李西,吳亞嬌,孫凌霞
(四川農(nóng)業(yè)大學風景園林學院,四川 成都611130)
隨著人類社會的不斷進步和工業(yè)化進程的加快,環(huán)境污染成了日益突出的重要生態(tài)問題之一,由于重金屬在環(huán)境中只存在價態(tài)的轉化,而且不能被微生物降解,具有隱蔽性、長期性、滯后性和不可逆性的特點,因此,土壤重金屬污染已成為當前環(huán)境科學界普遍關注的重大環(huán)境問題[1-3]。其中在土壤重金屬污染中,鉛污染尤其突出,污染土壤中的鉛不僅會對植物、動物及微生物造成機體損害,而且也嚴重影響了整個生態(tài)系統(tǒng)的進行[4-6]。
國內外研究發(fā)現(xiàn),在鉛脅迫下,植物在形態(tài)學上的反應表現(xiàn)為根系生物量的減少及形態(tài)的變化,地上部生長速度減緩,植物失水萎蔫[7-9],而在生理生化方面表現(xiàn)為根系活力的降低[10],葉綠素含量的降低[11],細胞膜透性急劇增加[12],體內的保護酶系統(tǒng)修復功能減弱降低[13-14]。目前的研究認為植物防御鉛脅迫通過3種機制:第1種是通過細胞壁對鉛進行沉淀、區(qū)隔化,從而阻止鉛離子進入原生質傷害細胞[15-16];第2種耐性機制是通過激活自身的抗氧化系統(tǒng)來抵御活性氧對細胞的傷害[17-18]。第3種耐性機制是利用植物體內的螯合肽或根系分泌物如檸檬酸同鉛形成的無毒的可溶性絡合物,從而通過抑制鉛的跨膜運輸,來降低鉛的活性及移動性[19-20]。為降低鉛污染物質的危害,不少學者利用各種植物的特殊功能在凈化和改良受污染環(huán)境方面已做了大量的研究工作。目前鉛污染土壤植物修復技術一個主要措施是通過外施螯合劑如EDTA,進而提高植物從土壤中轉移鉛的效率[20]。
草坪和地被植物具有生長速度快、生物量大、再生能力強、易于種植等特點,可以迅速覆蓋和綠化受鉛污染的區(qū)域,因此篩選耐鉛性強或有鉛富集能力的草坪植物對鉛污染區(qū)域的生態(tài)恢復具有重要的意義[21]。假儉草(Eremochloaophiuroides)、狗牙根(Cynodondactylon)和結縷草(Zoysiajaponica)是我國草坪綠化常用的草坪植物,因其具有植株低矮、質地纖細、色澤好等優(yōu)點,被國內外廣泛用于建植運動場、公園、墓地及固土護坡。目前這3種草在鉛脅迫下的生理反應還未見報道?;谝陨媳尘埃驹囼炓栽?種暖季型草坪草——假儉草、狗牙根、結縷草為研究對象,采用盆栽控制法,研究不同濃度的鉛對3種草坪草生理過程的影響,進而分析與比較3種草坪草的抗鉛能力,為受鉛污染區(qū)域的草坪綠地建設規(guī)劃、生物修復提供一定的參考依據(jù)。
供試的草坪材料分別為假儉草品種 “Common”,狗牙根品種“百慕大”和結縷草品種“美依一代”,草種購于江蘇新泰種業(yè)批發(fā)有限公司。2013年4月播種于直徑37.5cm圓形塑料花盆中,栽培基質為混合沙土(V土∶V沙∶V營養(yǎng)土=2∶2∶1),每盆裝15kg基質土壤,人工除去盆中的雜草。待草坪草正常生長2個月并成坪后,設定草坪草修剪高度為10cm,進行盆栽控制試驗。
土壤鉛污染處理設置6個濃度梯度,分別為0,250,500,1000,2000和4000mg/kg,每個處理水平重復3次。所用花盆直徑為37.5cm,按每盆土壤15kg重(干重),計算各Pb2+濃度所需的Pb(NO3)2質量,配成Pb(NO3)2溶液一次性澆灌,同時采用NH4NO3溶液平衡對照與各處理的氮素營養(yǎng)。自處理后,根據(jù)每盆土壤水分狀況,每隔3~5d等量澆入去離子水,底部滲出水分倒回盆內,以避免Pb2+的流失。除根系和地上部生物量外,其余各項生理指標分別于處理后0,5,10,15,20,25和30d測量。
