侯軍霞 綜述，曾維政審校

（中國人民解放軍成都軍區(qū)總醫(yī)院消化內(nèi)科，成都 610083）

細胞治療是近年來醫(yī)學(xué)研究的熱點，并展現(xiàn)了極好的前景，廣泛應(yīng)用于心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、糖尿病、肝病、腫瘤等領(lǐng)域。移植細胞在體內(nèi)的遷移、分布、增殖及分化等因素直接關(guān)系到治療能否成功，因此，非侵入性的細胞示蹤技術(shù)成為焦點。目前常用的體內(nèi)細胞示蹤技術(shù)包括核素成像、光學(xué)成像和核磁共振成像技術(shù)。核素成像技術(shù)通過核素（如18F、99mTc、111IN等）標記細胞，用PET／SPECT方法可以進行動態(tài)監(jiān)測，敏感度及特異度高，但具有空間分辨率低、標記物存在輻射、半衰期短等缺點。光學(xué)成像技術(shù)則是通過生物發(fā)光劑和內(nèi)源性熒光報告基因或是外源性探針來檢測分子和生化進程的無創(chuàng)技術(shù)，具有高敏感性、無電離輻射、可量化及費用相對較低等優(yōu)點，但是空間分辨率低、光源在生物體內(nèi)易發(fā)生散射、有背景光干擾。核磁共振成像（magnatic resonance image，MRI）技術(shù)是利用體內(nèi)固有的原子核（氫質(zhì)子），在外加磁場的作用下產(chǎn)生共振現(xiàn)象，將獲得的電信號經(jīng)過計算機處理后，重建出人體某一層面的圖像的診斷技術(shù)，由于空間分辨率高、敏感度強，無電離輻射、廣泛應(yīng)用于臨床等特點，受到眾多研究者的青睞?，F(xiàn)將MRI對比劑在細胞示蹤中的研究進展做一綜述。

1 氧化鐵顆粒

氧化鐵通過縮短自旋－自旋弛豫時間／橫向弛豫時間（T2），產(chǎn)生負性對比效應(yīng)，在T2W1和T2＊W1上顯示為低或無信號。為了增加氧化鐵顆粒的穩(wěn)定性和可溶解性，降低對細胞功能的影響，用于細胞標記的氧化鐵顆粒通常是由右旋糖酐、聚乙二醇（PEG）或聚苯乙烯等包裹Fe2＋和Fe3＋的氧化物的核構(gòu)成［1］。按照顆粒直徑的大小，氧化鐵顆?？梢苑譃椋撼槾叛趸F顆粒（superparamagnetic iron oxide，SPIO，直徑50～200 nm），超小超順磁氧化鐵（ultra small superpara－magnetic iron oxide，USPIO，直徑35nm）和微米順磁氧化鐵納米粒子（monocr－ystalline iron oxide nanocompound，MPIO，直徑約1 μm）［1］。其中 MPIO含鐵量最高，是最敏感的對比劑，但因其由聚苯乙烯包被而成，不能被生物降解，長期存留在體內(nèi)的影響未知，因此限制了MPIO在動物研究及臨床中的應(yīng)用［2］。

迄今為止，SPIO是惟一被批準用于臨床的對比劑。因其可被肝、脾、骨髓、淋巴結(jié)中的巨噬細胞吞噬而顯影，早在1996年美國FDA就批準SPIO用于臨床作為特異性的肝臟對比劑使用。SPIO具有生物降解性，被細胞代謝后可進入正常血漿鐵池與血紅蛋白結(jié)合或參與其他代謝過程［3］。通常用于MRI細胞示蹤的SPIO量約為10pg／細胞，有研究表明，該劑量對細胞沒有表現(xiàn)出明顯的不良反應(yīng)，并且細胞內(nèi)鐵的代謝較慢，但較高濃度的鐵（＞20pg）對細胞具有毒性作用，因為游離鐵離子在細胞內(nèi)產(chǎn)生羥自由基可致細胞DNA變性［4－6］。

