雒軍，王引權(quán)＊，溫隨超，李靜，張金林＊，夏琦

（1.甘肅中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，甘肅 蘭州730000；2.甘肅省高校中（藏）藥化學(xué)與質(zhì)量研究省級重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州730000；3.蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州730020）

當(dāng)歸（Angelicasinensis）為傘形科當(dāng)歸屬草本植物，以干燥根入藥，具有補(bǔ)血活血，調(diào)經(jīng)止痛，潤腸通便等功效，為臨床常用藥［1］。甘肅是當(dāng)歸主產(chǎn)區(qū)，年栽培面積和總產(chǎn)量都占全國90%以上，當(dāng)歸適宜栽培在2000～2800 m海拔的高寒陰濕地帶［2］。目前對當(dāng)歸栽培模式、當(dāng)歸生理特征、藥材品質(zhì)和產(chǎn)量形成進(jìn)行了許多研究，王慧珍等［3］報(bào)道連作當(dāng)歸比輪作當(dāng)歸的揮發(fā)油含量、葉片光合色素含量和光合特性顯著降低，進(jìn)而導(dǎo)致產(chǎn)量和品質(zhì)下降；王田濤等［4］研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸/大蒜（Alliumsativum）間作能提高當(dāng)歸產(chǎn)量和優(yōu)等品比率，并能降低當(dāng)歸麻口病發(fā)病率；邱黛玉等［5］報(bào)道當(dāng)歸種苗的大小影響生長過程中當(dāng)歸莖葉和根部蛋白質(zhì)、游離氨基酸、可溶性糖含量的變化，進(jìn)而影響成藥期抽苔率，但對當(dāng)歸藥效成分生物合成及其代謝調(diào)控的分子生物學(xué)機(jī)理尚未開展過系統(tǒng)研究。

阿魏酸（ferulic acid，F(xiàn)A）是當(dāng)歸藥材中含量較高的水溶性活性成分，為《中國藥典》規(guī)定的當(dāng)歸質(zhì)量控制指標(biāo)之一［6］?，F(xiàn)代藥理研究表明，F(xiàn)A具有明顯抗動(dòng)脈粥樣硬化，抗血小板凝集和血栓，清除亞硝酸鹽、氧自由基、過氧化亞硝基，抗菌消炎，抗腫瘤，抗突變，增加免疫功能等作用［7］。FA為苯丙烷代謝途徑生成的中間產(chǎn)物之一，其主要生物合成途徑是由苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia－lyase，PAL）催化L－苯丙氨酸（L－Phe）生成反式－肉桂酸（t－CA），肉桂酸－4－羥基化酶（C4H）催化反式－肉桂酸生成對－香豆酸（p－Coumaric acid），對－香豆酸經(jīng)香豆酸－3－羥基化酶（C3H）作用生成咖啡酸（caffeic acid），再以甲硫氨酸（S－腺苷－L甲硫氨酸）為甲基供體，在咖啡酸－O－甲基轉(zhuǎn)移酶（COMT）的催化下生成阿魏酸（FA）［8－9］。PAL催化L－苯丙氨酸（L－Phe）生成反式－肉桂酸（t－CA），是苯丙烷代謝的第一步反應(yīng)，也是其中的關(guān)鍵步驟之一［10］。目前有多種植物的PAL已經(jīng)得到克隆，在藥用植物中有朝鮮當(dāng)歸（Angelicagigas）［11］、皺波天竺葵（Pelargoniucrispum）［12］、金銀花（Lonicerajaponica）［13］、黃芩（Scutellariabaicalensis）［14］、紫草（Lithospermumerythrorhizon）［15］、黃芪（Astragalusmembrana－ceus）［16］和丹參（Salviamiltiorrhiza）［17］等，但尚未有當(dāng)歸PAL研究的報(bào)道。本研究的重點(diǎn)在于用RT－PCR方法克隆當(dāng)歸代謝相關(guān)PAL片段、進(jìn)行序列分析，并運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析其在當(dāng)歸不同組織的特異性表達(dá)，為進(jìn)一步獲得當(dāng)歸PAL全長及其闡明FA的生物合成與制定調(diào)控策略提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