1.3.1 草坪外觀質量評定 目測法[21],參照美國 NTEP的標準(1~9),最好質量為9.0級,最差為1.0級,6.0級為最低可接受的草坪質量。以草坪的色澤、密度、質地、均一性進行綜合評分。
1.3.2 草坪根系和地上部生物量測定 用于生物量測定的3種草坪草于2014年2月份進行了鉛脅迫處理。將培養(yǎng)在以蛭石為基質,用Hoagland營養(yǎng)液澆灌的3種草坪草(生長期為1個月)為試驗材料,按上述5個脅迫濃度加入營養(yǎng)液中,整個試驗期間營養(yǎng)液每24h換1次,以免營養(yǎng)液濃度和處理的重金屬離子濃度稀釋淡化。鉛脅迫15d后對整個花盆(花盆直徑為37.5cm)中的草坪草進行地上部和根系的生物量測定。地上部采用刈割法[22]齊地面刈剪,取地上部材料,在65℃烘箱內烘干至恒重,并稱量。根系生物量測定時將花盆中的蛭石洗掉,取出所有根系,在65℃烘箱內烘干至恒重,并稱量。與地上部生物量測量同時進行。
1.3.3 測定的生理指標及其測定方法 葉片相對含水量(RWC):參照張志良[23]的方法并改進,隨機剪取草坪葉片,吸干表面水分,稱其鮮重(Wf);然后去離子水中浸泡5h,稱其飽和重(Wt);最后在105℃的烘箱中殺青30 min,80℃烘干24h后稱其干重(Wd)。計算公式:葉片相對含水量(%)=[(Wf-Wd)/(Wt-Wd)]×100。
葉片電導率:每個處理分別稱取等量葉片0.2g,用去離子水沖洗干凈,剪成1cm的小段置于試管中,用已測初電導率值(E0)的去離子水10mL在黑暗條件下浸泡24h后,測外滲液的電導率(El),之后封口沸水浴15min,冷卻至室溫測電導率(E2),計算公式:相對電導率(%)=100×(E1-E0)/(E2-E0)。
葉綠素含量:采用分光光度計法,用95%無水乙醇浸提[24],于波長663,646和470nm下測定吸光值。
過氧化物酶(peroxidase,POD)活性:采用愈創(chuàng)木酚法[25],將每分鐘 OD(optical density,光密度)增加0.01定義為1個酶活力單位。
過氧化氫酶(catalase,CAT)活性:采用紫外分光光度法[26],將每分鐘OD降低0.1為1個酶活力單位。
超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性:采用氮藍四唑法[25],以抑制氮藍四唑光化還原50%的酶量為1個酶活單位。
采用Excel 2010和SPSS(12.0版)進行One-way ANOVA方差分析和繪圖。
草坪目測質量是衡量草坪植物生長狀態(tài)最直觀的指標,3種草坪草在鉛脅迫下的目測質量變化如圖1。隨著鉛脅迫濃度的升高,3種草坪草目測質量都逐步下降。在低濃度鉛250mg/kg脅迫下,在整個實驗階段期間,3種草坪草的目測質量同對照相比輕微下降,在500mg/kg脅迫下,同對照相比,處理后第10天結縷草和假儉草的目測質量下降顯著,而狗牙根在處理后第20天時才呈現(xiàn)下降(P<0.05)。在鉛處理濃度1000,2000和4000 mg/kg下,同對照相比,在脅迫后整個實驗期間,3種草的目測質量比對照顯著下降(P<0.05)。在1000和2000 mg/kg下,3種草的目測質量下降趨勢基本相同,在鉛脅迫后第20天目測質量最差,隨后目測質量有所回升。而在4000mg/kg的濃度處理下,3種草的目測質量都急劇下降,同對照相比差異顯著(P<0.05),其中假儉草的下降幅度最大,其次是結縷草和狗牙根。假儉草目測質量在處理25d后目測質量下降到6級以下,而結縷草和狗牙根目測質量仍然都在6級以上。
