拓步雄 李超民 葉明霞 劉 薇 李 慧

解放軍第四五一醫(yī)院心血管內(nèi)科，陜西西安710054

二十二碳六烯酸對白介素1β誘導(dǎo)的動脈平滑肌細(xì)胞增殖和遷移的影響及機(jī)制探究

拓步雄 李超民 葉明霞 劉 薇 李 慧▲

解放軍第四五一醫(yī)院心血管內(nèi)科，陜西西安710054

目的探討二十二碳六烯酸（DHA）對白介素1β（IL-1β）誘導(dǎo)的動脈平滑肌細(xì)胞增殖和遷移的影響及機(jī)制。方法血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）培養(yǎng)及傳代后，分為對照組、IL-1β組、DHA組、IL-1β和DHA處理組四組，其中對照組細(xì)胞加入50μL磷酸鹽緩沖液（PBS）；IL-1β組細(xì)胞加入10 ng/mL IL-1β；DHA組細(xì)胞加入80μmol/L DHA；IL-1β和DHA處理組加入10 ng/mL IL-1β和80μmol/L DHA，培養(yǎng)48 h后，噻唑藍(lán)（MTT）法和Transwell法檢測VSMCs的增殖和遷移情況；qRT-PCR和Western blotting技術(shù)檢測基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-2、MMP-9、組織金屬蛋白酶抑制劑（TIMP）-1、TIMP-2和Notch3的表達(dá)情況。結(jié)果VSMCs的增殖率和遷移能力經(jīng)IL-1β處理后顯著增高，而IL-1β和DHA處理組顯著低于IL-1β處理組（F=25.537，P=0.003）；MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2的表達(dá)量經(jīng)IL-1β處理后顯著增高，而經(jīng)IL-1β和DHA共處理后顯著低于IL-1β組（MMP-2：F= 34.286，P=0.000；TIMP-2：F=21.034，P=0.009；MMP-9：F=31.732，P=0.000；TIMP-1：F=18.213，P=0.021）；IL-1β組細(xì)胞Notch3表達(dá)量顯著降低，IL-1β和DHA處理組中Notch3的表達(dá)水平則顯著高于IL-1β處理組（F=39.235，P= 0.000）。結(jié)論DHA可通過Notch信號通路抑制VSMCs的增殖和遷移。

二十二碳六烯酸；白介素1β；基質(zhì)金屬蛋白酶-2；基質(zhì)金屬蛋白酶-9；組織金屬蛋白酶抑制劑-1；組織金屬蛋白酶抑制劑-2；Notch3

血管壁結(jié)構(gòu)的改變是高血壓病理改變的普遍特征。目前普遍認(rèn)為，高血壓基本病理改變是血管重塑。動脈壁中膜肥厚是高血壓血管壁增厚的主要原因，這與血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）的增殖和遷移密切相關(guān)。研究表明多不飽和脂肪酸如二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic Acid，DHA）可降低心血管疾病的發(fā)病率和病死率[1]。DHA除了具有很好的降血脂作用外，還可以通過影響內(nèi)皮細(xì)胞和VSMCs的生物學(xué)行為進(jìn)而調(diào)節(jié)血壓。在炎性反應(yīng)中DHA可降低VSMCs的增殖和遷移[2-3]。研究表明，在高血壓、血管再狹窄和動脈粥樣硬化過程中VSMCs的增殖和遷移與基質(zhì)金屬蛋白酶（matrixmetalloproteinase，MMP）降解細(xì)胞外基質(zhì)密切相關(guān)[4]。當(dāng)血管損傷后炎癥因子高表達(dá)，上調(diào)MMP-2和MMP-9，使細(xì)胞外基質(zhì)大量降解，加速了VSMCs向血管內(nèi)膜遷移，導(dǎo)致血管壁增厚，引起血壓上升，血栓形成[5-6]。目前，有關(guān)DHA的降血壓機(jī)制的研究尚不多見。本文通過研究DHA對VSMCs增殖及遷移的影響，以及對基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制劑含量的變化探討了DHA對高血壓的影響及機(jī)制。

