劉 丹 郭根燕 趙玉霞 白 露（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院腫瘤放射治療科 沈陽 003)

2（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤放射治療科 沈陽 110001)

肺癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，已經(jīng)成為全球發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤[1]。臨床工作中發(fā)現(xiàn)肺癌患者放療后腫瘤退縮程度明顯不同，主要原因在于肺癌的放射敏感性存在很大的個體差異。DNA是電離輻射的主要靶點，DNA損傷修復(fù)能力的強弱是影響放射敏感性的重要因素，與DNA修復(fù)功能相關(guān)的基因突變、多態(tài)性及表觀修飾均可使放射敏感性出現(xiàn)差異[2]。電離輻射引起的DNA損傷的修復(fù)主要由DNA雙鏈斷裂修復(fù)通路參與[3]。研究發(fā)現(xiàn) LIG4（DNA連接酶4）是DNA雙鏈斷裂修復(fù)通路中一個重要的修復(fù)因子[4-5]。熱休克蛋白B1(Heat shock protein B1, HSPB1)是熱休克蛋白(Heat shock proteins, HSPs)家族中27×103的小分子熱休克蛋白，在DNA修復(fù)方面起著重要的作用[6]。本研究擬探討HSPB1及LIG4基因單核苷酸多態(tài)性與非小細胞肺癌放療腫瘤退縮率的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 病例與材料

本研究所有對象為北方地區(qū)漢族人群，患者之間彼此均無血緣關(guān)系。在簽署知情同意書后，提供外周血標本，同時完成流行病學(xué)調(diào)查。病例來自2009年12月至2011年12月期間，中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院的137名原發(fā)性非小細胞肺癌(Non-small-cell lung cancer, NSCLC)患者，有明確的病理診斷（鱗癌87例，腺癌50例），所有患者行胸部病灶三維適形放射治療(Three-dimensional conformal radiotherapy, 3D-CRT)且具有肺內(nèi)可評估病灶者，放療前及放療20次后測量腫瘤大小。

紅細胞裂解液(3.85 g NH4Cl+0.42 g NaHCO3加雙蒸水至500 mL)；核懸浮液(75 mmol·L?1NaCl、24 mmol·L?1pH=8.0, EDTA)；TE 緩 沖 液(10 mmol·L?1pH=7.5 Tris-HCI、1 mmol·L?1pH=8.0 EDTA )；PCR Taqman 探針及引物（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）；Taqman Master Mix（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）；Eppendorf BioPhotometer核酸蛋白測定儀（德國Eppendoff公司）；低溫離心機（德國Sigma公司）；移液器（法國Gilson公司）；96孔板及蓋膜（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）；ABI 7500熒光定量PCR儀（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）。

1.2 調(diào)查方法

采用統(tǒng)一制定打印的調(diào)查表，由2名培訓(xùn)的調(diào)查員對病例進行流行病學(xué)調(diào)查，調(diào)查內(nèi)容包括每個研究對象詳細的人口學(xué)資料、吸煙史、組織類型、臨床表現(xiàn)和伴發(fā)疾病等。非吸煙者指終生吸煙少于100支的個體。所有參與研究的個體外周血標本采集使用枸櫞酸鈉抗凝試管，每人采血2 mL，在?20 ℃到?80 ℃的冰箱中凍存。腫瘤放射治療方案采用三維適形治療，放療單次劑量2 Gy，5次/周，總劑量(Total dose,DT)達到40 Gy/20次/4周后重新CT定位，觀察腫瘤消退情況，重新制定放療計劃，單次劑量改為2.5 Gy，5次/周，共8次，使腫瘤DT達到60 Gy。腫瘤體積用放射治療計劃系統(tǒng)計算，放療前腫瘤體積(Vpre)，放療40 Gy后的腫瘤體積(Vmid)。用下面的公式計算腫瘤體積退縮率(R)。

所有調(diào)查資料、臨床資料經(jīng)反復(fù)檢查、核對和編碼后，用Excel軟件進行數(shù)據(jù)錄入。

1.3 實驗方法

采用酚-氯仿法集中進行基因組DNA提取，提取后測OD值確定DNA的原始濃度，再倍比稀釋到30?100 ng·μL?1的終濃度備用。采用Taqman real-time PCR方法進行單核苷酸多態(tài)性的基因分型?；蚍中驮贏BI 7500熒光定量PCR儀上進行，擴增條件為：95 ℃預(yù)變性10 min；92 ℃變性30 s，60 ℃退火以及延伸1 min；共47個循環(huán)。以SDS（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）軟件 Allelic Discrimination程序進行終點分析，通過檢測不同等位基因所標記的FAM和VIC熒光強度，判斷待測樣本的基因型。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)比較用t檢驗和方差分析，p＜0.05時認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 非小細胞肺癌病例的一般特征