不同濃度的鉛脅迫對3種草中根系和地上部莖葉的影響如圖2所示。隨著脅迫濃度的增加,3種草中根系生物量都在逐步下降,下降幅度最大的為假儉草,其次為結縷草,狗牙根下降幅度最小(圖2A)。在假儉草、結縷草和狗牙根中,在鉛脅迫為250mg/kg下,根系生物量同對照相比驟然下降,但是隨著脅迫濃度的增加,生物量下降緩慢,假儉草和結縷草在脅迫濃度為4000mg/kg時降到最低值,分別比對照下降了29.8%和24.2%,而狗牙根在濃度為2000mg/kg時降到最低值,比對照下降了17.2%,隨著濃度的增加,略有回升,方差分析同對照差異顯著(P<0.05)。同根系相比,隨著濃度的增加,地上部生物量也逐步減少,但是下降幅度小于根系中的變化(圖2B)。在最大脅迫濃度4000mg/kg時,結縷草、假儉草和狗牙根中地上部生物量分別比對照下降了16.4%,20.0%和9.0%,方差分析同對照差異顯著(P<0.05)。這些結果表明鉛脅迫對根系的影響程度高于對地上部。
圖1 不同濃度鉛脅迫對3種草坪草目測外觀質量的影響Fig.1 Change of visual quality among three turfgrasses under the different lead concentrations
圖2 不同濃度鉛脅迫對3種草坪草根系(A)和地上部生物量(B)的影響Fig.2 Biomass of root(A)and parts above ground(B)changes among three turfgrasses under the different lead concentrations
在各個鉛脅迫濃度下,3種草種葉片葉綠素a和b含量如圖3所示。隨著鉛脅迫濃度的增加,3種草坪草的葉綠素a和b的含量均逐漸下降。假儉草在5個鉛濃度脅迫下,在所有脅迫時間段內,同對照相比,葉綠素a和b均顯著下降(P<0.05),其中在4000mg/kg濃度下處理30d后,葉綠素a和b降到最低值,分別比對照下降了69%和63%,方差分析顯示同對照差異顯著(P<0.05)(圖3)。結縷草中葉綠素a和b的變化也同假儉草中的趨勢相同,但是下降幅度要小一些,在各個脅迫濃度下,處理后第5天時同對照相比差異不顯著,在4000mg/kg濃度下處理30d后,結縷草中葉綠素a和b也降到最低值,同對照相比分別下降了55%和60%(圖3)。隨著鉛脅迫濃度的增加,狗牙根中葉綠素a和b含量逐漸下降,葉綠素a在鉛濃度4000mg/kg處理后第30天時達到最低值,比對照下降了50%,而葉綠素b在處理后第25天降到最低值,比對照下降了51%,方差分析顯示同對照差異顯著(P<0.05)。
圖3 不同濃度鉛脅迫對3種草坪草葉綠素a(A)和葉綠素b(B)的影響Fig.3 Changes of Chl a(A)and Chl b(B)among three turfgrasses under the different lead concentrations
從圖4可以看出,隨著鉛濃度的增加,結縷草、假儉草和狗牙根的葉片相對含水量均呈現(xiàn)逐漸下降趨勢。結縷草在鉛濃度2000和4000mg/kg水平下,處理后第10,15,20,25,30天時葉片相對含水量同對照相比下降顯著。隨著時間的延長,相對含水量持續(xù)下降,在濃度為4000mg/kg處理25d時達到最低值,同對照相比,下降了33.2%,方差分析顯示同對照差異顯著(P<0.05)。同結縷草相比,同等鉛濃度和時間處理下,假儉草的相對含水量的變化趨勢同結縷草類似,但是下降的幅度比結縷草的要低一些。在4000mg/kg濃度下處理后第15天時達到最低值,同對照相比下降了25.8%(P<0.05),隨后保持在這個水平。隨著濃度的增加,狗牙根中葉片相對含水量也呈現(xiàn)逐漸下降趨勢,在最高濃度4000mg/kg脅迫下,在處理后第25天時達到最低值,比對照下降了30.5%,隨后有所回升。
