李玉芝，陳志海

·專題綜述·

脈沖場凝膠電泳在感染性疾病診治中的應(yīng)用

李玉芝，陳志海

脈沖場凝膠電泳（pulsed-field gelelectrophoresis,PFGE）被視為感染性疾病暴發(fā)疫情中流行病學(xué)關(guān)系分析的“金標(biāo)準(zhǔn)”，目前主要用于細菌性感染性疾病的流行病學(xué)研究及細菌分子分型。在醫(yī)院臨床工作中，PFGE在相關(guān)感染性疾病的臨床診治、院內(nèi)感染的溯源與控制等方面同樣有很好的應(yīng)用前景。本文就PFGE在醫(yī)院臨床工作中的應(yīng)用進行綜述。

電泳，凝膠，脈沖場；傳染??；交叉感染

脈沖場凝膠電泳（pulsed-field gelelectrophoresis,PFGE）是分離大分子線性DNA的電泳技術(shù)。PFGE采用了2個交變電場，即2個方向不同的電場交替開啟和關(guān)閉，使DNA分子的電泳方向隨著電場的變化而改變。每當(dāng)電場方向發(fā)生改變時，大于20 kb的DNA分子就要沿新的電場軸重新定向，適應(yīng)凝膠中不規(guī)則孔隙變化，而后才能繼續(xù)前行。DNA分子越大，這種重新定向所需時間也越長，真正用于前行的時間越短。根據(jù)被分離的DNA分子范圍選擇適當(dāng)?shù)拿}沖時間，如果電泳脈沖周期大于DNA分子的重新定向時間，DNA分子就可以按大小被分離開來。普通瓊脂糖凝膠電泳分離DNA分子的上限是50 kb，而PFGE能分辨高達10mb的DNA分子。

PFGE主要用于感染性疾病的流行病學(xué)研究及細菌分子分型，疾病預(yù)防控制中心（Center for Disease Controland Prevention,CDC）則利用PFGE驗證傳染病的暴發(fā)流行，追溯傳染源及傳播途徑[1]。在醫(yī)院臨床工作中，PFGE在相關(guān)感染性疾病的臨床診治、院內(nèi)感染的溯源與控制等方面同樣有很好的應(yīng)用前景，但目前臨床醫(yī)師對該技術(shù)在臨床方面的應(yīng)用了解較少。本文就PFGE在醫(yī)院臨床工作中的應(yīng)用進行綜述。

1 PFGE在暴發(fā)性感染性疾病和群體性食物中毒臨床診治中的應(yīng)用

作為最早接觸患者的一線臨床醫(yī)師，及早識別并證實感染性疾病及群體性食物中毒的暴發(fā)流行，對感染性疾病的預(yù)防控制有重要意義。同時，PFGE譜型相同的菌株具有相同或相近的致病性和耐藥性[2-3]，筆者對導(dǎo)致腹腔感染的大腸埃希菌的PFGE譜型分析和耐藥性研究中也發(fā)現(xiàn)PFGE譜型相似性大于85%的菌株間耐藥譜相同或相似。在臨床診治上可以相互借鑒，通過總結(jié)先發(fā)病例的診治經(jīng)驗或教訓(xùn)，預(yù)估后續(xù)病例的病程及發(fā)展規(guī)律，優(yōu)化治療方案，提高救治成功率。

2011年5月德國O104：H4疫情中，PFGE的價值得到了完美驗證。德國漢堡市某醫(yī)院一天內(nèi)接診了3例兒童溶血尿毒綜合征（heomlytic uremic syndrome, HUS）患者[4]。此后2個月內(nèi)德國多個地區(qū)出現(xiàn)了數(shù)千例類似患者，主要癥狀有血便、腹痛、嘔吐等，其中很多患者發(fā)生HUS。糞便培養(yǎng)結(jié)果為產(chǎn)志賀毒素的出血性大腸埃希菌O104：H4陽性。Frank等[5]對來自各地的120株分離菌株進行PFGE分析，發(fā)現(xiàn)均具有相同的PFGE譜型，從分子水平證實為同一來源的O104：H4暴發(fā)流行。同時，分離菌株表達相同的毒力因子，具有相同的耐藥特征，感染者HUS發(fā)病率高，為臨床治療提供了較強的理論支持。早期感染者應(yīng)用快速殺菌性抗生素可促進細菌毒素釋放，導(dǎo)致HUS發(fā)病率增高，因此后續(xù)病例不再推薦使用此類抗生素。此次暴發(fā)中部分HUS患者透析治療無效。Lapeyrague等[6]報道了3例HUS重癥患兒，同時給予透析和eculizumab單克隆抗體，均獲得成功。隨后的193例重癥HUS患者使用了透析聯(lián)合eculizumab單克隆抗體治療[7]，表明相同PFGE譜型的細菌感染在臨床診治上相互借鑒，以制訂更完善的診療方案，可提高后續(xù)病例的救治成功率。