當(dāng)歸植株于2013年8月采自甘肅岷縣茶埠鎮(zhèn)試驗(yàn)基地（海拔2780m，東經(jīng)104°06′，北緯34°29′）。田間挖取當(dāng)歸全株，立即裝入干冰泡沫箱中，于當(dāng)日帶至實(shí)驗(yàn)室后迅速用去離子水沖洗干凈，并將根、莖、葉組織分離后用液氮迅速冷凍后，保藏于－80℃超低溫冰箱，用作RNA提取材料。大腸桿菌（Escherichiacoli）DH5α菌株由本實(shí)驗(yàn)室保存。

采用的分子生物學(xué)試劑主要包括：RNA提取試劑十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）、LiCl和聚乙烯吡咯烷酮360（PVP－360）為美國Sigma產(chǎn)品，cDNA 合成試劑盒（TaKaRa，大連），Taq DNA Polymerase（Thermo，美國）、PCR產(chǎn)物回收試劑盒（TransGen，北京）、PCR 產(chǎn)物克隆試劑盒（Promega，美國），DNA Marker（TransGen，北京），SYBR Green熒光定量試劑盒（Promega，美國），其他生化試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

通過對GenBank中皺波天竺葵（X81159）、朝鮮當(dāng)歸 （HM114215）、胡蘿卜（Daucuscarota）（AB435640）和擬南芥（Arabidopsisthaliana）（NM＿001203294）等植物PAL編碼基因CDS序列進(jìn)行同源比對，找出高度保守區(qū)段，利用Primer 6.0生物軟件設(shè)計(jì)一對擴(kuò)增引物（P1，P2），用于擴(kuò)增當(dāng)歸PAL片段。P1：5′－GCTGAACAGCACAATCAAGATGT－3′，P2：5′－GTTAACAGATTGGAAGAGGAGCAC－3′。

參照克隆并測序的當(dāng)歸PAL片段序列，利用Primer 6.0生物軟件設(shè)計(jì)一對用于PAL熒光定量PCR檢測的特異引物（P3，P4），擴(kuò)增長度為119bp。P3：5′－GTGTCAACGGTGAGCTCCAT－3′，P4：5′－GCATCAATGGGTAGGTTGCG－3′。參照當(dāng)歸Actin片段序列［18］，設(shè)計(jì)一對熒光定量PCR內(nèi)參基因檢測的特異引物（P5，P6），擴(kuò)增長度為109bp。P5：5′－TGGTATTGTGCTGGATTCTGGT－3′，P6：5′－TGAGATCACCACCAGCAAGG－3′。以上所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 總RNA的提取

當(dāng)歸根、莖及葉組織中總RNA的提取參照文獻(xiàn)［19］方法進(jìn)行，并略作修改。實(shí)驗(yàn)中所用玻璃容器、離心管和去離子水在RNA提取前均用焦炭酸二乙酯（DEPC）處理，以變性滅活RNase。具體操作如下：

取1g材料置于含液氮和少量石英砂的研缽中充分研磨成粉末狀。取約1/10的粉末轉(zhuǎn)入內(nèi)含0.9mL 65℃預(yù)熱的提取緩沖液的離心管中，提取緩沖液成分包括100mmol/L Tris－Cl、2%CTAB（m/V）、2%PVP－360（m/V）、30mmol/L EDTA、1.5mol/L的 NaCl和2% （V/V）的β－巰基乙醇（β－ME）。充分振蕩混勻后置于65℃水浴鍋孵育20min，期間每5min充分振蕩1次。冷卻至室溫后，加等體積氯仿/異戊醇（24∶1），劇烈振蕩30s，11000r/min、4℃離心10min。水相轉(zhuǎn)入另一離心管，加約1/3體積10mol/L的LiCl，混勻后置－20℃冰箱30 min。11000r/min、4℃離心10min，沉淀溶解于0.5mL無RNase的去離子水，加0.5mL水飽和酚抽提一次，再加入等體積氯仿/異戊醇（24∶1）抽提1次，11000r/min、4℃離心10min。水相轉(zhuǎn)入另一離心管，加1/10體積3 mol/L pH 5.4的醋酸鈉，再加1體積預(yù)冷的異丙醇，置－20℃冰箱30min。11000r/min、4℃離心10min，沉淀懸浮于500μL無RNase的去離子水配制的70%乙醇。11000r/min、4℃離心10min，棄去上清液，沉淀干燥后溶于50μL無RNase的去離子水中。