不同濃度和時間鉛脅迫下結縷草、假儉草和狗牙根中葉片電導率如圖5所示。假儉草中在短時間的5,10和15d脅迫內,隨著脅迫濃度的增加,葉片中的相對電導率逐漸上升,在較長時間的20,25,30d的脅迫內,葉片中的相對電導率也呈現(xiàn)上升趨勢,但是當脅迫濃度增加到4000mg/kg時,葉片電導率驟升,在脅迫30d后達到最大值,比對照增加了311%,方差分析極顯著(P<0.01)。結縷草和狗牙根中鉛脅迫下葉片電導率同假儉草中類似,在最高脅迫濃度下30d后分別比對照增加了303%和315%(P<0.01)。3種草中增幅最快的為狗牙根,其次為假儉草和結縷草。
圖4 不同濃度鉛脅迫對3種草坪草葉片中相對含水量的影響Fig.4 Changes of relative water content among three turfgrasses under the different lead concentrations
圖5 不同濃度鉛脅迫對3種草坪草葉片中相對電導率的影響Fig.5 Changes of relative electrolyte leakage among three turfgrasses under the different lead concentrations
2.6.1 鉛脅迫對3種草坪草SOD活性的影響 不同濃度和時間鉛處理下,3種草坪草SOD活性變化如圖6所示(圖6A)。結縷草中隨著脅迫濃度的增加和處理時間的延長SOD活性持續(xù)上升。在處理后5,10,15d內,在低于2000mg/kg濃度下,隨著脅迫濃度的增加,SOD活性緩慢上升,而當濃度上升到4000mg/kg時,SOD活性驟升,在處理后第15天時達到最大值,與對照活性水平比較,上升了192%。在處理后25d時,隨著濃度的增加,SOD活性先上升后下降,在1000mg/kg脅迫濃度下,達到最高值,隨后下降,但仍然明顯高于對照。隨著鉛脅迫濃度的增加,假儉草中SOD活性持續(xù)上升,但是呈現(xiàn)快-慢-快的趨勢。在各個處理時間段內,250mg/kg濃度下,假儉草中的SOD活性快速上升,隨著處理濃度的增加,在500和1000mg/kg濃度處理下,增幅比較緩慢,在處理濃度高于2000mg/kg,SOD活性又急劇上升,在4000mg/kg處理后第20天時,達到最大值,比對照增加了125.6%,方差分析差異顯著(P<0.05)。狗牙根中隨著鉛脅迫濃度的增加,SOD活性呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢。在處理后5,10,15和20d天內,SOD活性在2000mg/kg濃度下達到峰值,隨后下降,但是仍舊明顯高于對照,而在處理后25和30d內,SOD活性在1000mg/kg時達到最大值,隨著濃度的增加,其活性略微下降。在處理后25d時比對照增加了221.2%。
2.6.2 鉛脅迫對3種草坪草POD活性的影響 不同濃度和時間鉛脅迫下,3種草坪草POD活性變化如圖6所示(圖6B)。3種草中POD活性都比對照顯著增加,其中增幅最快的為結縷草,其次為狗牙根和假儉草。在假儉草中,隨著脅迫濃度的增加,脅迫5d內,POD活性持續(xù)上升,4000mg/kg脅迫下達到峰值,而在脅迫后20,25,30d時間段內,POD活性持續(xù)上升,在2000mg/kg時達到最大值,分別比對照增加了156.2%,187.7%和139.2%,隨后略微下降或保持不變。結縷草中在脅迫后5和10d時,隨著脅迫濃度的增加,POD活性持續(xù)上升,但是增長幅度比較緩慢,在脅迫后15和20d時,250mg/kg低濃度誘導了POD的驟升,隨著濃度的增加,增幅比較緩慢,而在脅迫后25d時,隨著濃度的增加,POD活性持續(xù)大幅度上升,在4000mg/kg濃度下達到峰值,比對照增加了392%,方差分析差異顯著(P<0.05),脅迫30d時,在250mg/kg低濃度時,POD活性也驟然升高,隨著濃度的增加,在1000mg/kg達到峰值,然后下降,接近低濃度的水平。狗牙根在鉛脅迫5和10d時,隨著脅迫濃度的增加,POD活性呈現(xiàn)先升后降的趨勢,在1000mg/kg脅迫濃度下,達到峰值,隨后活性水平下降到接近500mg/kg下的活性。在鉛脅迫15d后的幾個時間段內,250mg/kg的低濃度誘導了POD活性的驟增,隨著脅迫濃度的增加,POD活性持續(xù)增加,但增幅緩慢一些,在鉛脅迫4000mg/kg處理后30d時達到最大值,同對照相比增加了188.8%。