在健康志愿者大腿皮下注射結(jié)核桿菌誘導(dǎo)皮膚炎癥，并將SPIO標記后的外周血單核細胞靜脈輸注到志愿者體內(nèi)，MRI可觀察到SPIO標記細胞遷移到炎癥皮膚，且皮膚活檢證實了普魯士藍染色陽性細胞存在［7］。SPIO標記間充質(zhì)干細胞后移植到多發(fā)性硬化癥和脊髓側(cè)索硬化癥患者的鞘膜腔及腦室內(nèi)，應(yīng)用MRI觀察細胞的遷移和分化，未發(fā)現(xiàn)與SPIO標記有關(guān)的病理改變，表明SPIO用于臨床是安全可行的［1］。

SPIO及細胞表面均帶負電荷，不易通過胞吞或胞飲作用進入非吞噬細胞體內(nèi)，為增加細胞標記效率，目前最常用的方法是將SPIO顆粒包被上多聚陽離子從而使促SPIO與細胞膜結(jié)合，促進吞噬。常用的轉(zhuǎn)染試劑有多聚賴氨酸、魚精蛋白硫酸酯、陽離子脂質(zhì)體等，通過簡單的孵育即可以標記細胞［1］。其他標記方法有電穿孔和超聲脈沖等。

盡管如此，SPIO作為MRI細胞示蹤劑仍有一些局限性：（1）敏感度相對較低；（2）隨著移植細胞迅速分裂，SPIO濃度會被稀釋；（3）標記細胞死亡后被吞噬細胞或其他細胞吞噬，出現(xiàn)假陽性；（4）由于出血灶內(nèi)含有含鐵血紅素，與標記細胞不易區(qū)分。

2 順磁性物質(zhì)

順磁性物質(zhì)用于 MRI對比劑主要有釓（Gd3＋）和錳（Mn2＋）兩類，通過影響自旋－晶格弛豫時間／縱向弛豫時間（T1），產(chǎn)生T1正性對比效應(yīng)，在T1WI顯示為高信號。

釓含有最多的不成對電子（7個），是最有效的順磁對比劑［1］。但因Gd3＋有細胞毒性，通常使用其螯合物來減少對細胞的損害。釓螯合物在低濃度下主要是縮短T1成為陽性對比劑，而在高濃度時，Gd3＋以縮短T2為主成為MR陰性對比劑。目前用于細胞標記的濃度10～80mmol／L則以縮短T1為主［8］。目前釓對比劑主要包括 Gd－DPTA、Gd－DOTA、Gd－DO3A 等，其 中 Gd－DTPA（Gadopen－etate dimeglumine；商 品名：馬根維顯，Magnevist）是臨床最常用的對比劑，主要用于增強全身血供豐富的組織和病變，其臨床不良反應(yīng)主要與過敏有關(guān)，進入體內(nèi)的Gd－DTPA 99%可經(jīng)腎臟迅速清除和排泄，因此臨床上是安全的［1，9－10］。

但是Gd－DTPA用于細胞標記體內(nèi)示蹤卻受到限制：（1）敏感度低，且成像效果不如SPIO，（2）在細胞的溶酶體內(nèi)釓螯合物可能會迅速崩解，而釓（Gd3＋）可以導(dǎo)致腎臟纖維化已經(jīng)得到證實［9－10］。因此不適用于體內(nèi)細胞示蹤的研究。