將提取到的總RNA在使用和保存之前進(jìn)行檢測，使用分光光度計(jì)（Thermo BioMate 3，美國），根據(jù)吸光度值測定所提總RNA的純度（A260/A280的值為1.8～2.0，說明RNA無污染）及濃度；并依照測定出的RNA濃度確定下一步實(shí)驗(yàn)中合成cDNA所需模板的用量，未使用的RNA保存于－80℃超低溫冰箱；采用非變性瓊脂糖凝膠電泳方法判斷總RNA的完整性。

1.4 RT－PCR擴(kuò)增

按照試劑盒說明書，以當(dāng)歸葉片總RNA合成cDNA，然后以cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系：在200μL PCR管中加入下列組分，無菌去離子水35.8μL、MgCl2（25mmol/L）5μL、10×PCR緩沖液5μL、dNTP（2mmol/L）1.2μL、正、反向引物（10μmol/L）1μL、cDNA 0.5μL和Taq DNA polymerase（5U/μL）0.5μL，總體積為50μL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性3min；95℃變性30s、56℃退火30s、72℃延伸60s，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min，4℃結(jié)束，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠－化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Bio－Rad CHEMI DOC XRS，美國）檢測。目的片段回收和純化按照回收試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5 陽性克隆的篩選、鑒定及測序

DNA片段與T載體連接體系包括：T4DNA連接酶的2×連接緩沖液5μL、pGEM－T Easy載體0.5μL、純化的PCR產(chǎn)物1.5μL（值以PCR產(chǎn)物∶載體摩爾比1∶1估算）、T4DNA連接酶0.8μL，無菌去離子水補(bǔ)充至10μL，4℃連接過夜。連接產(chǎn)物全部加入到100μL置于冰上的感受態(tài)大腸桿菌DH5α細(xì)胞中，冰浴20min；42℃熱激50s；冰浴2min。加入900μL平衡至室溫的液體LB培養(yǎng)基，搖菌1.5h（37℃，150r/min）。取100 μL菌液涂布于含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)過夜。次日挑選單菌落，進(jìn)行菌落PCR檢測，陽性克隆接種于含氨芐青霉素的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)（37℃，150r/min），培養(yǎng)過夜后裝入菌種保藏管送生工生物工程（上海）有限公司測序。

1.6 序列的生物信息學(xué)分析

Blast搜索在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行，序列的比對、翻譯和作圖等在DNAMAN 6.0生物軟件上進(jìn)行，序列保守區(qū)分析在NCBI網(wǎng)站Conserved Domain Database（CDD）中進(jìn)行。具體分析參照已經(jīng)發(fā)表的關(guān)于基因克隆及序列分析文獻(xiàn)中方法進(jìn)行［20－22］。

1.7 PAL在當(dāng)歸植株組織中的特異表達(dá)

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Bio－Rad CFX96，美國）測定PAL在當(dāng)歸植株組織中的特異表達(dá)。分別稱取約0.1 g當(dāng)歸根、莖、葉組織提取總RNA，每個(gè)組織重復(fù)3次，然后用分光光度計(jì)測定濃度，計(jì)算并量取總RNA約100 ng。按試劑盒說明書進(jìn)行cDNA的第一鏈合成，將cDNA用無菌去離子水稀釋至30μL后取1μL cDNA作為熒光定量PCR模板進(jìn)行熒光定量PCR，每個(gè)cDNA模板做3管重復(fù)。反應(yīng)體系：在200μL PCR管中加入無菌去離子水7.4μL、2×qPCR mix 10μL、正、反向引物（10μmol/L）0.8μL、cDNA 1μL，總體積為20μL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性3min；95℃變性15s、60℃退火30s、72℃延伸30s，40個(gè)循環(huán)。熒光采集時(shí)間在72℃延伸步驟，擴(kuò)增完成后利用PCR儀自帶的程序進(jìn)行熔點(diǎn)曲線測定。求取3個(gè)平行管的平均Ct值，采用2－△△Ct分析方法對PAL進(jìn)行相對定量表達(dá)分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)與分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析。根、莖、葉間PAL相對表達(dá)量差異性利用ANOVA分析，采用LSD檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA的提取及檢測

采用非變性瓊脂糖凝膠電泳法對當(dāng)歸不同組織總RNA進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，28SrRNA和18SrRNA條帶清晰，沒有其他雜質(zhì)條帶（圖1），說明本試驗(yàn)提取的葉片總RNA的完整性較好；經(jīng)分光光度計(jì)測定A260/A280平均值為1.98，表明總RNA的純度較高，可用于RT－PCR擴(kuò)增。

