梁亞芳， 苗 亮， 李明云， 趙 亮， 李笑萌， 徐玉敏， 陳 炯

(寧波大學(xué) 海洋學(xué)院， 浙江 寧波 315211)

近年來，隨著排入海洋的陸源污染物總量不斷增加，重金屬污染日趨嚴(yán)重[1-2]。對海洋環(huán)境重金屬離子進(jìn)行快速有效地檢測已成為環(huán)境控制和治理中的重要內(nèi)容。大彈涂魚(Boleophthalmuspectinirostris)為暖水性潮間帶魚類，在中國東南沿海分布廣泛，其食物鏈短、存活力強(qiáng)，研究顯示大彈涂魚的多項(xiàng)生理指標(biāo)對環(huán)境污染物敏感[3-5]。

彗星實(shí)驗(yàn)(Comet assay)又稱單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)(Single cell gel electrophoresis)，是一種通過檢測DNA鏈損傷判別遺傳毒性的技術(shù)[6-7]。該技術(shù)已在檢測環(huán)境污染物對生物的遺傳毒性方面已有較多研究報(bào)道[8-10]。

本研究采用單細(xì)胞凝膠電泳檢測重金屬Pb、Cr對大彈涂魚外周血細(xì)胞的遺傳損傷情況，探討以DNA損傷作為污染暴露生物標(biāo)記的可行性，同時為重金屬脅迫的血液毒理學(xué)以及評估鉛、鉻對海洋生態(tài)系統(tǒng)的影響提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與試劑

實(shí)驗(yàn)用野生大彈涂魚捕自浙江省寧波市鎮(zhèn)海區(qū)澥浦沿海灘涂，體長(10.8±1.2) cm，體重(8.4±2.4) g，在實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)7 d后，選取活潑、無病、表皮無損傷的個體進(jìn)行試驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)用醋酸鉛、重鉻酸鈉及其他試劑均購自生工生物工程(上海)有限公司。

1.2 單細(xì)胞凝膠電泳方法

用肝素鈉處理過的注射器從大彈涂魚尾部動脈取血，每次取樣10尾，用PBS稀釋至106個細(xì)胞/mL。

Pb、Cr溶液分別用醋酸鉛、重鉻酸鈉配制，以國家漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)GB11607-89(鉛≦0.005 mg/L，鉻≦0.05 mg/L)規(guī)定的2種離子最高濃度為標(biāo)準(zhǔn)濃度，每種離子均設(shè)置4個濃度梯度：標(biāo)準(zhǔn)濃度組、低濃度組(標(biāo)準(zhǔn)濃度的10倍)、中濃度組(標(biāo)準(zhǔn)濃度的100倍)和高濃度組(標(biāo)準(zhǔn)濃度的1000倍)。另設(shè)置空白對照組(2種離子濃度均為0)。每組實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3個重復(fù)。外周血細(xì)胞于25℃染毒1 h后，2000 r/min離心5 min收集血細(xì)胞。

參照Singh等[7]的方法進(jìn)行單細(xì)胞凝聚電泳，略加改進(jìn)。采用3層鋪膠法在32×24 mm的蓋玻片上鋪膠，低熔點(diǎn)瓊脂糖和正常熔點(diǎn)的瓊脂糖在鋪膠后的最終濃度保持在0.5%。第一層在預(yù)熱的洗液漂洗過的磨砂載玻片上，滴加100 μL 45℃正常熔點(diǎn)的瓊脂糖，蓋上蓋玻片，4℃冰箱中冷凝10 min。揭去蓋玻片加35℃ 0.5%的混有血細(xì)胞低熔點(diǎn)瓊脂糖85 μL，4℃冰箱中冷凝10 min；最后加90 μL的低熔點(diǎn)瓊脂糖。4℃下，在高鹽裂解液(NaCl 2.5 mol/L，EDTANa2100 mmol/L，Tris-HCl 10 mmol/L，1%十二烷基肌氨酸鈉，臨用前加Trition X-100終濃度為1%，二甲亞砜終濃度為10%)中裂解2 h。裂解后用PBS漂洗3次后放入堿性電泳緩沖液中(EDTANa21 mmol/L，NaOH 300 mmol/L)解旋40 min。電泳工作電流為200 mA，電泳時間45 min。電泳結(jié)束后用pH值7.5的0.4 mol/L的Tris-HCl緩沖液中和15 min后用20 μg/mL的吖啶橙染色15 min，在熒光顯微鏡(NIKON ECLIPSE 80I)下觀察、拍照，根據(jù)CASP軟件獲取的彗星數(shù)據(jù)計(jì)算每個彗星的彗尾長度(Tail Length，TL)、彗尾DNA相對含量(Tail DNA relative%，TD)、尾動量(Tail Moment，TM)和Olive尾動量(Olive Tail Moment，OTm)。用SPSS 13.0軟件分析每種離子不同組間的各項(xiàng)數(shù)據(jù)并進(jìn)行One-way ANOVA檢測，以P<0.05為具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 國標(biāo)濃度的鉛、鉻對大彈涂魚血細(xì)胞遺傳損傷的影響