同期，美國也出現(xiàn)了6例類似患者[8]。其臨床標(biāo)本中都分離出了與德國PFGE譜型相同的O104：H4菌株，并具有相同的毒力基因和藥物敏感性（藥敏）特點，提示美國與德國病例的菌株來源相同，臨床醫(yī)師可據(jù)此制訂相同的診療方案。

此外，借助PFGE技術(shù)，Longenberger等[9]發(fā)現(xiàn)了一起因牛奶消毒不合格導(dǎo)致的耶爾森菌感染在美國賓夕法尼亞州的流行，美國CDC也曾證實空腸彎曲菌[10]、切斯特沙門菌[11]、海德堡沙門菌[12]及李斯特菌[13]感染的跨州界流行，加拿大Gaulin等[14]亦發(fā)現(xiàn)了李斯特菌感染在魁北克省的流行。

王藝等[15]對深圳市2007—2008年分離出的副溶血弧菌進行PFGE分型分析，發(fā)現(xiàn)該地區(qū)既存在副溶血弧菌感染的暴發(fā)流行，同時也存在散發(fā)流行。張婷等[16]對湖北省2012年分離出的35例霍亂弧菌進行的PFGE分型顯示，同一地區(qū)菌株同源性為100%；不同地區(qū)間同源性為80%～100%，提示不同地區(qū)菌株存在一定變異。目前，PFGE技術(shù)在我國已普及應(yīng)用至省市CDC，但罕有臨床醫(yī)師借鑒PFGE分析結(jié)果，因此須要提高臨床醫(yī)師對PFGE的認知并在臨床診治中進行推廣。

2 PFGE在院內(nèi)感染控制和診治中的應(yīng)用

PFGE分辨率高且重復(fù)性好，為分子分型的“金標(biāo)準(zhǔn)”，也是監(jiān)測和控制院內(nèi)感染的重要分型方法[17]。

2.1 PFGE在多重耐藥銅綠假單胞菌（multidrug-resistant Pseudomonasaeruginosa,MDRP）院內(nèi)感染中的應(yīng)用日本Seki等[18]報道，2004年5—6月大阪一家教學(xué)醫(yī)院8例重癥監(jiān)護病房患者出現(xiàn)MDRP醫(yī)院獲得性感染，患者均接受過經(jīng)食管超聲心動檢查，結(jié)果在超聲心動探頭上分離出2種MDRP，將其進行PFGE譜型分析發(fā)現(xiàn)其PFGE圖譜密切相關(guān)，從而證實這是一起由超聲心動探頭受MDRP污染所致的院內(nèi)感染。醫(yī)院采取相應(yīng)消毒措施后，此后的8年內(nèi)再未發(fā)生MDRP院內(nèi)感染。

2013年，Kiddee等[19]報道泰國一家醫(yī)院MDRP感染疫情，PFGE在確定菌株來源方面發(fā)揮了重要作用。

2.2 PFGE在耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillinresistant Staphylococcusaureus,MRSA）院內(nèi)感染中的應(yīng)用代文霞等[2]報道，2003年10—11月北京兒童醫(yī)院燒傷病房內(nèi)4例患兒發(fā)生MRSA院內(nèi)感染?；純簜诜蛛x的MRSA菌株與從患兒手和鼻腔以及床欄分離的MRSA菌株的PFGE譜型和耐藥譜均相同，而從工作人員手機分離出的MRSA菌株P(guān)FGE譜型與前二者均不同。MRSA可能源于患兒自身攜帶，而與醫(yī)務(wù)人員攜帶菌株無關(guān)。PFGE技術(shù)對闡明MRSA院內(nèi)感染的來源發(fā)揮了決定性作用。

日本Takata等[20]報道，日本一家三級醫(yī)療機構(gòu)對1987—2004年血標(biāo)本分離出的MRSA進行PFGE分型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了104株MRSA流行菌株，33例散發(fā)菌株。

2.3 PFGE在產(chǎn)毒性大腸埃希菌O128：H45新生兒院內(nèi)感染中的應(yīng)用王紅等[3]報道了一起經(jīng)PFGE證實的產(chǎn)毒性大腸埃希菌O128：H45所致的新生兒院內(nèi)感染暴發(fā)。2012年6月，我國四川省某醫(yī)院新生兒科在短期內(nèi)收治了多例癥狀相似的腹瀉新生兒，主要表現(xiàn)為水樣便、發(fā)熱及嘔吐。從患兒糞便標(biāo)本及醫(yī)院環(huán)境標(biāo)本中分離出13株大腸埃希菌O128：H45和1株O55。O128：H45菌株間藥敏結(jié)果相同，而與O55耐藥譜明顯不同。PFGE譜型分析顯示13株大腸埃希菌O128：H45譜型相似性高于95%，為同一克隆菌株。O55菌株與13株大腸埃希菌O128：H45譜型相似性低于80%，非同一克隆菌株。通過詢問流行病學(xué)史得知大部分患兒腹瀉前48 h內(nèi)曾到市婦幼保健院就診，提示可能在婦幼保健院院內(nèi)感染大腸埃希菌。