表1 引物列表

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雄性SD大鼠，山東綠葉制藥有限公司動物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號：20030020；干粉培養(yǎng)基（DMEM），美國Gibco公司生產(chǎn)；Trizol，加拿大Invitrogen公司提供；Quantscript RT kit，總RNA提取試劑盒購自于Takara公司；瓊脂糖購自于BioWest公司；RIPA裂解液，購自于美國Millipore公司；DHA、噻唑藍(lán)（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）和胰蛋白酶購自于Sigma公司；水套式二氧化碳孵箱，美國Nuaire公司生產(chǎn)；超凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備公司生產(chǎn)；PCR儀：MJResearch INC生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)8周齡的雄性大鼠，頸椎脫臼處死，取胸主動脈，放入磷酸鹽緩沖液（PBS）中清洗。剝?nèi)用}外膜及內(nèi)膜，取血管的中層組織洗凈后剪成1mm2大小的組織塊，按組織貼塊法接種于200mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，于5%CO2、37℃下培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞達(dá)到80%的融合后，用2.5 g/L的胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組處理消化細(xì)胞并收集細(xì)胞懸液，將細(xì)胞以1×105/孔接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，然后將細(xì)胞隨機(jī)分為四組：對照組細(xì)胞加入50μLPBS培養(yǎng)48 h； IL-1β組細(xì)胞加入10 ng/mL IL-1β共培養(yǎng)48 h；DHA組細(xì)胞加入80μmol/L DHA培養(yǎng)48 h；IL-1β和DHA處理組細(xì)胞加入10 ng/mL IL-1β和80μmol/L DHA培養(yǎng)48 h。

1.2.3MTT檢測細(xì)胞增殖細(xì)胞增殖采用MTT法進(jìn)行檢測。細(xì)胞消化后通過計數(shù)板計數(shù)，將細(xì)胞以1×104/孔的密度接種至96孔培養(yǎng)板中。接種12 h后，按上述分組方法進(jìn)行培養(yǎng)。每組做6個重復(fù)。培養(yǎng)48 h后每孔加入5 g/L的MTT 20μL，37℃恒溫箱中培養(yǎng)4 h，去上清，每孔加入200μL DMSO，振搖20 min，用紫外分光光度計測定570 nm下的光密度值（OD）。

1.2.4 Transwe l l法檢測細(xì)胞侵襲在24孔Transwell上室聚碳酸酯膜（膜孔徑8μm）上涂1 g/L的matrigel 70μL，37℃，60 min使之在微孔濾膜上重組為基底膜結(jié)構(gòu)。取對數(shù)生長期的VSMCs，以DMEM培養(yǎng)液[不加胎牛血清（FBS）]，調(diào)整細(xì)胞懸液中細(xì)胞數(shù)為l×105/mL，取200μL細(xì)胞懸液接種于Transwell上室內(nèi)，下室加入10%FBS的DMEM培養(yǎng)液500μL，37℃，5%CO2培養(yǎng)24 h后，將濾膜上層細(xì)胞用棉簽?zāi)ㄈ?，濾膜以甲醇固定，然后用結(jié)晶紫染色15min。100倍光鏡下選擇膜上、下、左、右、中5個不同視野的穿過膜細(xì)胞數(shù)，求平均值。

1.2.5 qRT-PCR檢測VSMCs細(xì)胞分組處理48 h后，利用PBS清洗細(xì)胞3遍，然后胰酶消化收集細(xì)胞，依據(jù)試劑盒說明，采用Trizol（Invitrogen，CA）抽提法提取總RNA，提取出的RNA用紫外分光光度計測OD值，以確定RNA的濃度和純度；采用Quantscript RT kit反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件：94℃，1.5min；94℃，1 min；64℃，1 min；72℃，1 min 40個循環(huán)，最后在72℃下延伸10 min，同樣的方法擴(kuò)增內(nèi)參基因三磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）。引物信息見表1。

1.2.6 Wes te rn b l ot t ing檢測蛋白表達(dá)細(xì)胞分組處理48 h后，利用PBS清洗細(xì)胞3遍，然后胰酶消化收集細(xì)胞，用RIPA細(xì)胞蛋白裂解液提取細(xì)胞中的蛋白，二辛可酸（BCA）法測定蛋白濃度。蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳，上樣量為40μg/行，電泳完畢后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜進(jìn)行如下處理：牛血清白蛋白（BSA）封閉過夜，一抗（1∶1000比例稀釋）室溫?fù)嵊? h，磷酸鹽吐溫緩沖液（PBST）洗滌3次，辣根過氧化物酶（HRP）-IgG（1∶100比例稀釋）室溫?fù)嵊? h，PBST洗滌3次，電化學(xué)發(fā)光（ECL）顯色，暗室曝光。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 13.0對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩兩比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 VSMCs的增殖情況

MTT法檢測VSMCs的增殖情況，結(jié)果顯示，DHA組VSMCs的相對增殖率與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；而IL-1β組VSMCs的相對增殖率顯著增高（P＜0.05）；IL-1β和DHA共處理組VSMCs的相對增殖率與IL-1β組VSMCs的相對增殖率相比顯著下降（P＜0.01）。見圖1。