圖6 不同濃度鉛脅迫對3種草坪草葉片中SOD(A)、POD(B)、CAT(C)活性變化的影響Fig.6 Changes of activities of protective enzymes SOD(A),POD(B)and CAT(C)among three turfgrasses under the different lead concentrations
2.6.3 鉛脅迫對3種草坪草CAT活性的影響 不同濃度和時間鉛脅迫下,3種草坪草CAT活性變化如圖6所示(圖6C)。假儉草在鉛脅迫后各時間段內,隨著濃度的升高,CAT活性緩慢上升,在脅迫濃度4000mg/kg下處理20d后CAT活性達到最大值,同對照相比增加了49.2%。結縷草在脅迫后10,15,20,25,30d內,隨著脅迫濃度的增加,CAT活性先升高后降低,在濃度4000mg/kg下達到最大值,隨后下降,接近250mg/kg低濃度下的水平。在最高脅迫濃度下脅迫后20d時比對照增加了84%(P<0.05)。狗牙根中隨著鉛脅迫濃度的增加,CAT活性先上升后下降。在脅迫濃度2000mg/kg下處理20d后達到峰值,比對照增加了57.7%(P<0.05)。
前人的研究表明一定濃度的鉛脅迫導致草坪草失綠和分蘗減少[10]。我們的研究表明高濃度的鉛脅迫導致3種草坪草的目測質量下降,目測質量評價中主要用到的指標是草坪的色澤、密度、質地及均一性,這些結果說明在高濃度的鉛脅迫下,3種草坪草的生長及形態(tài)組織受到傷害。這一結果同前人研究草坪草在鉛脅迫下的傷害相一致[27]。在最高鉛濃度脅迫下處理30d后假儉草目測質量下降到6級以下,結縷草介于6和7級之間。而狗牙根在此濃度脅迫下處理20d后目測質量為最低,但仍然高于7級。從這些結果我們可以推斷狗牙根具有較其他草種更強的鉛適應能力。
鉛脅迫對植物的另一種形態(tài)傷害表現(xiàn)為根系受損傷及地上部生長減緩[28]。我們的研究結果表明隨著鉛脅迫濃度的增加,根系和地上部的生物量都逐步減少,只是根系生物量的下降幅度比地上部更大一些,這可能是由于根系作為植物和土壤的重要界面,是重金屬與植物直接接觸的首要部位,其受到的傷害癥狀比地上部更明顯一些,這也與前人在鉛脅迫對地上部和根系生物量的變化結果相一致[29]。3種草中根系生物量同對照相比下降最快的為假儉草,其次為結縷草,狗牙根下降幅度最小,這一結果可以推斷出在鉛脅迫下狗牙根根系的適應能力強于前面兩者。
光合生理的變化可以衡量植物對重金屬的耐受性[30]。葉綠素作為植物進行光合作用的主要色素,其含量高低可直接反映光合作用能力的強弱。本研究表明,隨著鉛脅迫濃度的升高,同對照相比,3種草坪草的葉綠素a、b含量均顯著下降。這也和前人對鉛脅迫可顯著降低葉片葉綠素含量的研究相一致[31-32]。3種草中葉綠素降低幅度最大的為假儉草,其次為結縷草,狗牙根中葉綠素降低的幅度最小,這一結果同鉛脅迫下目測質量的結果相一致,可以推斷假儉草對鉛脅迫的適應能力較其他兩種草弱一些。
鉛脅迫對植物的傷害機理之一是通過破壞植物細胞膜,使膜透性增加,細胞內含物大量外滲,同時外界物質進入細胞,導致植物體內生理生化反應發(fā)生紊亂,破壞正常的新陳代謝,從而使生長活動受抑制[15]。本研究中3種草坪草在鉛脅迫下葉片電導率上升,且上升幅度隨處理濃度的增大而增大,這與鉛破壞植物細胞膜,使膜透性增加的結論相一致[33]。與假儉草、結縷草細胞膜被破壞后保持高膜透性不同,狗牙根的葉片電導率在后期有所回落,這很可能是狗牙根對鉛脅迫導致的細胞膜傷害進行了修復,或者通過其他適應性的調節(jié)來緩解細胞膜傷害。
