劉玉潔，劉軍花，許婷婷，朱偉云，毛勝勇

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，江蘇 南京210095）

瘤胃酸中毒是一種在反芻動(dòng)物生產(chǎn)中發(fā)生率較高的營(yíng)養(yǎng)代謝病，尤以高產(chǎn)奶牛和育肥牛最為常見，其主要誘因?yàn)閯?dòng)物采食過多精飼料或飼料中精粗飼料搭配不合理導(dǎo)致［1］。瘤胃酸中毒可損傷瘤胃上皮屏障，增加腸道通透性，激發(fā)宿主炎癥應(yīng)答，誘發(fā)腸炎等營(yíng)養(yǎng)代謝病，導(dǎo)致動(dòng)物生產(chǎn)性能下降，給畜牧生產(chǎn)帶來極大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，探索有助于在高精料條件下保持瘤胃上皮屏障的正常生理功能的措施，對(duì)于保障動(dòng)物生產(chǎn)性能的發(fā)揮及提高動(dòng)物福利皆具有重要理論價(jià)值與應(yīng)用意義。

谷氨酰胺（glutamine，Gln）是血液循環(huán)和組織內(nèi)游離氨基酸池中含量最豐富的一種氨基酸，Gln可為上皮細(xì)胞提供能源物質(zhì)，具有維持機(jī)體酸堿平衡、促進(jìn)氮平衡、保持腸黏膜完整、維持緊密連接蛋白的完整性、促進(jìn)免疫細(xì)胞的增殖和防止細(xì)菌移位和腸道毒素血癥的功能［2］。在人和單胃動(dòng)物腸道營(yíng)養(yǎng)上的研究顯示，Gln可改善患者全身免疫功能和營(yíng)養(yǎng)代謝狀態(tài)［3］，降低大鼠炎癥介質(zhì)TNF－α、IL－6和內(nèi)毒素水平［4］，可快速逆轉(zhuǎn)大鼠燒傷后緊密連接結(jié)構(gòu)蛋白o(hù)ccludin、ZO－1表達(dá)下降，上調(diào)腸黏膜的屏障功能［5］。在反芻動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)中的研究表明，Gln可為瘤胃上皮提供能量［6］，可提高犢牛小腸黏膜中DNA、RNA及蛋白質(zhì)的含量，提高小腸黏膜細(xì)胞的生長(zhǎng)速度［7］。借鑒Gln在上述人、單胃和反芻動(dòng)物胃腸道營(yíng)養(yǎng)領(lǐng)域中的相關(guān)進(jìn)展，本研究提出如下假說：日糧中添加Gln可降低高精料對(duì)瘤胃上皮生理結(jié)構(gòu)的損傷，在一定程度上改善受損瘤胃上皮的屏障功能。由此，本試驗(yàn)擬利用飼喂高精料日糧的奶山羊?yàn)槟Ｐ蛣?dòng)物，研究添加Gln對(duì)山羊瘤胃發(fā)酵、瘤胃上皮形態(tài)結(jié)構(gòu)、炎癥因子及緊密連接蛋白表達(dá)的影響，以期為Gln在奶牛養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)，為調(diào)控瘤胃上皮屏障的生理功能提供新思路。

1 材料與方法

實(shí)驗(yàn)于2012年1－4月在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物房進(jìn)行。

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及日糧

選用12頭健康、體重相近的2.5歲的經(jīng)產(chǎn)薩能奶山羊母羊（41.5±0.8kg），統(tǒng)一驅(qū)蟲、單欄飼養(yǎng)。日糧按NRC標(biāo)準(zhǔn)配制（表1），精粗比為7∶3。山羊的采食量預(yù)設(shè)為1.3kg干物質(zhì)。每日飼喂兩次（8：00和17：30），每次等量飼喂，自由飲水。按常規(guī)手術(shù)方法安裝永久性瘤胃瘺管。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用隨機(jī)區(qū)組實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，分別將12頭奶山羊隨機(jī)分為兩組，即不添加Gln的對(duì)照組和添加過瘤胃Gln（50 g/d）的處理組，每處理設(shè)6個(gè)重復(fù)。實(shí)驗(yàn)期共29d，分別于第7，14，21，28天晨飼前（0h）和晨飼后（4h）采集瘤胃液。過瘤胃Gln由浙江康德全公司生產(chǎn)。