為了減少釓對細胞的毒性影響及增強陽性對比效應(yīng)，出現(xiàn)了許多新型的對比劑。釓己二酮納米顆粒（GdH－NP）直徑約140nm，無細胞毒性，用于人MSCs標記不影響細胞表面抗原表達，且內(nèi)吞入細胞內(nèi)的含量比GD－DTPA高3倍，表明細胞標記低濃 度的 GdH－NP即 可 獲得較好 的 MRI影 像［11］。Gd2O3＠MCM－41（gadolinium－doped mosoporous silica MCM－41）擁有六角中孔結(jié)構(gòu)，可聚集納米大小的Gd2O3粒子，對細胞增殖無毒，并對標記的細胞分化潛能影響較小，標記的神經(jīng)干細胞（NSCs）在小鼠的腦內(nèi)可被臨床3TMRI觀察14d，組織切片免疫熒光檢測證實了標記細胞的存在［12］。超小順磁Gd2O3納米顆粒（直徑1.3nm）被聚乙二醇（PEG）包被后，形成膠狀的水性介質(zhì)，具有較高的縱向弛豫時間和小的r2／r1比率。用于標記F98腦癌細胞（多形性膠質(zhì)母細胞瘤），標記后移植到小鼠腦中應(yīng)用MRI觀察細胞的遷移，結(jié)果在移植后48 h每個移植動物都發(fā)現(xiàn)了腦瘤存在，表明超小PEG－Gd2O3納米顆?？商峁┹^強的陽性對比增強效應(yīng)，使體內(nèi)標記細胞可視化［13］。

Mn2＋是最早用于研究活體細胞示蹤的磁性粒子，有5對不成對電子，磁性和磁化率強于螯合的釓。將MnCl2標記的外周血單核細胞經(jīng)肌肉注射移植到大鼠缺血下肢中，使用MRI觀察7～20d發(fā)現(xiàn)Mn標記的MNCs分布與SPECT評價111In標記的MNCs及熒光顯微鏡觀察Dil染色分布一致［14］。但Mn2＋具有細胞毒性，通過大鼠玻璃體注射不同濃度的MnCl2，隨著濃度的增高，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的密度迅速減少；高濃度的MnCl2對視網(wǎng)膜的毒性還包括線粒體病變，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞分布異常，以及光感受器和視網(wǎng)膜色素上皮細胞的異常等［15］。

3 19F

19FMRI成像原理不同于SPIO，與氫核質(zhì)子無關(guān)，主要依賴于19F的自旋密度加權(quán)。因體內(nèi)背景信號低，盡管19F的影像信噪比明顯低于普通1HMRI，但檢測到的19F信號均來自標記細胞，而且獲得信號強度與19F的量成正比，因此，可以量化標記細胞［16］。19F示蹤方法的發(fā)展，依賴于過氧化碳（PFC）的使用。

PFC主要作為人工血液在手術(shù)中使用，也可作為血管系統(tǒng)的對比劑，是疏脂、疏水分子，不與細胞膜融合，需要制備成納米乳劑才能進入細胞。目前體內(nèi)尚未發(fā)現(xiàn)可代謝PFC的酶，且在低pH值環(huán)境中可穩(wěn)定存在，因此不會被溶酶體降解；進入體內(nèi)的PFC主要通過網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)代謝作用后經(jīng)過肺呼出［16－17］。研究表明，PFC標記細胞低于1011～1012個氟原子／細胞時，不會產(chǎn)生明顯的不良反應(yīng)［17］。19F標記鼠的骨髓HSCs可造成細胞活力一過性降低，但隨后恢復(fù)正常，且標記不改變細胞的分化潛能；在體內(nèi)試驗中，標記后的HSCs可在脾臟內(nèi)發(fā)育成正常的CFU，在淋巴和骨髓重建上與未標記細胞并無差別，表明標記后的 HSCs仍保持了治療功能和潛能［18］。19FMRI檢測敏感度高，在高磁場的MRI系統(tǒng)中可以檢測到1 000個標記細胞／voxe，Boehm－Sturm等［19］用19F標記人的神經(jīng)干細胞，體內(nèi)外未見對細胞增殖和分化有影響，標記后的神經(jīng)干細胞注射到小鼠的紋狀體，可用19F MRI檢測到標記細胞，且獲得影像學(xué)圖像與組織學(xué)檢查一致。