圖1 葉片總RNA非變性瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Nondenaturing agrose gel electrophoresis of total RNA from leaves

2.2 RT－PCR擴(kuò)增

以當(dāng)歸葉片總RNA反轉(zhuǎn)錄所得到的第一鏈cDNA為模板，用PAL擴(kuò)增引物P1和P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增。經(jīng)檢測，擴(kuò)增產(chǎn)物約在700bp處有1條亮帶（圖2），與理論目的片段大小一致，推測為PAL片段，需要進(jìn)一步測序鑒定。

圖2 RT－PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳Fig.2 Agrose gel electrophoresis of RT－PCR products

2.3 陽性克隆的篩選、鑒定及測序

將回收純化的目的片段連接到pGEM－T Easy克隆載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，從轉(zhuǎn)化的平板上隨機(jī)挑取5個(gè)克隆并進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增，經(jīng)檢測1號和2號克隆擴(kuò)增出大小約為700bp的條帶（圖3），與RT－PCR結(jié)果一致，可能為陽性克隆，然后將陽性克隆進(jìn)行菌液培養(yǎng)并進(jìn)行測序，測得一段長度為706bp的序列，將該基因序列在NCBI網(wǎng)站的GenBank數(shù)據(jù)庫中注冊 （登錄號：KJ000258）。

圖3 陽性克隆的PCR鑒定Fig.3 PCR identification of positive clones

2.4 序列分析

對克隆得到的基因片段進(jìn)行序列分析，其編碼232個(gè)氨基酸（圖4）。Blast比對結(jié)果顯示，該序列與NCBI基因庫中6個(gè)物種的PAL核苷酸序列的相似性在80%以上，與珊瑚菜（Glehnialittoralis）GlPALB基因的相似性最高，為97%，與朝鮮當(dāng)歸PAL的相似性為88% （表1），表明本研究克隆到的基因片段為當(dāng)歸PAL片段，將其命名為AsPAL。將推測的當(dāng)歸PAL片段氨基酸序列和其他植物PAL氨基酸序列進(jìn)行多重比較（圖5），結(jié)果發(fā)現(xiàn)完全一致的氨基酸多達(dá)179個(gè)，占總氨基酸數(shù)的77%，與珊瑚菜、皺波天竺葵、胡蘿卜、朝鮮當(dāng)歸、野山茶（Camelliasinensis）和金銀花氨基酸序列相似性分別達(dá)99.14%，98.71%，97.42%，95.28%，86.70%和84.98%，表明克隆片段所編碼的肽段為PAL保守區(qū)域，并將其命名為As－PAL。進(jìn)一步對AsPAL進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果顯示，其包含裂解酶I類超家族 （Lyase＿like Superfamily）保 守 結(jié) 構(gòu) 域 （1－44）、PLN02457 結(jié) 構(gòu) 域 （1－223）、TIGR01226結(jié)構(gòu)域（1－224）和pfam00221結(jié)構(gòu)域（1－71），它們均是苯丙氨酸解氨酶的相關(guān)結(jié)構(gòu)域，說明AsPAL為當(dāng)歸PAL的功能區(qū)域。

表1 當(dāng)歸與部分植物PAL片段核苷酸序列相似性比對Table 1 Similarity analysis of PALfragment nucleic acid sequences between A.sinensis and other plant species

2.5 PAL在當(dāng)歸植株組織中的特異表達(dá)

由總RNA的非變性瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果看出，當(dāng)歸根、莖及葉組織中總RNA的28S條帶和18S條帶亮度相當(dāng)（圖6），說明反轉(zhuǎn)錄總RNA濃度基本相同。實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增曲線顯示，Actin和PAL的擴(kuò)增效果良好，Ct值在21～28之間循環(huán)；熔點(diǎn)曲線分析也表明擴(kuò)增曲線具有良好的特異性，表現(xiàn)為單一峰，沒有非特異性熒光峰，Actin和PAL的熔點(diǎn)曲線峰值分別出現(xiàn)在86℃和85℃。將熒光定量PCR的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示擴(kuò)增條帶大小約為110bp，與目的大小一致，無引物二聚體條帶（圖7）。

圖4 當(dāng)歸PAL片段的核苷酸序列及推測的氨基酸序列Fig.4 Nucleic acid sequence and deduced amino acid sequence of PAL fragment fromA.sinensis

圖5 當(dāng)歸與部分植物PAL片段氨基酸序列相似性多重比較Fig.5 Multiple comparisons on amino acid sequence of PALfragment between A.sinensis and other plant species

