王佳，鄭琳琳，顧天培，王學(xué)峰，王迎春＊

（1.內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特010021；2.內(nèi)蒙古和信園蒙草抗旱綠化股份有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特010021）

植物在生長發(fā)育過程中時(shí)刻遭受著各種生物和非生物脅迫，如病蟲害、鹽堿、干旱、低溫等。為了適應(yīng)復(fù)雜多變的環(huán)境，植物自身形成了一套復(fù)雜的脅迫應(yīng)答機(jī)制，使其能夠在不同環(huán)境中正常生長［1－3］。基于分子水平的脅迫應(yīng)答信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在這一過程中起到了至關(guān)重要的作用，其中WRKY蛋白作為植物特有的轉(zhuǎn)錄因子超家族，具有瞬時(shí)性、多效性，廣泛參與多種生物或非生物脅迫反應(yīng)［4］，對探索植物的抗逆性具有重要價(jià)值［5］。

WRKY蛋白由于其N端高度保守的WRKYGQK氨基酸序列及其特殊的鋅指結(jié)構(gòu)而命名，根據(jù)WRKY結(jié)構(gòu)域的數(shù)量和鋅指結(jié)構(gòu)的不同，可將WRKY轉(zhuǎn)錄因子分為三大類：I類通常含有2個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域；II類含有1個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域，鋅指結(jié)構(gòu)為Cx4－5Cx22－23HxH型；III類含有1個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域，鋅指結(jié)構(gòu)為Cx7Cx23HxC型［6］。WRKY轉(zhuǎn)錄因子首先在甘薯（Ipomoeabatatas）中發(fā)現(xiàn)，隨后在野生燕麥（Avenasativa）、皺葉歐芹（Petroselinumcrispum）、擬南芥（Arabidopsisthaliana）等植物中得到克隆和鑒定［7－10］。目前WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族成員在擬南芥、水稻（Oryzasativa）、毛果楊（Populustrichocarpa）等［11－13］植物中的成員數(shù)分別為74，102，104個(gè)。植物體內(nèi)的WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物生長發(fā)育及對外界環(huán)境的適應(yīng)中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用［14］。Dong等［15］采用Northern blotting方法，發(fā)現(xiàn)擬南芥49個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)與多種環(huán)境因素（低溫、干旱、植物激素、機(jī)械損傷、病原體）有關(guān)。仇玉萍等［16］從4℃脅迫的水稻植株cDNA文庫中獲得了13個(gè)WRKY基因全長，其中10個(gè)基因的表達(dá)受到NaCl、PEG（聚乙二醇，polyethylene glycol）、低溫（4℃）和高溫（42℃）等非生物逆境因子的脅迫影響。Xie等［17］用外源激素ABA（脫落酸，abscisic acid）和GA（赤霉素，gibberellin）處理水稻葉片發(fā)現(xiàn)OsWRKY71的表達(dá)量顯著升高。目前對WRKY轉(zhuǎn)錄因子的相關(guān)研究主要集中在擬南芥等模式植物中，而自然界中許多野生植物在抵抗各種生物和非生物脅迫的表現(xiàn)更為突出，因此加強(qiáng)對野生植物資源的相關(guān)研究，獲得優(yōu)質(zhì)抗性基因具有非常重要的意義。

長葉紅砂（Reaumuriatrigyna），屬于檉柳科（Tamaricaceae）琵琶柴屬（Reaumuria），又名黃花紅砂、黃花琵琶柴，起源于第三紀(jì)，為古地中海孑遺植物，所以被稱為“活化石”，被列為內(nèi)蒙古自治區(qū)重點(diǎn)保護(hù)植物，是荒漠草原和干草原地區(qū)的重要生態(tài)屏障和良好草場［18］。石蠟切片和掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，長葉紅砂葉和幼莖上均布有鹽腺，其鹽腺結(jié)構(gòu)對于適應(yīng)鹽漬環(huán)境具有重要作用［19］。同時(shí)發(fā)現(xiàn)其氣孔下陷，具有孔下室，體積較鹽腺?。黄浔Ｐl(wèi)細(xì)胞細(xì)胞壁明顯加厚，可有效抑制葉片水分的蒸發(fā)；表皮內(nèi)柵欄組織發(fā)達(dá)，海綿組織退化，中央維管束周圍具有大型儲水細(xì)胞［20］，因此長葉紅砂對鹽堿和干旱等極端環(huán)境具有極強(qiáng)的適應(yīng)性，開展長葉紅砂WRKY33轉(zhuǎn)錄因子作用機(jī)制研究，將為進(jìn)一步探索該植物抗逆分子調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)室利用Illumina測序技術(shù)對正常生長和鹽脅迫的長葉紅砂進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序［21］，獲得了該植物的大量遺傳信息，通過數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)64694條Unigenes在鹽脅迫后的表達(dá)量發(fā)生了變化，其中67條Unigene片段屬于WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族。本研究選取兩個(gè)注釋為WRKY轉(zhuǎn)錄因子且在鹽處理后表達(dá)上調(diào)明顯的兩個(gè)基因片段（Unigene30408和Unigene14081），采用RACE技術(shù)克隆獲得了這兩個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子的全長序列，并利用半定量RT－PCR技術(shù)研究了其表達(dá)特性。