由于19FMRI需要特殊設(shè)備，且對細胞毒性的影響不明，還需進一步研究。但19F有望成為新的細胞示蹤方法來了解細胞行為。

4 報告基因

報告基因技術(shù)是將目的基因?qū)氚屑毎鼓撤N物質(zhì)過表達，從而被報告探針所檢測的方法。主要用于放射性核素方面，目前已經(jīng)在MRI檢查中得到發(fā)展［20］。

常用的MRI報告基因有：鐵蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體，這些蛋白可使鐵在體內(nèi)蓄積，通過改變T2弛豫時間報告蛋白的活性。Iordanova等［21－22］將鐵蛋白基因?qū)胄∈竽X室下的神經(jīng)祖細胞內(nèi)，并將轉(zhuǎn)染后細胞注射到小鼠紋狀體，用MRI檢測到了內(nèi)源性神經(jīng)祖細胞遷移到嗅神經(jīng)球；研究發(fā)現(xiàn)隨著細胞鐵蛋白表達增加，細胞膜轉(zhuǎn)運蛋白也有所增加，從而將鐵貯存在細胞內(nèi)成像。

報告基因的優(yōu)勢在于：（1）只有活細胞才能表達報告基因；（2）報告基因會隨細胞分裂傳給子細胞，不會導(dǎo)致標記稀釋；（3）將報告基因整合與特定細胞產(chǎn)物的啟動子相連，報告基因可反應(yīng)干細胞的分化類型。

使用金屬蛋白酶報告基因為基礎(chǔ)的MRI示蹤技術(shù)也不是沒有局限性，需要考慮到時間問題：在細胞內(nèi)的鐵能夠被檢測到均需要時間的積累，因此所檢測到的信號與細胞活力直接的關(guān)系很難理解。

5 異體微膠囊

殼聚糖／藻酸鹽微膠囊是一種新型的生物材料，生物相容性好，擴散性強，允許小分子營養(yǎng)物質(zhì)自由出入細胞，如葡萄糖、氧氣、胰島素等，但限制免疫球蛋白或抗原提呈細胞等進入。因此，可以使得移植的異體細胞免受免疫排斥，也可避免免疫抑制藥物的不良反應(yīng)［23］。

將對比劑標記在膠囊里制備成磁膠囊，可以通過MRI技術(shù)對移植細胞進行非侵入性檢查。因為對比劑并非直接標記細胞，所以可增加對比劑的量而提高敏感度，而不增加細胞毒性［23］。對于干細胞治療，細胞旁分泌機制的作用遠大于直接分化為目的細胞，用微膠囊可提高細胞在宿主體內(nèi)的生存率，減少治療所需細胞數(shù)量［24］。將含有脂肪間充質(zhì)干細胞的磁性微膠囊移植治療急性心肌梗死豬模型，在移植后30d仍可用MRI觀察到標記細胞，而單純用SPIO標記的細胞則出現(xiàn)信號的缺失，表明磁性微膠囊可使細胞更好地停留在缺血心肌中，但在改善心肌梗死面積及心功能方面，兩組間無明顯差異［25］。磁性微膠囊不影響細胞活性及功能，且有利于體內(nèi)細胞示蹤，具有廣泛的應(yīng)用前景。

6 展 望

理想的MRI細胞標記技術(shù)應(yīng)該滿足以下特征：有較好的生物相容性，低毒或無毒，敏感度高，穩(wěn)定性強，較高的信噪比，不會隨細胞分裂增殖而稀釋，也不會轉(zhuǎn)染周圍細胞，允許長時間示蹤細胞。如果滿足上述各種條件，則可通過MRI進行細胞的實時監(jiān)測，并可在MRI引導(dǎo)下進行細胞精確移植。盡管目前尚無對比劑滿足上述所有標準，但隨著細胞示蹤技術(shù)研究的深入，相信MRI細胞示蹤技術(shù)會對細胞治療帶來深遠影響。

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