前人研究表明,高濃度的鉛可引起植物嚴重的水分虧缺,木質部水位以及相對含水量減少[34]。本研究中隨著鉛脅迫處理濃度的增加和處理時間的延長,3種草坪草中葉片相對含水量都逐步下降。不同的是,狗牙根與結縷草的葉片相對含水量相對于假儉草,在下降后出現(xiàn)回升過程,狗牙根在低濃度處理下葉片相對含水量能回升至對照水平。推測狗牙根在鉛脅迫后可能生成了滲透調節(jié)物質,以緩解鉛污染引起的水分脅迫。
前人研究表明,重金屬脅迫會導致植物大量的活性氧類物質(ROS)產(chǎn)生,而其能損傷生物大分子,引起膜脂過氧化[27]。在正常情況下,植物細胞內自由基的產(chǎn)生與清除處于動態(tài)平衡,而當植物長期處于脅迫下,植物產(chǎn)生的ROS含量超出活性氧解毒系統(tǒng)的能力時,動態(tài)平衡就會被打破,造成細胞的破壞、氧化損傷甚至死亡[34-35]。POD、CAT和SOD是植物體內參與淬滅活性氧過程的3種重要活性酶。POD能有效清除氧代謝中產(chǎn)生的H2O2以及由此產(chǎn)生的有機過氧化物,在生物體內的抗氧化代謝中有重要的作用[17-18],CAT主要清除植物光呼吸中產(chǎn)生的H2O2,催化細胞內過氧化氫發(fā)生歧化反應,使之轉化為對植物無毒的O2和H2O,防止細胞的過氧化[36],SOD作為膜保護的第一道防線,能以O2-為基質進行歧化反應,將毒性較強的O2-轉化為毒性較輕的H2O2[37]。
本研究中,3種草坪草SOD活性均隨脅迫時間的延長先升高后降低。其原因可能是Pb2+進入植物體內后絕大部分積累在根部[15],而硝酸根離子的加入?yún)s提高了草坪草的肥力,因此導致了適應性的增加,但隨著脅迫時間的延長,草坪草體內累積過多Pb2+,高濃度鉛使得H2O2后續(xù)分解無法繼續(xù),導致H2O2積累抑制O2-的轉化,進而SOD活性降低。3種草坪草在鉛污染下POD活性均顯著增加,其中狗牙根POD活性隨脅迫時間的延長而增大,可見狗牙根對鉛脅迫的耐性較高;假儉草與結縷草在高濃度鉛處理下,POD活性先增大后降低,可能是因為活性氧濃度達到一定臨界值導致酶活性相應減弱。3種草坪草CAT活性均有所增加,其中假儉草CAT活性隨鉛濃度的增加而增加,隨脅迫時間的延長先升高后緩慢降低,結縷草CAT活性則呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,其原因可能是草坪草對鉛脅迫產(chǎn)生應激反應,但隨著鉛濃度的增加和脅迫時間的延長,超過植物所能忍受的極限時,作為防御體系的酶活性也相應減弱,符合植物對脅迫的典型特征[9]。而狗牙根CAT活性變化較為平緩,處理后5d時被誘導升高,此后基本維持在同一水平,表明不同草坪草的自身保護酶體系不同,其CAT活性對鉛脅迫反應也是完全不同的。這些結果同前人在其他植物中鉛脅迫下保護酶的變化相一致。
通過上述分析和討論,我們可以看出3種草坪草對鉛脅迫的響應具有差異,假儉草與結縷草對鉛的敏感程度明顯大于狗牙根。可能的原因是狗牙根進行了緩沖、修復鉛脅迫傷害等適應性調節(jié),從而提高了對鉛的耐性,而假儉草的適應性調節(jié)能力較弱,從目測質量上即可觀察到明顯傷害。綜合分析各項指標可以得出3種草坪草對鉛抗性能力依次排序為:狗牙根>結縷草>假儉草。狗牙根在鉛脅迫下與其他兩種草坪草相比,表現(xiàn)出了更好的抗性能力,因此更適合用于受鉛污染地區(qū)的綠化和生態(tài)修復。
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