表1 日糧配方及營(yíng)養(yǎng)水平Table 1 Ingredient and nutrient levels of the diets

1.3 樣品采集

在上述各取樣時(shí)間點(diǎn)，利用自制負(fù)壓裝置，分別從12頭奶山羊瘤胃瘺管各采集150mL瘤胃液，所采瘤胃液經(jīng)4層紗布過濾后，將濾液置于潔凈的燒杯中，混合均勻后，立即測(cè)定瘤胃液pH，而后將瘤胃液轉(zhuǎn)入離心管中，－20℃凍存，備測(cè)揮發(fā)性脂肪酸濃度。在實(shí)驗(yàn)期的第29天屠宰山羊后，迅速采集瘤胃腹囊部的上皮組織樣，用冰磷酸緩沖液清洗干凈后，將上皮組織分成3等份，第1份于液氮保存，用于RNA抽提；第2份用2.5%戊二醛固定，用于掃描和透射電鏡觀察；第3份用4%多聚甲醛固定，用于石蠟切片。

1.4 指標(biāo)測(cè)定及方法

1.4.1 瘤胃發(fā)酵參數(shù)的測(cè)定 采用比色法測(cè)定瘤胃液乳酸濃度［8］，采用氣相色譜法（GC－14B氣相色譜儀，日本，柱溫110℃，氣化室溫度180℃，檢測(cè)室溫度180℃）測(cè)定揮發(fā)性脂肪酸濃度［9］。

1.4.2 組織切片的處理 用4% 多聚甲醛固定，洗滌、酒精梯度脫水、浸蠟、包埋、切片、帖片、脫蠟復(fù)水、蘇木精－伊紅染色、封固，在光鏡下觀察瘤胃上皮形態(tài)的變化。

1.4.3 電鏡樣品的處理 用冰磷酸緩沖液反復(fù)清洗樣品，2.5% 的戊二醛固定后，磷酸緩沖液清洗，采用乙醇脫水后，冷凍干燥儀干燥樣品，用離子濺射儀鍍膜，掃描電子顯微鏡進(jìn)行觀察（S－3000N，日本，HITACHI）。透射電鏡實(shí)驗(yàn)中的樣品前處理與掃描電鏡預(yù)處理一致，綴以1%的鋨酸固定，乙醇梯度脫水，用丙酮置換后，浸漬、包埋、聚合，修塊使樣品表面積小于0.2mm×0.2mm，超薄切片，經(jīng)鈾染色與鉛染色清洗后，透射電子顯微鏡（H－7650，日本，HITACHI）進(jìn)行觀察。

1.4.4 炎癥因子及緊密連接蛋白表達(dá)量的測(cè)定 瘤胃上皮的總RNA的提取參照Chomczynski和Sacchi［10］，采用微量分光光度計(jì)（NANODROP 1000）測(cè)定總RNA濃度和純度。RNA反轉(zhuǎn)錄條件與引物參照Liu等［11］的文獻(xiàn)，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于－20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩２捎脤?shí)時(shí)熒光定量PCR儀（StepOnePlusTMReal－Time PCR System，Ap－plied Biosystems，美國(guó)）評(píng)估腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor alpha，TNF－α）、γ干擾素（interferon－γ，IFN－γ）、白介素－1β（interleukin－1β，IL－1β）、白介素－6（interleukin－6，IL－6）、白介素－10（interleukin－10，IL－10）、緊密連接蛋白o(hù)ccludin、claudin－1、claudin－4和ZO－1（zonula occludens－1）mRNA 的相對(duì)表達(dá)水平，基因表達(dá)量采用2－△△Ct法進(jìn)行處理。