圖1 不同處理組血管平滑肌細(xì)胞的相對增殖率

2.2 VSMCs的遷移情況

Transwell法檢測VSMCs的遷移，結(jié)果顯示，DHA組VSMCs的穿膜均數(shù)為（18.24±5.31）個，與對照組[（22.17±4.58）個]比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；IL-1β組VSMCs的穿膜均數(shù)高達(dá)（64.72±21.35）個，顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；當(dāng)經(jīng)IL-1β處理的VSMCs與DHA共培養(yǎng)時，VSMCs的穿膜數(shù)量為（38.94±8.45）個，顯著低于IL-1β組VSMCs的穿膜數(shù)量，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 VSMCs中MMP-2、TIMP-2、MMP-9和TIMP-1的表達(dá)

Western blotting檢測MMP-2、TIMP-2、MMP-9及TIMP-1在VSMCs中的表達(dá)，結(jié)果顯示，與對照組比較，DHA組VSMCs中MMP-2、TIMP-2、MMP-9、TIMP-1的表達(dá)量和MMP-2/TIMP-2、MMP-9/TIMP-1的比值改變不顯著，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；而IL-1β組的VSMCs中MMP-2、TIMP-2、MMP-9、TIMP-1的表達(dá)量和MMP-2/TIMP-2、MMP-9/TIMP-1的比值顯著增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。當(dāng)經(jīng)IL-1β處理的VSMCs與DHA共培養(yǎng)48 h后，細(xì)胞中的MMP-2、MMP-9的表達(dá)量和MMP-2/TIMP-2、MMP-9/TIMP-1的比值與IL-1β組相比有顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2、3。

圖2 不同處理組血管平滑肌細(xì)胞中MMP-2和TIMP-2的表達(dá)

2.4 Notch信號通路關(guān)鍵調(diào)控因子Notch3在VSMCs中的表達(dá)

DHA組VSMCs中Notch3的表達(dá)量與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；Notch3在IL-1β組VSMCs中的表達(dá)量顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；當(dāng)經(jīng)IL-1β處理的VSMCs與DHA共培養(yǎng)48 h后，VSMCs中的Notch3表達(dá)量與IL-1β組相比顯著增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示DHA對VSMCs增殖和遷移的抑制作用是通過Notch信號通路實(shí)現(xiàn)的。見圖4。

3 討論

圖3 不同處理組血管平滑肌細(xì)胞中MMP-9和TIMP-1的表達(dá)

VSMCs是構(gòu)成血管壁的重要組成成分，其增殖過度是導(dǎo)致多種心血管疾病，尤其是高血壓、動脈粥樣硬化、血管再狹窄等的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[7-8]。正常成熟的血管中VSMCs處于分化狀態(tài)，當(dāng)局部血管在炎癥因子等刺激作用下?lián)p傷后，局部釋放大量細(xì)胞因子和生長因子，使位于中膜的VSMCs表型發(fā)生改變，導(dǎo)致細(xì)胞收縮功能消失，并由中膜向內(nèi)膜遷移、增殖，同時分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)（extra-cellularmatrix，ECM）。本實(shí)驗(yàn)用炎癥因子IL-1β對VSMCs進(jìn)行了處理，誘導(dǎo)VSMCs細(xì)胞發(fā)生炎性反應(yīng)，引起其大量增殖，然后用DHA進(jìn)行處理，比較不同處理組VSMCs中MMP-2和MMP-9及其抑制劑的表達(dá)差異，并對Notch信號途徑中的主要調(diào)控因子Notch3進(jìn)行了檢測，探討DHA對VSMCs增殖和遷移的影響及機(jī)制。

MMPs是一類可降解ECM的鋅蛋白酶家族，以酶原的形式分泌，由其他蛋白酶或炎癥因子激活，在組織重構(gòu)及ECM的動態(tài)平衡中發(fā)揮著重要作用[9]。TIMPs是MMPs的主要抑制劑，主要由肌成纖維細(xì)胞、VSMCs、激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞等分泌，其分泌為基本的生理所需，隨MMPs的表達(dá)而表達(dá)，二者維持在一定的比例，調(diào)節(jié)ECM的動態(tài)平衡，若二者的比例失衡，將引起多種病理反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)IL-1β誘導(dǎo)的VSMCs的增殖及遷移能力顯著增高，且MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2的表達(dá)量顯著上調(diào)，MMP-2/TIMP-2、MMP-9/TIMP-1的比值均顯著增高，比例失調(diào)。與DHA共培養(yǎng)后VSMCs的增殖及遷移能力顯著下降，MMP-2和MMP-9的表達(dá)量及MMP-2/TIMP-2、MMP-9/TIMP-1的比值都表現(xiàn)為顯著下調(diào)。說明VSMCs的增殖及遷移與MMP-2/TIMP-2、MMP-9/TIMP-1的比例失衡具有相關(guān)性，DHA可以降低MMP-2和MMP-9的表達(dá)量，從而降低MMP-2/TIMP-2、MMP-9/TIMP-1的比值，對抑制VSMCs的增殖及遷移發(fā)揮重要的作用。

