歐 瓊 黃余良 張群鋒

南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖南衡陽421001

外源性硫化氫對去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨代謝及護(hù)骨素/細(xì)胞核因子κB受體活化因子配體表達(dá)的影響

歐 瓊 黃余良 張群鋒

南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖南衡陽421001

目的探討外源性硫化氫（H2S）對去卵巢骨質(zhì)疏松（OP）大鼠骨代謝及護(hù)骨素（OPG）和細(xì)胞核因子κB受體活化因子配體（RANKL）表達(dá)的影響。方法將50只健康SD雌性大鼠隨機(jī)分為對照組、去卵巢OP模型組和外源性H2S供體硫氫化鈉（NaHS）（10、50、100μmol/kg）組，每組10只。12周后檢測各組大鼠的尿鈣和尿脫氧吡啶啉（Dpd）及血清鈣、磷、堿性磷酸酶（ALP）和雌二醇（E2）水平，采用雙能X線吸收法測量大鼠右側(cè)股骨的骨密度（BMD），采用Western blot檢測股骨中OPG和RANKL的表達(dá)。結(jié)果與對照組比較，去卵巢OP模型組大鼠血清E2[（76.83±8.12）pmol/L比（11.05±1.42）pmol/L，t=5.74，P＜0.05]和BMD水平[（0.25±0.03）g/cm2比（0.14±0.01）g/cm2，t=3.85，P＜0.05]顯著降低，尿鈣[（0.85±0.08）mg/L比（1.88±0.21）mg/L，t=4.65，P＜0.05]、尿Dpd[（14.67±1.28）nmol/mmol比（22.34±1.75）nmol/mmol，t=3.81，P＜0.05]、血清鈣[（3.29±0.27）mmol/L比（4.68±0.52）mmol/L，t=3.98，P＜0.05]、血清磷[（2.49±0.35）mmol/L比（4.03±0.59）mmol/L，t=4.31，P＜0.05]和ALP水平[（78.65±5.23）U/L比（167.35±1.75）U/L，t=4.47，P＜0.05]均顯著升高；OPG的表達(dá)顯著降低[（0.68±0.09）比（0.27±0.04），t=3.82，P＜0.05]，而RANKL的表達(dá)顯著增加[（0.18±0.02）比（0.66±0.09），t=3.91，P＜0.05]。與去卵巢OP模型組比較，NaHS（50、100μmol/kg）組大鼠股骨的BMD顯著增加[（0.14±0.01）g/cm2比（0.19±0.02）g/cm2和（0.23±0.03）g/cm2，F(xiàn)=6.42，P＜0.05]，尿鈣[（1.88± 0.21）mg/L比（1.39±0.09）mg/L和（0.97±0.09）mg/L，F(xiàn)=4.67，P＜0.05]、尿Dpd[（22.34±1.75）nmol/mmol比（18.43± 2.04）nmol/mmol和（15.75±1.14）nmol/mmol，F(xiàn)=3.92，P＜0.05]、血清鈣[（4.68±0.52）mmol/L比（3.98±0.47）mmol/L和（3.56±0.25）mmol/L，F(xiàn)=3.89，P＜0.05]、血清磷[（4.03±0.59）mmol/L比（3.11±0.42）mmol/L和（2.68±0.26）mmol/L，F(xiàn)= 4.23，P＜0.05]和ALP水平[（167.35±1.75）U/L比（115.69±8.72）U/L和（87.61±9.56）U/L，F(xiàn)=4.15，P＜0.05]顯著降低，OPG的表達(dá)顯著增加[（0.27±0.04）比（0.48±0.05）和（0.64±0.08），F(xiàn)=4.84，P＜0.05]，而RANKL的表達(dá)顯著降低[（0.66±0.09）比（0.37±0.05）和（0.22±0.04），F(xiàn)=5.16，P＜0.05]。結(jié)論外源性H2S抑制了卵巢切除所引起的OP，其作用機(jī)制可能與H2S上調(diào)骨組織中OPG的表達(dá)而降低RANKL的表達(dá)有關(guān)。