1.5 數(shù)據(jù)處理

瘤胃pH、揮發(fā)性脂肪酸（volatile fatty acid，VFA）和乳酸濃度采用SPSS（SPSS version 18.0，Chicago，IL）軟件的混合模型統(tǒng)計(jì)，統(tǒng)計(jì)模型為：Xij＝μ＋Ti＋Pj＋T×Pij＋eij，式中，μ為常數(shù)項(xiàng)，各自變量均為0時(shí)Xij的平均數(shù)，Ti為日糧處理（i＝1～2），Pj為采樣期（i＝1～4），T×Pij為處理與采樣期間（period）的互作效應(yīng)，各采樣時(shí)間點(diǎn)（Time）為重復(fù)因子，eij為隨機(jī)效應(yīng)。瘤胃上皮中炎癥因子與緊密連接蛋白表達(dá)數(shù)據(jù)采用Independent T－test進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。將顯著性水平置于P＜0.05，0.05≤P＜0.1表示處理間存在統(tǒng)計(jì)趨勢(shì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 高精料日糧中添加谷氨酰胺對(duì)奶山羊瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

與對(duì)照組相比，添加Gln降低了瘤胃液中丙酸濃度（P＝0.004），有降低乳酸（P＝0.078）和提高丁酸（P＝0.059）濃度的趨勢(shì)，但對(duì)乙酸、異丁酸、戊酸、異戊酸和總揮發(fā)性脂肪酸濃度無顯著影響（P＞0.05），添加谷氨酰胺顯著提高了乙酸與丙酸的比值（P＜0.001）。除戊酸外（P＝0.103），采樣各期對(duì)揮發(fā)性脂肪酸有顯著影響（P＜0.01），除乙酸外（P＝0.022），采樣期與日糧間無顯著的互作效應(yīng)（P＞0.05）（表2）。

表2 高精料日糧中添加谷氨酰胺對(duì)奶山羊瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響Table 2 The effects of glutamine addition on ruminal fermentation parameters of dairy goats fed high grain diet

2.2 高精料日糧中添加谷氨酰胺對(duì)瘤胃上皮形態(tài)的影響

光學(xué)顯微鏡的結(jié)果表明，對(duì)照組角質(zhì)層的邊緣細(xì)胞發(fā)生破裂（圖1A），而Gln組角質(zhì)層的細(xì)胞完整（圖1B）；掃描電鏡觀察可見，對(duì)照組瘤胃上皮出現(xiàn)大面積的坍塌（圖1C），Gln組角質(zhì)層有更深更長(zhǎng)的裂隙（圖1D）。透射電鏡觀察顯示，對(duì)照組細(xì)胞間的連接不緊密，呈彌散狀（圖1E），Gln處理組細(xì)胞間的連接緊密（圖1H）；對(duì)照組的顆粒層細(xì)胞核萎縮，甚至空泡無核（圖1F），Gln組細(xì)胞核呈卵圓形，無空泡（圖1I）；對(duì)照組的基底層細(xì)胞萎縮，富含大量角質(zhì)化顆粒（圖1G），而Gln處理組的基底層細(xì)胞呈立方形，結(jié)構(gòu)完整（圖1J）。

2.3 高精料日糧中添加谷氨酰胺對(duì)奶山羊瘤胃上皮炎癥因子基因表達(dá)的影響

由表3可見，添加谷氨酰胺顯著降低了奶山羊瘤胃上皮TNF－αmRNA的表達(dá)量（P＜0.05），但對(duì)瘤胃上皮內(nèi)IFN－γ、IL－1β、IL－6和IL－10mRNA的相對(duì)表達(dá)量無顯著影響（P＞0.05）。

圖1 谷氨酰胺對(duì)瘤胃上皮形態(tài)的影響Fig.1 The effect of glutamine addition on changes in histomorphology of rumen epithelia

表3 高精料日糧中添加谷氨酰胺對(duì)奶山羊瘤胃上皮中炎癥因子mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響Table 3 Effect of glutamine supplementation on the mRNA relative expression of inflammatory cytokine of rumen epithelium in dairy goats fed the high grain diet