2.4 PFGE在其他院內(nèi)感染中的應(yīng)用PFGE亦被應(yīng)用于多重耐藥菌院內(nèi)感染的研究，如宣迎梅[21]報道多重耐藥鮑曼不動桿菌院內(nèi)感染、Yu等[22]報道多重耐藥肺炎克雷伯桿菌院內(nèi)感染、Sun等[23]報道耐萬古霉素腸球菌院內(nèi)感染等。PFGE也可用于非耐藥菌院內(nèi)感染的監(jiān)測，如Chiang等[24]和Merkier等[25]報道的黏質(zhì)沙雷菌院內(nèi)感染，MacFarquhar等[26]報道的鏈球菌院內(nèi)感染。

PFGE用于院內(nèi)感染監(jiān)測，可判斷有無院內(nèi)感染流行，亦可協(xié)助判斷院內(nèi)感染源頭及傳播途徑，為采取相應(yīng)控制措施提供依據(jù)。

3 PFGE在復(fù)發(fā)性細菌感染診治中的應(yīng)用

對于同一部位連續(xù)多次發(fā)生同種細菌感染，PFGE分型顯示譜型相同者為感染復(fù)發(fā)，藥敏結(jié)果多與上次感染相同，可采用相同抗生素治療；若PFGE譜型不同，則為新發(fā)感染。Luo等[27]對復(fù)發(fā)性尿路感染研究發(fā)現(xiàn)，52%的復(fù)發(fā)性大腸埃希菌泌尿系統(tǒng)感染為初次感染菌株持續(xù)存在，38%為非初次感染菌株。筆者在對導(dǎo)致腹腔感染的大腸埃希菌PFGE譜型的分析研究中發(fā)現(xiàn)，同一患者2次自發(fā)性細菌性腹膜炎（spontaneousbacterialperitonitis,SBP）分離出的大腸埃希菌同源性為97.4%，分離時間間隔28 d；另一位患者2次SBP分離到的大腸埃希菌同源性為76.9%，分離時間間隔6個月。提示一次SBP可能是新發(fā)感染，也可能是上一次SBP的致病菌未徹底清除，引起的感染復(fù)發(fā)。感染復(fù)發(fā)時2次感染的時間間隔較新發(fā)感染和上一次感染的時間間隔短。

4 PFGE在感染性疾病臨床診治中應(yīng)用的展望

PFGE為大片段DNA的分離技術(shù)，因而不適用于病毒分型。有關(guān)PFGE在真菌感染中應(yīng)用的報道很少，目前主要用于細菌分子分型。值得注意的是，并非每種遺傳改變均可在PFGE圖譜上得到反映，須結(jié)合其他分子分型的方法如多位點序列分析等，以及細菌學(xué)證據(jù)如血清型、耐藥性等進行綜合分析。

總之，PFGE在院內(nèi)感染性疾病的診治、感染性疾病的新發(fā)與復(fù)發(fā)鑒定、耐藥性預(yù)測等多方面均有應(yīng)用價值，應(yīng)引起臨床醫(yī)師和醫(yī)院管理部門的重視。

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（2014-03-12收稿 2014-05-22修回）

（責(zé)任編委 曲 芬 本文編輯 王 姝）

App lication of pulsed-field gel electrophoresis to the diagnosis and treatment of infectious diseases

LIYu-zhi,CHEN Zhi-hai*
Beijing Ditan Hospital,Capital Medical University,Beijing 100015,China
*Correspondingauthor,E-mail:chenzhihai0001@126.com

Pulsed-field gel electrophoresis(PFGE)is used as'gold standard'in the epidemiological analysis of outbreak of infectious diseases,and ismainly applied in the study of epidemiology of bacterial infectious diseases and molecular subtyping.PFGE also has a good prospect in clinical diagnosis and treatment of related infectious diseases,source tracking and control of nosocomial infections and so on.This review focuses on the application of PFGE to clinical practice.

electrophoresis,gel,pulsed-field;communicable diseases;cross infection

R446.112

A

1007-8134(2014)05-0308-03

北京市衛(wèi)生系統(tǒng)高層次衛(wèi)生技術(shù)人才培養(yǎng)計劃（2011-3-079）

100015，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院（李玉芝、陳志海）

陳志海，E-mail:chenzhihai0001@126.com