1 材料與方法

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)所用長葉紅砂種子于2009年9月采自中國內(nèi)蒙古自治區(qū)東阿拉善－西鄂爾多斯地區(qū)（106°27′～111°28′E，39°13′～40°52′N，海拔1500～2100m），種子采回后于室外晾干，室溫下貯藏備用。

RNA提取試劑盒（Plant Plus RNA Regent）購自北京天根生化科技有限公司；Taq DNA聚合酶、DNase I、RNase inhibitor、pMD19－T載體及DNA Marker購自TaKaRa公司；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒為Invitrogen公司的M－MLV Reverse Transcriptase Kit；cDNA全長擴(kuò)增使用Clontech公司的SMARTTMRACEcDNA Amplification Kit；DNA凝膠回收試劑盒購自Axygen公司；其他試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純。PCR引物合成及測序由北京六合華大基因科技股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 植物培養(yǎng)和脅迫處理 挑選籽粒飽滿的長葉紅砂種子，10%次氯酸鈉浸泡15min，滅菌水沖洗3～5遍，播種于裝有30mL MS（Murashige and Skoog）培養(yǎng)基的150mL三角瓶中。暗培養(yǎng)3d后，置于25℃、濕度70%、16h/8h光照/黑暗的條件下培養(yǎng)。待幼苗生長至10cm左右，將其轉(zhuǎn)移至約裝有30mL 1/2Hoagland營養(yǎng)液的大試管中，在相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)，期間每隔3d更換一次營養(yǎng)液。

待幼苗長至20cm左右時(shí)選取長勢一致的幼苗，分別用30%PEG6000、100mmol/L NaCl、10μmol/L ABA及4℃處理0，1，3，6，12和24h，植物材料采集后用液氮速凍，存于－80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 RNA提取和cDNA合成 長葉紅砂總RNA的提取參照天根Plant Plus RNA Reagent說明書進(jìn)行。所提總RNA在37℃下用RNase－free DNase I處理1h去除殘余DNA。用Nanovue plus微量紫外分光光度計(jì)檢測其濃度和質(zhì)量，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。

RACE所用cDNA合成參照Clontech公司的SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit說明書進(jìn)行；半定量cDNA合成參照Invitrogen公司的M－MLV Reverse Transcriptase Kit說明書進(jìn)行。

1.2.3 長葉紅砂兩個(gè)WRKY基因全長cDNA序列的擴(kuò)增 根據(jù)長葉紅砂高通量測序結(jié)果功能注釋為WRKY轉(zhuǎn)錄因子（Unigene30408和Unigene14081）的DNA序列，參照Clontech公司的SMARTTMRACE cDNA Amplification試劑盒要求設(shè)計(jì)RACE引物（表1）。以長葉紅砂cDNA為模板，結(jié)合試劑盒內(nèi)提供的錨定引物進(jìn)行目的基因3′和5′末端的擴(kuò)增。第一輪PCR反應(yīng)體系為25μL，包含2mmol/L Mg2＋、10mmol/L dNTPs、錨定引物10xUPM（試劑盒提供）2.5μmol/L、特異性引物 GSP5或 GSP3 0.5μmol/L，Taq DNA 聚合酶1.0U，模板cDNA 20ng。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?5℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，72℃延伸2min，循環(huán)5次；94℃變性30s，70℃退火30s，72℃延伸2min，循環(huán)5次；94℃變性30s，68℃退火30s，72℃延伸2min，循環(huán)25次，72℃延伸10min。選取第一輪PCR產(chǎn)物分別稀釋10，50，100倍，以1μL為模板，引物使用巢式引物NGSP5或NGSP3，進(jìn)行巢式PCR，PCR體系和條件同上。巢式PCR產(chǎn)物經(jīng)切膠回收、連接至PMD－19T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，鑒定后進(jìn)行測序。測序結(jié)果用vector NTI 11.5軟件拼接在一起，得到基因全長cDNA序列。

