸支持細胞是生精上皮的支持結構，貫穿生精上皮的全層。研究表明，支持細胞在精子發(fā)生中發(fā)揮著重要作用。據(jù)報道，一定參數(shù)的射頻電磁輻射能夠影響睪丸支持細胞的增殖和細胞結構等。高曉芳等[12]將體外培養(yǎng)的睪丸支持細胞暴露于功率密度分別為0、30和100 mW·cm?2的微波輻射中各5 min，結果顯示，輻照后支持細胞生長出現(xiàn)抑制，表現(xiàn)為G0-G1期細胞數(shù)量增加，G2-M和S期細胞數(shù)量減少，凋亡和死亡細胞增加，細胞內(nèi)Ca2+濃度增加。作者認為細胞內(nèi)Ca2+濃度的增加是微波誘導支持細胞損傷的機制之一。吳惠等[13]為探討不同波段電磁輻射對大鼠睪丸支持細胞損傷效應的異同，將原代培養(yǎng)的Sertoli細胞經(jīng)場強 6×104V·m?1的電磁脈沖(Electromagnetic pulse, EMP)，平均功率密度為100 mW·cm?2的S-波段高功率微波(S-band high power microwave, S-HPM)和X-波段高功率微波輻射( X-band high power microwave, X-HPM)，結果顯示，3種波段電磁輻射后，Sertoli細胞的晚期凋亡和壞死率增加；細胞代謝活性降低，且超寬譜波段的EMP致Sertoli細胞的損傷最明顯。我們的實驗結果顯示，1950 MHz GSM-Talk信號連續(xù)輻照TM4細胞5 d后， TM4細胞增殖受到明顯抑制，CCK-8、BrdU和Ki67免疫熒光檢測結果均證實了這一現(xiàn)象，該結果與高曉芳等的報道結果一致。此外，還有學者研究了射頻輻射對睪丸組織超微結構的影響。Serkan ?elik等[14]將雄性Wistar-Kyoto大鼠暴露于SAR為1.58 W·kg?1的手機輻射中3個月后，透射顯微鏡下觀察睪丸的超微結構，發(fā)現(xiàn)輻照組睪丸支持細胞胞漿有空泡和高電子密度結構形成以及大量脂滴存在，提示手機輻射可能引起支持細胞超微結構的改變。吳惠等[13]研究表明三種不同波段的電磁輻射可致原代培養(yǎng)的大鼠睪丸支持細胞胞漿顆粒增多且空泡變性；超微結構主要為線粒體腫脹、空化，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張。本科室前期研究表明[15]2450 MHz微波局部照射BALB/c小鼠睪丸后，各級生精細胞出現(xiàn)以濁腫為主的病理學改變，支持細胞病變的特異表現(xiàn)為萎縮變性，出現(xiàn)細胞體積明顯縮小，如突起回縮，由直立位變?yōu)闄M臥位，或成為緊靠基膜的薄層部分，染色加深。

研究表明，射頻輻射除對睪丸支持細胞的增殖和細胞結構造成影響外，還可導致細胞（包括睪丸支持細胞）分泌功能的改變[16-18]。支持細胞是唯一與生精細胞接觸的體細胞，在精子發(fā)生過程中，支持細胞可分泌多種細胞因子，調(diào)節(jié)精原干細胞自我更新和分化，精母細胞減數(shù)分裂以及圓形精子細胞轉(zhuǎn)化為精子[19]。其中研究較多的細胞因子是SCF和GDNF。SCF又稱c-kit配體，肥大細胞生長因子(MGF)。研究表明，SCF能夠促進小鼠精原細胞分化為圓形精子細胞[20]，而且可誘導小鼠A1-A4型精原細胞的增殖和分化[21]。GDNF是轉(zhuǎn)化生長因子β超家族的一個相關成員。它的信號轉(zhuǎn)導受體復合物包括酪氨酸激酶 Ret 受體和 GDNF 家族受體α1。據(jù)報道，GDNF可促進未分化型精原細胞（包括精原干細胞）的增殖[22-23]。本實驗，我們對射頻輻照后支持細胞上清中的SCF和GDNF水平進行了檢測，結果顯示，1950 MHz GSM-Talk信號連續(xù)輻照5 d后的第2 d到第5 d，細胞上清中SCF濃度明顯降低，輻照后第1 d和第3 d，細胞上清中GDNF濃度顯著增加。除探討電磁輻射引起Sertoli細胞形態(tài)結構，增殖和分泌功能改變外，電磁輻射致Sertoli細胞的損傷會對精子發(fā)生產(chǎn)生何種影響呢？研究表明[24]，Sertoli細胞經(jīng)γ射線照射后，細胞因子IL6的表達增強。Wu等[16]將睪丸支持細胞進行微波輻照后，發(fā)現(xiàn)其分泌因子：腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1β(IL-1β)和白細胞介素-6(IL-6)增加，這些上調(diào)的分泌因子能夠誘導生殖細胞的凋亡和生殖細胞膜的脂質(zhì)過氧化。作者推測，射頻輻照后SCF和GDNF這兩種細胞因子水平的改變也將對精子的正常發(fā)生產(chǎn)生影響。