圖6 當(dāng)歸根、莖、葉總RNA非變性瓊脂糖凝膠電泳Fig.6 Nondenaturing agarose gel electrophoresis of total RNA from root，stem and leaf of A.sinensis

圖7 熒光定量PCR產(chǎn)物非變性瓊脂糖凝膠電泳Fig.7 Nondenaturing agarose gel electrophoresis of products of fluorescence quantitative RT－PCR

采用2－△△Ct方法分析當(dāng)歸根、莖、葉組織中PAL相對表達(dá)量，結(jié)果顯示PAL在各組織中均有表達(dá)，葉片中表達(dá)量最高，其次是莖和根，葉片和莖中表達(dá)量分別是根表達(dá)量的7.5和2.7倍，三者間差異性顯著（P＜0.05）（圖8）。

圖8 PAL在當(dāng)歸根、莖和葉中的相對表達(dá)量Fig.8 Relative expression levels of PALin root，stem and leaf of A.sinensis

3 討論

苯丙氨酸解氨酶（PAL）催化的反應(yīng)是苯丙烷類代謝的第一步反應(yīng)，其將初生代謝產(chǎn)物苯丙氨酸納入到次生代謝中，成為很多次生代謝產(chǎn)物的前體物質(zhì)。該酶分布比較廣泛，在所有綠色植物、真菌、細(xì)菌、酵母以及藻類中都有［23］。本研究雖然僅擴(kuò)增的是當(dāng)歸PAL3′端的保守區(qū)片段，但經(jīng)與GenBank中的其他物種PAL序列比對發(fā)現(xiàn)，AsPAL與朝鮮當(dāng)歸及皺波天竺葵PAL序列同源性非常高，相似性達(dá)92%。而與珊瑚菜、皺波天竺葵、胡蘿卜、朝鮮當(dāng)歸、野山茶和金銀花的同源性也達(dá)80%以上，初步推斷AsPAL可能是當(dāng)歸PAL酶的cDNA片段。由AsPAL保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果初步證實(shí)該序列為PAL的保守區(qū)域，可能包含著裂解酶I類超家族（Lyase＿I＿like Superfamily）保守結(jié)構(gòu)域序列。該超家族有裂解酶I家族、組氨酸裂解酶和苯丙氨酸裂解酶，它們催化類似的β消除反應(yīng)。這些分析結(jié)果預(yù)示著AsPAL可能是高等植物PAL家族的新成員，它具有較高的結(jié)構(gòu)和功能保守性，這為進(jìn)一步從基因的組成成分、理化特性、亞細(xì)胞定位、功能結(jié)構(gòu)域等方面更全面而準(zhǔn)確地揭示當(dāng)歸阿魏酸生物合成的分子機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

苯丙氨酸解氨酶在調(diào)控代謝途徑方面具有復(fù)雜的作用，Howles等［24］認(rèn)為，在轉(zhuǎn)基因煙草（Nicotiana tabacum）中PAL過量表達(dá)可提高綠原酸等相關(guān)次生代謝產(chǎn)物的含量，而Sewalt等［25］的研究表明，PAL表達(dá)抑制的轉(zhuǎn)基因煙草中木質(zhì)素等相關(guān)次生代謝產(chǎn)物含量會(huì)減少。本研究首次從當(dāng)歸植株中克隆了PAL，通過非變性瓊脂糖凝膠電泳分析，PAL在當(dāng)歸葉組織中表達(dá)量顯著高于根組織，預(yù)示著當(dāng)歸中阿魏酸的生物合成可能是先由葉組織合成，然后由植物傳導(dǎo)系統(tǒng)將其輸送至根部積累。

本研究曾比對朝鮮當(dāng)歸及皺波天竺葵PAL序列設(shè)計(jì)簡并引物并進(jìn)行當(dāng)歸PAL全長的擴(kuò)增，但未能獲得有效的擴(kuò)增結(jié)果，這是否與當(dāng)歸PAL在5′端具有自身特異性有關(guān)，還需進(jìn)一步研究。本研究成果為進(jìn)一步克隆方法獲得當(dāng)歸PAL全長，以及對闡明其在當(dāng)歸阿魏酸生物合成途徑中的功能奠定了工作基礎(chǔ)，同時(shí)也對未來通過基因工程手段調(diào)控當(dāng)歸阿魏酸含量提供理論依據(jù)。

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