硫化氫；去卵巢；骨質(zhì)疏松；護(hù)骨素；細(xì)胞核因子кB受體活化因子配體

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis，OP）是一種代謝性骨骼疾病，以骨量減少、骨質(zhì)丟失、骨微觀結(jié)構(gòu)退化、脆性增加和易發(fā)生骨折為特征[1]。OP多發(fā)于60歲以上老年人，尤其是絕經(jīng)后的婦女發(fā)病率更高，稱為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（postmenopausal osteoporosis，PMOP）[2]。目前的研究認(rèn)為PMOP的發(fā)生與體內(nèi)雌激素的減少有關(guān)，因此對PMOP的治療目前多采用的激素替代療法，但是激素替代療法可能增乳腺癌和子宮內(nèi)膜癌的風(fēng)險(xiǎn)[3]，因此尋找新的防治PMOP的途徑具有十分重要的意義。硫化氫（hydrogen sulfide，H2S）是一種具有腐臭雞蛋氣味的氣體，被認(rèn)為體內(nèi)的第三種氣體信號分子。H2S在體內(nèi)廣泛分布，心血管、內(nèi)臟、神經(jīng)系統(tǒng)和骨骼均有分布[4]。H2S具有廣泛的生理作用，也參與了許多疾病的發(fā)生發(fā)展。研究顯示H2S能保護(hù)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞的損傷，保護(hù)成骨細(xì)胞的功能[5-6]。因此本研究選擇去卵巢大鼠作為研究對象，模擬PMOP，用硫氫化鈉（sodium hydrosulfide，NaHS）作為外源性H2S的供體，觀察外源性H2S對PMOP的影響，并從護(hù)骨素（osteoprotegerin，OPG）和細(xì)胞核因子кB受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor kappa B ligand，RANKL）系統(tǒng)的角度探討H2S抗OP的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

NaHS（Sigma公司），雌二醇（E2）放免法檢測試劑盒（北京東雅生物工程公司），尿鈣鄰甲酚酞絡(luò)合酮法檢測試劑盒（南京天鼎生物技術(shù)研究所），脫氧吡啶啉ELISA法檢測試劑盒（上海億欣生物科技有限公司），BCA蛋白定量試劑為Pierce公司產(chǎn)品，兔抗鼠OPG、破骨細(xì)胞分化因子（RANKL）和磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）抗體以及辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗（美國Santa Cruz公司），LUNAR-DPXIC型骨密度儀（GE公司），HITACH717全自動生化分析儀（日本日立公司），全自動γ計(jì)數(shù)儀（上海第二儀器廠），MRXⅡ型酶標(biāo)儀（美國Dynex公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動物模型制備和分組清潔級成年雌性健康未交配SD大鼠50只，6個(gè)月齡，體重（250±20）g，由南華大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物學(xué)部提供。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，于術(shù)前禁食過夜，自由飲水；選取其中40只大鼠用3.6%水合氯醛（10 mL/kg體重）腹腔注射麻醉，仰面固定，腹部常規(guī)消毒，做腹正中切口，找到雙角子宮，沿子宮找到雙側(cè)卵巢，分離周圍脂肪組織，完整摘除雙側(cè)卵巢。術(shù)后待大鼠自然清醒，青霉素（4萬U/只）治療3 d。雙側(cè)卵巢切除大鼠隨機(jī)分成四組：去卵巢模型組、NaHS組（10、50、100μmol/kg）處理組，每組10只。剩下10只大鼠為對照組，進(jìn)行假手術(shù)，不切除雙側(cè)卵巢。NaHS組大鼠腹腔注射用生理鹽水溶解的NaHS，對照組和模型組給予等量生理鹽水。大鼠由專人飼養(yǎng)，自由進(jìn)食和飲水，12 h光照，溫度控制在（22±3）℃。實(shí)驗(yàn)期為12周，實(shí)驗(yàn)過程中沒有大鼠死亡。