截止目前，關于射頻輻射對睪丸支持細胞分泌因子GDNF、SCF表達的影響研究尚未見報道，僅檢索到一些關于電離輻射對睪丸支持細胞分泌功能影響的研究文獻。Mauduit等[25]報道，成年雄性小鼠接受X線(4 Gy)照射72 h后，支持細胞中SCF的表達未見明顯改變。Albuquerque等[26]將成年雄性小鼠用6 Gy γ60Co射線照射，發(fā)現(xiàn)輻照后支持細胞數(shù)量、結構及分泌SCF和GDNF的能力沒有改變。提示，不同性質(zhì)的物理因子對睪丸支持細胞分泌功能的影響也存在差異。其主要原因可能與各研究機構之間使用的射頻輻射源的種類，實驗條件及實驗動物的不同有關。

本研究首次報道了1950 MHz GSM-Talk信號對睪丸支持細胞增殖及分泌功能的影響，結果提示，1950 MHz GSM-Talk信號連續(xù)輻照5 d可抑制TM4細胞的增殖并影響其分泌功能。睪丸支持細胞對精子正常發(fā)生起著至關重要的作用，射頻輻射致睪丸支持細胞的效應可能影響精子的正常發(fā)生，最終導致生殖功能異常。本研究為正確評估手機射頻輻射對生殖健康的影響及衛(wèi)生防護提供了理論和實驗依據(jù)。關于射頻輻射影響支持細胞增殖及分泌功能的分子機制，有待進一步研究。

1 Merhi Z O.Challenging cell phone impact on reproduction: a review [J].Journal of Assisted Reproduction and Genetics, 2012, 29(4): 293-297.

2 孟謙謙, 童建.射頻輻射對健康影響的流行病學調(diào)查[J].輻射防護通訊, 2007, 27(5): 15-19.MENG Qianqian, TONG Jian.Epidemiologic investigation on the health effects of radiofrequency radiation [J].Radiation Protection Bulletin, 2007, 27(5):15-19.

3 謝亮, 姜槐, 許正平.移動電話射頻輻射的生物學效應和暴露限值 [J].中華勞動衛(wèi)生職業(yè)病雜志, 2007,25(4): 247-249.XIE Liang, JIANG Huai, XU Zhengping.The biological effects and exposure limits of Mobile phone radiofrequency radiation [J].The Chinese labor health occupational disease, 2007, 25(4): 247-249.

4 Kesari K K, Kumar S, Nirala J,et al.Biophysical evaluation of radiofrequency electromagnetic field effects on male reproductive pattern [J].Cell Biochemistry and Biophysics, 2013, 65(2): 85-96.

5 Kaur G, Thompson L A, Dufour J M.Sertoli cells-Immunological sentinels of spermatogenesis [J].Seminars in Cell and Developmental Biology, 2014, 30:36-44.

6 Lee N P, Cheng C Y.Adaptors, junction dynamics, and spermatogenesis [J].Biology of Reproduction, 2004,71(2): 392-404.

7 郭雪華, 藺勇, 王曄玲, 等.生長因子對人精原干細胞體外存活和增殖的影響 [J].中華男科學雜志, 2008,14(10): 876-878.GUO X H, LIN Y, WANG Y L,et al.Growth factors promote the survival and proliferation of human spermatogonium stem cellsin vitro[J].Zhonghua Nan Ke Xue(in China), 2008, 14(10): 876-878.

8 Wang P, Suo L J, Wang Y F,et al.Effects of GDNF and LIF on mouse spermatogonial stem cells proliferationin vitro[J].Cytotechnology(in China), 2014, 66(2): 309-316.

9 畢聰明, 王珅, 周鐵忠, 等.GDNF和SCF促進小鼠精原干細胞增殖與分化的研究 [J].遼寧醫(yī)學院學報,2009, 30(3): 193-195.BI Congming, WANG Shen, ZHOU Tiezhong,et al.Study on proliferation and diferentiation of spermatogonial stem cells in mouse promoted by GDNF and SCF [J].J Liaoning Medical University, 2009, 30(3):193-195.