由圖1可見，空白對照組、Pb國標(biāo)濃度脅迫組和Cr國標(biāo)濃度脅迫組的大彈涂魚血細(xì)胞經(jīng)單細(xì)胞凝膠電泳后均呈較規(guī)則的圓形，未出現(xiàn)明顯的彗星拖尾。與空白對照組相比，Pb國標(biāo)濃度脅迫組和Cr國標(biāo)濃度脅迫組在TL、TD、TM、OTM 4項(xiàng)上均無顯著性差異(P>0.05)，見表1，表明國標(biāo)濃度的Pb和Cr均不會引起大彈涂魚血細(xì)胞遺傳損傷。

圖1 國標(biāo)濃度的Pb、Cr脅迫后大彈涂魚血細(xì)胞彗星圖譜

a—空白對照組； b—Pb脅迫組(0.005 mg/L)； c—Cr脅迫組(0.05 mg/L)。

表1 國標(biāo)濃度的Pb、Cr脅迫后大彈涂魚血細(xì)胞DNA彗星實(shí)驗(yàn)結(jié)果

注：表中數(shù)據(jù)是依據(jù)圖片像素和光密度表示DNA損失程度的彗星測量數(shù)據(jù)，計(jì)算方法詳見CASP軟件說明；同一列各行中字母相同表示差異不顯著(P>0.05)；字母不同表示差異顯著(P<0.05)。下同。

2.2 Pb脅迫對大彈涂魚血細(xì)胞的遺傳損傷

單細(xì)胞凝膠電泳結(jié)果顯示，經(jīng)國標(biāo)10倍、100倍和1000倍濃度的Pb脅迫后，大彈涂魚血細(xì)胞均出現(xiàn)了明顯的彗星拖尾，且隨著Pb濃度升高，彗尾長度增加、熒光強(qiáng)度增大(圖2)表明細(xì)胞DNA受損。CASP軟件測量結(jié)果顯示(表2)，彗星的拖尾長度、尾部DNA百分比和尾動量3個指標(biāo)均隨著Pb濃度的升高而顯著增大(P<0.05)；低濃度組和中濃度組的Olive尾動量均分別顯著大于國標(biāo)組和低濃度組(P<0.05)，而高濃度組的Olive尾動量雖高于中濃度組但差異不顯著(P>0.05)?？梢姼哂趪鴺?biāo)濃度的Pb對大彈涂魚血細(xì)胞有明顯的遺傳損傷，且損傷程度與Pb濃度之間存在“劑量-效應(yīng)”關(guān)系。

圖2 不同濃度的Pb脅迫后大彈涂魚血細(xì)胞彗星圖像

a—低濃度組(0.05 mg/L)； b—中濃度組(0.5 mg/L)； c—高濃度組(5 mg/L)。

表2 不同濃度的Pb脅迫后大彈涂魚血細(xì)胞DNA彗星實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 Cr脅迫對大彈涂魚血細(xì)胞的遺傳損傷

彗星實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大彈涂魚血細(xì)胞在受到國標(biāo)10倍、100倍和1000倍濃度的Cr脅迫后均出現(xiàn)了明顯的彗星拖尾，且彗尾的長度和熒光強(qiáng)度均隨Cr濃度升高而增加(圖3)，表明細(xì)胞DNA受損。經(jīng)CASP軟件測量(表3)，各個濃度組的彗星拖尾長度、尾部DNA百分比、尾動量和Olive尾動量等4個指標(biāo)均隨著Cr濃度的升高而顯著增大(P<0.05)；低濃度組和中濃度組的Olive尾動量均分別顯著大于國標(biāo)組和低濃度組(P<0.05)，表明高于國標(biāo)濃度的Cr對大彈涂魚血細(xì)胞有明顯的遺傳損傷，且損傷程度與Cr濃度之間存在“劑量-效應(yīng)”關(guān)系。