2.4 高精料日糧中添加谷氨酰胺對(duì)奶山羊瘤胃上皮緊密連接蛋白mRNA表達(dá)量的影響

由表4可見，高精料日糧中添加Gln對(duì)緊密連接蛋白claudin－1、claudin－4、ZO－1mRNA 的表達(dá)量無顯著影響（P＞0.05），但添加Gln可顯著提高瘤胃上皮occludin mRNA的表達(dá)量（P＜0.05）。

3 討論

瘤胃是反芻動(dòng)物免疫系統(tǒng)的重要組成部分，瘤胃上皮屏障在維持離子吸收所必需的濃度梯度，以及在阻止瘤胃微生物、脂多糖和其他毒物因子的移位方面起著重要屏障作用［12］，飼喂高精料可導(dǎo)致瘤胃上皮角質(zhì)層出現(xiàn)坍塌［13］，細(xì)胞間的連接受損，間隙變大，顆粒層的厚度減少［14］，最終使瘤胃上皮屏障受損，瘤胃內(nèi)的內(nèi)毒素發(fā)生移位。內(nèi)毒素進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)后，通過致宿主炎癥應(yīng)答，導(dǎo)致動(dòng)物生產(chǎn)性能下降，乳品質(zhì)降低［15］，給畜牧生產(chǎn)造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失。在本研究中，對(duì)照組中瘤胃上皮緊密連接受損，胞內(nèi)間隙變大，顯示瘤胃上皮的正常屏障結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，該結(jié)果達(dá)到了預(yù)期實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，也與上述報(bào)道一致。

表4 高精料日糧中添加谷氨酰胺對(duì)奶山羊瘤胃上皮緊密連接蛋白mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響Table 4 The effect of glutamine addition on the tight junction mRNA relative expression levels of rumen epithelium in dairy goats fed high grain diet

研究表明，當(dāng)動(dòng)物處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，體內(nèi)新合成的Gln不能滿足機(jī)體的需要，Gln的不足會(huì)導(dǎo)致絨毛萎縮，黏膜潰瘍，小腸細(xì)胞壞死，而添加Gln有利于維持腸上皮結(jié)構(gòu)完整［2］。本研究中，對(duì)照組的瘤胃上皮連接受損；但添加Gln組的山羊瘤胃上皮超微結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞間連接緊密、界限清晰，胞核完整。結(jié)果說明添加過瘤胃Gln可維持瘤胃上皮結(jié)構(gòu)完整，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與單胃動(dòng)物上的結(jié)果基本一致。

緊密連接是瘤胃上皮屏障中的重要結(jié)構(gòu)，對(duì)維持上皮細(xì)胞極性、調(diào)節(jié)上皮屏障的通透性和阻止瘤胃細(xì)菌、內(nèi)毒素和其他毒性大分子物質(zhì)進(jìn)入體內(nèi)發(fā)揮著重要作用［16］。體外研究發(fā)現(xiàn)，caco－2細(xì)胞在缺乏Gln時(shí)，導(dǎo)致claudin－1和occludin的表達(dá)量下降，二者在細(xì)胞間重新排布［17］；而采用Gln處理可顯著減緩乙醛誘導(dǎo)的人結(jié)腸黏膜中細(xì)胞間連接的occludin和ZO－l重新分布［18］。本研究表明，補(bǔ)充Gln能逆轉(zhuǎn)緊密連接蛋白o(hù)ccludin表達(dá)的下降，其機(jī)制可能與Gln降低了炎癥因子的生成有關(guān)。在山羊上的研究顯示，瘤胃上皮組織中炎性細(xì)胞因子TNF－α、IFN－γmRNA的表達(dá)量與緊密連接蛋白表達(dá)量呈顯著相關(guān)［11］。對(duì)三硝基苯磺酸誘導(dǎo)結(jié)腸炎的小鼠給予Gln處理，發(fā)現(xiàn)Gln可減輕TNF－α的產(chǎn)生、釋放［19］。此外，前人研究表明，通過皺胃灌注Gln，可提高奶牛血漿中Gln含量［20］。因此，本實(shí)驗(yàn)中，添加的過瘤胃Gln在腸道吸收后，通過血液循環(huán)可進(jìn)入瘤胃上皮系統(tǒng)。在小鼠和豬上的研究表明，Gln可降低炎癥反應(yīng)［19，21］。在奶牛的研究顯示，應(yīng)用Gln可提高宿主的免疫應(yīng)答［22－23］。由此，進(jìn)入瘤胃上皮系統(tǒng)的Gln可通過降低上皮組織中的炎癥反應(yīng)，削弱炎癥因子對(duì)上皮屏障的損傷，從而維持瘤胃上皮超微結(jié)構(gòu)的功能。增強(qiáng)的上皮屏障可阻止病原菌及內(nèi)毒素等致炎因子進(jìn)入血液，從而進(jìn)一步降低瘤胃內(nèi)源性毒物因子導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)，該推測(cè)也與實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。本研究中，促炎癥因子TNF－αmRNA表達(dá)量顯著降低，同時(shí)谷氨酰胺組瘤胃上皮結(jié)構(gòu)完整。上述結(jié)果說明，高精料日糧中添加Gln可下調(diào)瘤胃上皮中部分炎癥因子的表達(dá)，降低高精料日糧對(duì)瘤胃上皮屏障的損傷。