圖4 不同處理組血管平滑肌細(xì)胞中Notch3的表達(dá)

Notch信號通路一條最初發(fā)現(xiàn)于果蠅、高度保守的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，廣泛存在于各種生物體內(nèi)。Armulik等[10]的研究發(fā)現(xiàn)Notch信號通路在調(diào)節(jié)VSMCs形態(tài)和功能中發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)：經(jīng)IL-1β處理的VSMCs中低表達(dá)Notch3；經(jīng)IL-1β處理的VSMCs與DHA共培養(yǎng)后Notch3的表達(dá)量表現(xiàn)為顯著增高，VSMCs的增殖和遷移能力也顯著降低，說明Notch3在DHA抑制平滑肌細(xì)胞增殖和遷移中發(fā)揮重要作用。

DHA對VSMCs生理功能的調(diào)節(jié)作用已被多個研究所報道[11-12]。有研究認(rèn)為ω-3不飽和脂肪酸特別是DHA一方面極易與膜磷脂或三酰甘油相融合并增加VSMCs膜固醇類的流動從而對與胞膜密切相關(guān)的信號分子產(chǎn)生影響[13]，而另一方面對細(xì)胞膜離子通道進(jìn)行調(diào)控，最終調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[14]。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)DHA可以降低炎性反應(yīng)所引起的VSMCs中MMP-2和MMP-9的高表達(dá)，調(diào)節(jié)MMP-2/TIMP-2、MMP-9/TIMP-1的比例，抑制VSMCs的增殖和遷移，在高血壓的病理過程中發(fā)揮重要作用。同時，本研究發(fā)現(xiàn)DHA發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的過程中Notch3起到了關(guān)鍵性的作用，此結(jié)果提示DHA作用的發(fā)揮可能是通過Notch信號通路實(shí)現(xiàn)的。

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Effect and mechanism study of Docosahexaenoic Acid for vascular smooth muscle cells proliferation and m igration induced by IL-1β

TUO Buxiong LIChaomin YEMingxia LIUWei LIHui▲
Department of Cardiology,the 451st Hospital of PLA,Shaanxi Province,Xi′an 710054,China

Objective To study the effect and mechanism study of Docosahexaenoic Acid(DHA)for vascular smooth muscle cells(VSMC)proliferation and migration induced by interleukin(IL-1β).Methods Subcultured VSMCswere divided into four groups:control group,DHA group,IL-1βgroup and IL-1βcombined with DHA group.Cells were cocultured with 50μL PBS in control group,with 10 ng/mL IL-1βin IL-1βgroup,with 80μmol/L DHA in DHA group,with 10 ng/mL IL-1βand 80μmol/L DHA in IL-1βcombined with DHA group for 48 h.MTT and Transwell methodswere used to detect VSMCs proliferation andmigration.qRT-PCR and Western blottingmethodswere used to measure the expression ofmatrixmetalloproteinase(MMP)-2,MMP-9,tissue inhibitor ofmetalloproteinase(TIMP)-1, TIMP-2 and Notch3.Results The proliferation and migration of VSMCs significantly increased in IL-1βgroup,while the proliferation andmigration ability of VSMCs significantly decreased compared with IL-1βgroup(F=25.537,P=0.003). In IL-1βgroup,the expression of MMP-2,MMP-9,TIMP-1 and TIMP-2 significantly increased(P＜0.05),whereas the expression of MMP-2,MMP-9,TIMP-1 and TIMP-2 in IL-1βcombined with DHA group significantly decreased compared with IL-1βgroup(MMP-2:F=34.286,P=0.000;TIMP-2:F=21.034,P=0.009;MMP-9:F=31.732,P=0.000; TIMP-1:F=18.213,P=0.021).The expression of Notch3 in IL-1βgroup was significantly lower,while in the IL-1β combined with DHA group the expression of Notch3 was significantly higher than that in the IL-1βgroup(F=39.235, P=0.000).Conclusion DHA can inhibit VSMCs proliferation and migration through the Notch signaling pathway.

Docosahexaenoic Acid;IL-1β;MMP-2;MMP-9;TIMP-1;TIMP-2;Notch3

R544.1

A

1673-7210（2014）09（c）-0021-05

2014-05-25本文編輯：衛(wèi)軻）

▲通訊作者