137例患者，平均年齡60.1±5.33歲，腫瘤平均退縮率為0.3474±0.1910，鱗癌87例，腺癌50例，男102例，女35例，Ⅰ期9例，Ⅱ期26例，Ⅲ期70例，Ⅳ期32例。吸煙95例，吸煙者放療腫瘤退縮率明顯高于非吸煙者，分別為0.3755±0.1775和0.2840±0.2068，t=2.643，p=0.009。性別、病理類型及臨床分期與放療腫瘤退縮率無關(guān)，具體見表1。

表1 非小細胞肺癌病例的一般特征與放療腫瘤退縮率關(guān)系Table 1 The relationship between general character and the ratio of tumor-decreased-size

2.2 LIG4及HSPB1基因單核苷酸多態(tài)性與非小細胞肺癌放療腫瘤退縮率的關(guān)系

LIG4rs1805388的CC、CT和TT基因型放療腫瘤退縮率分別是0.3395±0.1802、0.342±0.2106和0.5038±0.1892，經(jīng)方差分析，F(xiàn)=2.142，p=0.121，3種基因型腫瘤退縮率無統(tǒng)計學(xué)意義。但經(jīng)LSD兩兩比較發(fā)現(xiàn)，TT基因型腫瘤退縮率明顯高于CC基因型，p= 0.041。HSPB1rs2868371 GG、CG和CC基因型放療腫瘤退縮率分別是0.3454±0.1932、0.3487±0.1998和0.3487±0.1652，經(jīng)方差分析和LSD兩兩比較，未發(fā)現(xiàn)3種基因型之間有統(tǒng)計學(xué)差異（見表2）。

表2 LIG4和HSPB1基因單核苷酸多態(tài)性與非小細胞肺癌放療腫瘤退縮率的相關(guān)性Table 2 The relationship among genetic single nucleotide polymorphisms of LIG4 and HSPB1 and the ratio of tumor-decreased-size

3 討論

吸煙是肺癌的主要危險因素，其中男性的歸因風(fēng)險為80%，女性的歸因風(fēng)險為45%[7]。非小細胞肺癌中鱗狀細胞癌與吸煙狀況密切相關(guān)[8]。放射生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)鱗狀細胞癌的放射敏感性高于腺癌細胞。我們的研究得出吸煙者放療腫瘤退縮率明顯高于非吸煙者，p=0.009，有統(tǒng)計學(xué)意義。目前還未見吸煙與非小細胞肺癌放療腫瘤退縮率相關(guān)的其他報道，我們的研究結(jié)果有待大樣本實驗進一步驗證。

非同源末端鏈接(Non-homologous end joining,NHEJ)修復(fù)是哺乳動物細胞中DNA雙鏈斷裂(DNA double-strand breaks, DSBs)修復(fù)的主要途徑。DNA 連接酶 IV及 X-射線修復(fù)交叉互補基因均為NHEJ 修復(fù)通路中的重要基因[9]，影響著腫瘤細胞DNA 損傷后的修復(fù)能力及腫瘤細胞對放療的敏感性[10]。NHEJ修復(fù)主要是通過DNA依賴蛋白激酶(DNA dependent proteinkinase, DNAPK)和XRCC4-LIG4連接復(fù)合體共同完成的[11]。既往的研究[12-13]顯示，XRCC4-LIG4連接復(fù)合體功能喪失嚴重影響DNA斷裂雙鏈的再連接，增強放射敏感性。DNA連接酶4綜合癥是一種罕見的先天性疾病，因LIG4基因突變導(dǎo)致患者對放射線極度敏感[14]。我們的研究顯示LIG4rs1805388的CC、CT和TT基因型放療腫瘤退縮率分別是0.3395±0.1802、0.342±0.2106和0.5038±0.1892，兩兩比較發(fā)現(xiàn)，TT基因型腫瘤退縮率明顯高于CC基因型。從我們的實驗數(shù)據(jù)可推論出攜帶LIG4rs1805388TT基因型非小細胞肺癌患者放療后腫瘤退縮率高，提示對放療敏感。但這仍需要大量的實驗研究去驗證。

熱休克蛋白B1，又稱熱休克蛋白27，是小分子熱休克蛋白(sHSP)亞家族的重要一員。Hsp27蛋白可以通過多種途徑影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，包括維持細胞骨架的正常結(jié)構(gòu)而保證細胞正常生長和存活、調(diào)節(jié)機體內(nèi)谷胱甘肽水平進而提高細胞對氧化應(yīng)激的敏感度[15-16]、抑制內(nèi)源性和外源性細胞凋亡通路、參與DNA損傷的修復(fù)等。研究顯示HSPB1通過下調(diào)炎癥反應(yīng)，增強細胞對放射線抵抗力[17-18]。Zhang等[19]研究顯示鼻咽癌細胞中HSPB1表達上調(diào)，增強鼻咽癌細胞對放射線抵抗力。Guo等[20]研究顯示HSPB11271C 等位基因可通過下調(diào)HSP27表達降低DNA修復(fù)能力，增加肺癌細胞對放化療的敏感性。我們研究結(jié)果顯示HSPB1rs2868371基因的單核苷酸多態(tài)性與非小細胞肺癌放療腫瘤退縮率無關(guān)。目前針對基因的單核苷酸多態(tài)性的研究中，來自不同民族、不同地區(qū)的研究對象可能得到不同、甚至矛盾的結(jié)果，這可能與遺傳因素的地域性和種族性有關(guān)，還有可能是與樣本含量較小有關(guān)，HSPB1rs2868371位點純合突變率較低，小樣本結(jié)果不能達到應(yīng)有的統(tǒng)計效能。所以HSPB1rs2868371單核苷酸多態(tài)性與非小細胞肺癌放療腫瘤退縮率的關(guān)系還有待于進一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)吸煙者和LIG4rs180538TT基因型非小細胞肺癌患者放療腫瘤退縮率高于其他患者，為臨床提高非小細胞肺癌治療療效提供理論依據(jù)。