本研究中，添加Gln降低了瘤胃液中丙酸和乳酸濃度，提高了丁酸濃度，其結(jié)果可能與Gln間接影響了瘤胃內(nèi)揮發(fā)性脂肪酸的排空、瘤胃上皮內(nèi)VFA的代謝及瘤胃微生物區(qū)系平衡等有關(guān)。在瘤胃中，VFA的排空主要通過瘤胃上皮吸收與瘤胃向網(wǎng)胃的流動(dòng)實(shí)現(xiàn)。瘤胃上皮的吸收主要有自由擴(kuò)散及載體轉(zhuǎn)運(yùn)兩種方式。在本研究中，丙酸含量降低可能與瘤胃上皮的吸收加快有關(guān)。在正常生理下，丙酸是反芻動(dòng)物體內(nèi)的主要糖前體物，機(jī)體可能通過加快對(duì)其的吸收來滿足機(jī)體的正常代謝，結(jié)果導(dǎo)致瘤胃內(nèi)丙酸濃度下降。丁酸作為一類重要的細(xì)胞能源物質(zhì)，能夠抑制瘤胃上皮的凋亡，促進(jìn)瘤胃上皮的增殖［24－25］。在正常生理?xiàng)l件下，瘤胃上皮細(xì)胞內(nèi)丁酸濃度是非常穩(wěn)定的，但在病理?xiàng)l件下，機(jī)體常通過補(bǔ)償代謝以最大程度的維持細(xì)胞的完整性［14］。本實(shí)驗(yàn)中，對(duì)照組的上皮結(jié)構(gòu)被破壞，瘤胃上皮的凋亡速度加快，機(jī)體為最大程度的維持上皮結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，需要大量的能量以促進(jìn)瘤胃上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)，這可能引起瘤胃中丁酸的吸收速度加快，從而導(dǎo)致對(duì)照組中瘤胃內(nèi)丁酸濃度低于Gln組。本研究中，乳酸含量的變化可能與瘤胃內(nèi)的微生物群體變化相關(guān)，但由于本研究未進(jìn)一步研究瘤胃中乳酸利用菌的變化，該方面的具體機(jī)制尚不清楚。但本研究結(jié)果顯示，添加Gln可改變瘤胃內(nèi)部分VFA的濃度和發(fā)酵方式（乙丙比發(fā)生改變），其機(jī)制可能與Gln間接影響了瘤胃上皮生理功能及瘤胃內(nèi)環(huán)境等有關(guān)。

4 結(jié)論

在飼喂高精料的奶山羊日糧中添加過瘤胃Gln可維持瘤胃上皮形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，降低瘤胃上皮的炎癥反應(yīng)，改善緊密連接，并在一定程度上影響瘤胃內(nèi)VFA的組成。結(jié)果說明，日糧中應(yīng)用過瘤胃Gln有助于降低高精料對(duì)瘤胃上皮屏障功能的損傷。

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