10 Huleihel M, Fadlon E, Abuelhija A,et al.Glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) induced migration of spermatogonial cells in vitro via MEK and NF-kB pathways [J].Differentiation, 2013, 86(1-2):38-47.

11 尹明, 李德雪.體外培養(yǎng)條件下SCF、LIF與bFGF對昆明白小鼠精原干細胞增殖的影響 [J].生物工程學報,2002, 18(6): 754-757.YIN Ming, LI De-Xue.Effects of SCF, LIF and bFGF on Mouse Spermatogonial Stem Cells Proliferationin vitro[J].Chinese Journal of biotechnology, 2002, 18(6):754-757.

12 高曉芳, 王水明, 彭瑞云, 等.微波輻射對原代培養(yǎng)睪丸支持細胞的影響 [J].中華勞動衛(wèi)生職業(yè)病雜志,2009, 27(9): 530-533.Gao X F, Wang S M, Peng R Y,et al.Effect of microwave radiation on primary cultured Sertoli cells [J].Chinese Journal of Industrial Hygiene and Occupational Diseases,2009, 27(9): 530-533.

13 吳惠, 王德文, 王水明.不同波段電磁輻射致大鼠睪丸支持細胞的損傷效應 [J].生物物理學報, 2011, 27(1):38-46.WU Hui, WANG Dewen, WANG Shuiming.The damaging effects of different bands electromagnetic radiation on the rat Sertoli cells [J].Acta Biophysica Sinica, 2011, 27(1): 38-46.

14 Celik S, Aridogan I A, Izol V,et al.An evaluation of the effects of long-term cell phone use on the testes via light and electron microscope analysis [J].Urology, 2012,79(2): 346-350.

15 郭國禎, 郭鶴.微波局部照射小鼠睪丸對睪丸, 附睪及精子的形態(tài)學影響 [J].生物醫(yī)學工程學雜志, 1994,11(4): 286-290.GUO Guozhen, GUO Yao.Morphological changes in testis, epididymis and sperm of mice after exposure to microwave radiation [J].Journal of Biomedical Engineering, 1994, 11(4): 286-290.

16 Wu H, Wang D, Shu Z,et al.Cytokines produced by microwave-radiated Sertoli cells interfere with spermatogenesis in rat testis [J].Andrologia(in China),2012, 44(Suppl 1): 590-599.

17 Makar V R, Logani M K, Bhanushali A,et al.Effect of cyclophosphamide and 61.22 GHz millimeter waves on T-cell, B-cell, and macrophage functions [J].Bioelectromagnetics, 2006, 27(6): 458-466.

18 Makar V R, Logani M K, Bhanushali A,et al.Effect of millimeter waves on natural killer cell activation [J].Bioelectromagnetics, 2005, 26(1): 10-19.

19 Derooij D G.The spermatogonial stem cell niche [J].Microscopy Research and Technique, 2009, 72(8):580-585.

20 Feng L X, Ravindranath N, Dym M.Stem cell factor/c-kit up-regulates cyclin D3 and promotes cell cycle progression via the phosphoinositide 3-kinase/p70 S6 kinase pathway in spermatogonia [J].Journal of Biological Chemistry, 2000, 275(33): 25572-25576.

21 Tajima Y, Sawada K, Morimoto T,et al.Switching of mouse spermatogonial proliferation from the c-kit receptor-independent type to the receptor-dependent type during differentiation [J].Journal of Reproduciton and Fertility, 1994, 102(1): 117-122.

22 Meng X, Lindahl M, Hyvonen M E,et al.Regulation of cell fate decision of undifferentiated spermatogonia by GDNF [J].Science, 2000, 287(5457): 1489-1493.

23 胡建新, 孫兆林, 何堅.膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子對體外培養(yǎng)小鼠精原干細胞增殖分化作用的影響 [J].中華泌尿外科雜志, 2010, 31(4): 227-230.HU Jianxin, SUN Zhaolin, HE Jian.Effect of glial cell line-derived neurotrophic factor on mouse spermatogonial stem cellsin vitro[J].Chinese Journal of Urology, 2010,31(4): 227-230.

24 Brouazin-Jousseaume V, Guitton N, Legue F,et al.GSH level and IL-6 production increased in Sertoli cells and astrocytes after gamma irradiation [J].Anticancer Research, 2002, 22(1A): 257-262.

25 Mauduit C, Siah A, Foch M,et al.Differential expression of growth factors in irradiated mouse testes [J].International Journal of Radiation Oncology, Biology,Physics, 2001, 50(1): 203-212.

26 Albuquerque A V, Almeida F R, Weng C C,et al.Spermatogonial behavior in rats during radiation-induced arrest and recovery after hormone suppression [J].Reproduction, 2013, 146(4): 363-376.