1.2.4RtWRKY33－1和RtWRKY33－2基因的生物信息學(xué)分析 利用NCBI的ORF Finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）識別開放閱讀框序列并翻譯推測出氨基酸序列；利用Ex－PASy數(shù)據(jù)庫（http：//www.expasy.org）的 Prot－Param軟件分析蛋白的理論分子量和等電點(diǎn)，利用SOPMA軟件對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測［22］；蛋白序列比對用ClustalW軟件執(zhí)行；系統(tǒng)進(jìn)化樹用MEGA 5.05軟件，鄰接法（neighbor－joining，N－J法）繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.5 半定量RT－PCR表達(dá)分析 根據(jù)兩個(gè)基因的編碼序列和長葉紅砂β－actin序列信息設(shè)計(jì)用于半定量RT－PCR分析的特異引物及內(nèi)參基因引物（表1）。PCR反應(yīng)體系為25μL，內(nèi)含2mmol/L Mg2＋、200μmol/L dNTPs、引物各1.0μmol/L，Taq DNA 聚合酶1.0U，20ng模板cDNA。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性1min，94℃變性20s、55℃退火30s、72℃延伸30s，28個(gè)循環(huán)，PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分離觀察。重復(fù)3次，通過比較目的條帶的亮度以判定基因表達(dá)的強(qiáng)弱。

表1 實(shí)驗(yàn)所用的引物列表Table 1 Primer sequences was used in this study

2 結(jié)果與分析

2.1 基因全長的克隆

圖1 RACE－PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖Fig.1 Products of RACE－PCR

根據(jù)長葉紅砂錄組數(shù)據(jù)中兩個(gè)功能注釋為WRKY轉(zhuǎn)錄因子的基因序列（Unigene30408和Unigene14081）設(shè)計(jì)引物，利用RACE技術(shù)分別獲得兩個(gè)基因的3′和5′末端（圖1），利用vector NTI 11.5軟件將測序結(jié)果拼接獲得兩個(gè)分別為2163和2145bp的全長cDNA序列（GenBank登錄號分別為KF421158和KF421159），通過ORF finder軟件預(yù)測開放閱讀框分別為1681和1776bp，分別編碼573和591個(gè)氨基酸，在NCBI數(shù)據(jù)庫中比對發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)基因與擬南芥AtWRKY33的同源相似度分別為79%和87%，因此將這兩個(gè)基因命名為Rt－WRKY33－1和RtWRKY33－2。

2.2 RtWRKY33－1和RtWRKY33－2的生物信息學(xué)分析

氨基酸序列分析顯示，這兩個(gè)基因均具有兩個(gè)典型的WRKYGQK保守結(jié)構(gòu)域，屬于I類WRKY轉(zhuǎn)錄因子（圖2）。其中RtWRKY33－1蛋白相對分子量62.85kDa，等電點(diǎn)為5.51。

圖2 10種植物WRKY33氨基酸比對Fig.2 Comparison of the amino acid sequences of WRKY33in ten plants

氨基酸比對分析表明同源性最高的為大豆（XP003544908）、黃瓜（XP004137368）和野草莓（XP004294758），同源性均為97%；其次為擬南芥（AAM34736）和琴葉擬南芥（XP002879748），同源性均為79%，以及葡萄（XP002272040），同源性為78%；同源性較低的為二穗短柄草（XP003577478）和烏拉爾圖小麥（EMS64237），分別為68%和58%。