圖3 不同濃度的Cr脅迫后大彈涂魚血細(xì)胞彗星圖像

a—低濃度組(0.5 mg/L)； b—中濃度組(5 mg/L)； c—高濃度組(50 mg/L)。

3 討論

重金屬是非降解的元素型環(huán)境污染物，可引發(fā)生態(tài)系統(tǒng)破壞，進(jìn)入水體后會對生物產(chǎn)生顯著的毒性作用，并且重金屬可在生物體內(nèi)富集，對生物具有致畸、致癌、致死的作用[11]。國內(nèi)外學(xué)者已在重金屬元素引起的海洋污染以及對海洋生物的毒理效應(yīng)和致毒機(jī)制等方面進(jìn)行了大量的研究[12-16]。

表3 不同濃度的Cr脅迫后大彈涂魚血細(xì)胞DNA彗星實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Pb和Cr都是常見的環(huán)境重金屬污染物，其中Pb是人體非必需元素，為抑制積累性毒物，可通過食物鏈傳遞[17-18]。Pb會損害生物的造血功能，誘發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂[19-20]，并會干擾DNA代謝(如DNA斷裂、甲基化異常等)，造成遺傳損傷[20-25]。Cr是一種人類必需元素，在肌體的糖代謝和脂代謝中發(fā)揮特殊作用[26]，但高濃度的Cr也會對細(xì)胞和生物體產(chǎn)生毒害作用[27-29]。

目前關(guān)于Pb和Cr對魚類的影響已有較多研究報(bào)導(dǎo)，如溫茹淑等[29]的研究顯示Pb對草魚魚苗的24、48、72和96 h半致死濃度分別為0.431、0.338、0.375和0.362 mg/L；雷忻等[30]的研究顯示Cr對金魚的24、48、72和96 h半致死濃度分別為387.1、370.9、281.9和200.2 mg/L，并可造成鰓組織的嚴(yán)重?fù)p傷。本研究通過彗星實(shí)驗(yàn)檢測了Pb和Cr對大彈涂魚外周血細(xì)胞的遺傳損傷，結(jié)果顯示重金屬濃度和DNA損傷程度間存在著明顯的“劑量-效應(yīng)”關(guān)系，金春華等[5]的研究也顯示大彈涂魚血細(xì)胞DNA損傷程度與鎘離子濃度間存在“劑量-效應(yīng)”關(guān)系，因此大彈涂魚外周血細(xì)胞的DNA損傷可以作為一種污染暴露的生物標(biāo)記。

唐建勛等[10]的研究顯示Pb可引起泥鰍卵細(xì)胞凋亡和DNA損傷，且存在“劑量-效應(yīng)”關(guān)系，但無“時間-效應(yīng)”關(guān)系；金春華等[5]的研究顯示鎘對大彈涂魚血細(xì)胞的DNA損傷既有“劑量-效應(yīng)”關(guān)系又有“時間-效應(yīng)”關(guān)系。本研究結(jié)果顯示Pb和Cr濃度與大彈涂魚血細(xì)胞DNA損傷程度間均存在明顯的“劑量-效應(yīng)”關(guān)系，而是否存在“時間-效應(yīng)”關(guān)系尚需進(jìn)一步研究。另外，研究顯示不同的重金屬離子間存在協(xié)同作用或拮抗作用[31]，Pb和Cr之間是否有協(xié)同作用或拮抗作用有待于進(jìn)一步研究。

本研究通過彗星實(shí)驗(yàn)顯示重金屬鉛和鉻都會引起大彈涂魚血細(xì)胞DNA的損傷，但尚不清楚這兩種重金屬引起遺傳損傷的機(jī)制以及機(jī)體是否能通過激活自身的DNA修復(fù)系統(tǒng)進(jìn)行損傷修復(fù)。在今后的研究中，將一方面通過H2AX焦點(diǎn)和磷酸化水平[32-33]檢測鉛、鉻脅迫后大彈涂魚細(xì)胞DNA損傷、修復(fù)情況，另一方面通過蛋白質(zhì)組、轉(zhuǎn)錄組研究探討其遺傳損傷機(jī)制[34]，以豐富重金屬鉛、鉻的環(huán)境毒理學(xué)研究資料。

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