1 Curado M P, Edwards B, Shin H R.Cancer incidence in five continents [J].Lyon: IARC Press, 2007, 418-799.

2 Parliament M B, Murray D.Single nucleotide polymorphisms of DNA repairs genes as predictors of radioresponse [J].Seminars Radiation Oncology, 2010,20(4): 232-240.

3 Roddam P L, Rollinson S, O’Driseoll M,et al.Genetic variants of NHEJ DNA ligase IV can affect the risk of developing multiple myeloma, a tumour characterized by aberrant class switch recombination [J].Journal of Medieal Geneties, 2002, 39(12): 900-905.

4 Ahnesorg P, Smith P, Jackson S P.XLF interacts with the XRCC4-DNA ligaseIV complex to promote DNA nonhomologous end-joining [J].Cell, 2006, 124(4): 301-313.

5 Sakata K, Someya M, Matsumoto Y,et al.Ability to repair DNA double-strand breaks related to cancer susceptibility and radiosensitivity [J].Radiation Medicine,2007, 25(9): 433-438.

6 Garrido C, Brunet M, Didelot C,et al.Heat shock proteins 27 and 70: anti-apoptotic proteins with tumorigenic properties [J].Cell Cycle, 2006, 5(22): 2592-2601.

7 Rom W N, Hay J G, Lee T C.Molecular and genetic aspects of lung cancer.American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine, 2000, 161(4): 1355-1367.

8 De Stefani E, Boffetta P, Ronco A L,et al.Squamous and small cell carcinomas of the lung: similarities and differences concerning the role of tobacco smoking [J].Lung Cancer, 2005, 47: 1- 8.

9 Ohnishi T, Mori E, Takahashi A.DNA doublestrandbreaks: their production, recognition, and repair in eukaryotes [J].Mutation Research, 2009, 669(1/2): 8-12.

10 Wood R D, Mitchell M, Sgouros J,et al.Human DNA repair genes [J].Science, 2001, 291: 1284-1289.

11 Hefferina M L, Tomkinsonb A E.Mechanism of DNA double-strand break repair by non-homologousendjoining[J].DNA Repair, 2005, 4: 639-648.

12 Ayene I S, Ford L P, Koch C J.Ku protein targeting by Ku70 small interfering RNA enhances human cancer cell response to topoisomerase II inhibitor and gamma radiation [J].Molecular Cancer Therapeutics, 2005, 4(4):529-536.

13 Bertolini L R, Bertolini M, Anderson G B,et al.Transient depletion of Ku70 and Xrcc4 by RNAi as a means to manipulate the non-homologous end-joining pathway [J].Journal of Biotechnology, 2007, 128(2): 246-257.

14 Chistiakov D A, Voronova N V, Chistiakov A P.Ligase IV syndrome [J].European Journal of Medical Genetics,2009, 52(6): 373-378.

15 Mehlen P, Kretz-Remy C, Preville X,et al.Human hsp27,Drosophila hsp27 and human alphaB-crystallin expression-mediated increase in glutathione is essential for the protective activity of these proteins against TNFalpha-induced cell death [J].The Embo Journal, 1996,15(11): 2695-2706.

16 Arrigo A P, Virot S, Chaufour S,et al.Hsp27 consolidates intracellular redoxhomeostasis by upholding glutathione in its reduced form and by decreasing ironintracellular levels [J].Antioxid Redox Signal, 2005,7(3-4): 414-422.

17 Garrido C, Ottavi P, Fromentin A,et al.HSP27 as a mediator of confluence-dependent resistance to cell death induced by anticancer drugs [J].Cancer Research, 1997,57: 2661-2667.

18 Wang G, Kloster gaard J, Khodadadian M,et al.Murine cells transfected with human Hsp27 cDNA resist TNF-induced cytotoxicity [J].J Immunother Emphasis Tumor Immunol, 1996, 19(1): 9-20.

19 Zhang B, Qu J Q, Xiao L,et al.Identification of heat shock protein 27 as a radioresistance-related protein in nasopharyngeal carcinoma cells [J].Cancer Research Clinical Oncology, 2012, 138(12): 2117-2125.

20 Guo H, Bai Y, Xu P,et al.Functional promoter-127G＞C variant of HSBP1 predicts lung cancer risk and survival[J].Journal of Clinical Oncology, 2010, 28(11):1928-1935.