RtWRKY33－2蛋白相對分子量65.11kDa，等電點(diǎn)為6.48。氨基酸比對分析表明，同源性最高的為歐洲油菜（ACI14397），為91%；其次為大豆（XP003544908）、擬南芥（AAM34736）、野草莓（XP004294758）、黃瓜（XP004137368）和琴葉擬南芥（XP002879748），分別為88%，87%，86%，80%和79%。

蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明，RtWRKY33－1蛋白（圖3A）的573個(gè)氨基酸中，473個(gè)為隨機(jī)卷曲，占76.27%；66個(gè)為α螺旋，占11.52%；57個(gè)為延伸鏈，占9.95%；13個(gè)為β轉(zhuǎn)角，占2.27%。RtWRKY33－2蛋白（圖3B）的591個(gè)氨基酸中，429個(gè)為隨機(jī)卷曲，占72.59%；73個(gè)為α螺旋，占12.35%；65個(gè)為延伸鏈，占11%；24個(gè)為β轉(zhuǎn)角，占4.06%。

對這兩個(gè)基因編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)比對可以發(fā)現(xiàn)其保守結(jié)構(gòu)域隨機(jī)卷曲、α螺旋、β轉(zhuǎn)角和延伸鏈的構(gòu)成差異不大。然而在N末端（1～80aa之間）兩個(gè)蛋白中延伸鏈的數(shù)目相差雖然不大，出現(xiàn)位置卻存在很大差異，同時(shí)α螺旋和β轉(zhuǎn)角的數(shù)目和位置差異明顯；第1個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域之前（190～240aa之間）RtWRKY33－1的隨機(jī)卷曲中夾雜著7個(gè)α螺旋，而RtWRKY33－2中沒有；在兩個(gè) WRKY結(jié)構(gòu)域之間（430～450aa之間）Rt－WRKY33－1有3個(gè)延伸鏈，而RtWRKY33－2中全部為隨機(jī)卷曲。

系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示（圖4），長葉紅砂的兩個(gè)WRKY33轉(zhuǎn)錄因子與十字花科的琴葉擬南芥、擬南芥、薺菜和歐洲油菜親緣關(guān)系較近，與葫蘆科的黃瓜、葡萄科的葡萄、薔薇科的野草莓及豆科的大豆親緣關(guān)系次之，與禾本科的單子葉植物二穗短柄草、節(jié)節(jié)麥和烏拉爾圖小麥親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖3 RtWRKY33蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.3 Prediction of the secondary structure of RtWRKY33

圖4 12種植物WRKY33氨基酸系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree based on amino acid sequence of WRKY33from ten plants

2.3 RtWRKY33－1和RtWRKY33－2基因的表達(dá)特性分析

通過半定量RT－PCR技術(shù)對兩個(gè)基因進(jìn)行表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，這兩個(gè)基因均受鹽（NaCl）、冷（4℃）、干旱（PEG）和ABA四種非生物脅迫的誘導(dǎo)（圖5）。RtWRKY33－1在鹽和冷脅迫下的表達(dá)趨勢基本一致（圖5A），處理1h后開始表達(dá)，3和6h基本不表達(dá)，在12和24h后表達(dá)量又升高，但低溫處理12h后對其誘導(dǎo)更明顯；在干旱脅迫下均有上調(diào)表達(dá)，呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在6h時(shí)表達(dá)量最高；在添加外源激素ABA的情況下均有表達(dá)，其表達(dá)呈現(xiàn)出先升高后降低然后又升高的趨勢。

RtWRKY33－2在鹽、冷脅迫下均有明顯上調(diào)表達(dá)（圖5B），其表達(dá)呈現(xiàn)先升高后降低然后又升高的趨勢，在6 h表達(dá)量最低；干旱脅迫下持續(xù)表達(dá)，在1h表達(dá)最高，其后表達(dá)基本不變；施加外源激素ABA對其誘導(dǎo)明顯，開始1～12h階段表達(dá)量均比較高，但在24h后表達(dá)量迅速下降，基本不表達(dá)。

通過對比兩個(gè)基因之間的表達(dá)趨勢分析發(fā)現(xiàn)，在鹽和冷脅迫下RtWRKY33－2基因持續(xù)表達(dá)且上調(diào)明顯而RtWRKY33－1在3和6h基本不表達(dá)，因此鹽和冷對RtWRKY33－2的誘導(dǎo)更明顯；在干旱脅迫下兩個(gè)基因均持續(xù)表達(dá)，但RtWRKY33－1在6h表達(dá)量最高，而RtWRKY33－2在1h表達(dá)量最高；在施加外源激素ABA的條件下表達(dá)趨勢差異明顯，RtWRKY33－2處理24h后基本不表達(dá)，而RtWRKY33－1表達(dá)量雖然比較低，但是一直持續(xù)表達(dá)。

圖5 RtWRKY33基因在不同脅迫處理下的表達(dá)分析Fig.5 Analysis of RtWRKY33gene expression in different stress

3 討論

植物體內(nèi)的WRKY轉(zhuǎn)錄因子參與多種生理生化反應(yīng)，在高鹽、低溫、干旱等非生物脅迫及ABA響應(yīng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中有重要作用［23－24］。付乾堂和余迪求［25］采用 Northern blotting的方法，發(fā)現(xiàn)擬南芥 AtWRKY25、At－WRKY26和AtWRKY33轉(zhuǎn)錄因子受多種非生物脅迫因素的影響，其中低溫和高鹽對這3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的誘導(dǎo)尤為明顯。Jiang和Deyholos［26］對 NaCl脅迫下的擬南芥研究發(fā)現(xiàn)單突變體WRKY33和雙突變體WRKY25WRKY33能夠提高植株對NaCl的抗性。Li等［27］對WRKY25、WRKY26和WRKY33的擬南芥突變體和過表達(dá)擬南芥植株在高溫脅迫下的研究發(fā)現(xiàn)，這3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子在受乙烯激活的和熱激蛋白相關(guān)的信號通路中協(xié)同調(diào)節(jié)擬南芥對高溫的脅迫應(yīng)答。因此WRKY33轉(zhuǎn)錄因子在擬南芥抵御非生物脅迫反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用。本研究中克隆到的長葉紅砂兩個(gè)WRKY33轉(zhuǎn)錄因子在4種非生物脅迫下均被誘導(dǎo)表達(dá)，但是鹽、冷和ABA對RtWRKY33－2誘導(dǎo)尤為明顯，同時(shí)RtWRKY33－2對干旱脅迫的響應(yīng)更快，因此這兩個(gè)基因在長葉紅砂抵御非生物脅迫的應(yīng)答反應(yīng)中發(fā)揮的作用可能不同。

蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)中氨基酸的序列決定了高級結(jié)構(gòu)，高級結(jié)構(gòu)決定了蛋白質(zhì)的功能，而其中的隨機(jī)卷曲經(jīng)常構(gòu)成蛋白質(zhì)活性部位和特異功能部位［28］。植物中的谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（glutathione S－transferase，GST）是一類具有多種生理功能的蛋白質(zhì)超家族，三維結(jié)構(gòu)比較顯示，雖然所有植物的GST比較保守［29］，但是在主要負(fù)責(zé)結(jié)合特異性底物的C末端結(jié)構(gòu)域有較大變異，不同的GST能結(jié)合特定底物而發(fā)揮不同的生理功能［30］。通過生物信息學(xué)分析我們發(fā)現(xiàn)RtWRKY33－1與RtWRKY33－2的一級結(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu)在WRKY結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列和結(jié)構(gòu)特性的相似性較高，但是在非保守結(jié)構(gòu)域部分，尤其是N末端（1～80aa之間）、第1個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域之前（190～240aa之間）和兩個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域之間（430～450aa之間）等位置的差異明顯，可能對兩個(gè)基因功能有一定影響。這種差異是否會引起蛋白活性部位的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而使結(jié)合底物的特異性發(fā)生改變，還需要進(jìn)一步的理論分析和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

本研究克隆了長葉紅砂中兩個(gè)WRKY33轉(zhuǎn)錄因子，并對其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析與逆境脅迫下表達(dá)模式的初步探索，為長葉紅砂中研究WRKY33轉(zhuǎn)錄因子的功能和響應(yīng)逆境應(yīng)答的調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。后續(xù)我們將對這兩個(gè)基因的拷貝數(shù)進(jìn)行研究，并構(gòu)建植物表達(dá)載體，導(dǎo)入模式植物擬南芥，探索其在轉(zhuǎn)基因植株中的功能差異，為將來應(yīng)用泌鹽植物長葉紅砂的WRKY33基因提高作物及牧草抗性提供參考。

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