1.2.2 骨代謝相關(guān)生化指標(biāo)測定實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，3.6%水合氯醛（10mL/kg體重）腹腔注射麻醉，打開胸腔，心臟放血，處死大鼠。留取膀胱中的尿液，采用鄰甲酚酞絡(luò)合酮法測定尿鈣水平，采用ELISA方法測定尿脫氧吡啶啉（deoxypyridinoline，Dpd）水平，結(jié)果以每mmol肌酐（Cr）表示。取血清，用全自動生化分析儀測定血清鈣、磷和血堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）水平，采用放免法測量血清E2水平。

1.2.3 股骨骨密度（boneminara l densi t y，BMD）檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)束大鼠處死后，迅速剔出大鼠的股骨，剔除周圍的軟組織，將右側(cè)股骨用鹽水紗布包裹置于凍存管中放入-80℃保存。然后用LUNAR-DPXIC型骨密度儀，采用雙能X線吸收法測量大鼠右側(cè)股骨中段的骨密度。

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡法檢測OPG和RANKL表達(dá)大鼠處死后，迅速剔出大鼠的股骨，剔除周圍的軟組織，在-80℃保存。取股骨組織約200mg，加1mL細(xì)胞裂解液Buffer勻漿機(jī)中磨碎勻漿。4℃，2000 r/min離心30 min，取出上清液。采用總蛋白提取試劑盒按說明操作提取股骨組織總蛋白。BAC法測定蛋白濃度。取100μL蛋白質(zhì)樣本加入2×SDS凝膠加樣緩沖液中煮沸使蛋白質(zhì)變性。用6%SDS-聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳1 h分離蛋白，將分離的蛋白用半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，麗春紅染色觀察轉(zhuǎn)移效果。10%脫脂牛奶室溫下封閉2 h，加入兔抗鼠OPG（1∶200）和RANKL（1∶150）一抗，4℃過夜。TBST洗膜3次后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫下孵育2 h。蛋白質(zhì)印跡熒光檢測試劑盒顯示于X線光片，經(jīng)顯影、定影后凝膠圖像分析系統(tǒng)對膠片掃描，進(jìn)行半定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 H2S對去卵巢OP大鼠骨代謝相關(guān)指標(biāo)的影響

與對照組比較，去卵巢OP模型組大鼠血清E2水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.74，P＜0.05）；NaHS（10、50、100μmol/kg）組與對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示NaHS沒有影響大鼠體內(nèi)的E2水平。與對照組比較，去卵巢OP模型組大鼠尿鈣、尿Dpd、血清鈣、血清磷和ALP水平顯著增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.65、3.81、3.98、4.31、4.47，均P＜0.05）。與去卵巢OP模型組比較，NaHS（50、100μmol/kg）組大鼠尿鈣、尿Dpd、血清鈣、血清磷和ALP水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=4.67、3.92、3.89、4.23、4.15，均P＜0.05）。見表1、2。

表1 各組大鼠血清雌二醇、尿鈣和尿脫氧吡啶啉水平比較（x±s）

表2 各組大鼠血清鈣、血清磷和堿性磷酸酶水平的變化（x±s）

2.2 H2S對去卵巢OP大鼠BMD的影響

雙側(cè)卵巢切除后12周后取各組大鼠右側(cè)股骨，用雙能X線吸收法分別測定各組大鼠右側(cè)股骨中段的BMD。結(jié)果如圖1所示：與對照組比較，對去卵巢OP模型組大鼠股骨的BMD顯著降低[（0.25±0.03）g/cm2和（0.14±0.01）g/cm2，t=3.85，P＜0.05）；與對去卵巢OP模型組比較，NaHS（50、100μmol/kg）組大鼠股骨的BMD顯著增加[（0.14±0.01）g/cm2比（0.19±0.02）g/cm2和（0.23±0.03）g/cm2，F(xiàn)=6.42，P＜0.05）。

圖1 硫化氫對去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨密度的影響

2.3 H2S對去卵巢OP大鼠股骨中OPG和RANKL表達(dá)的影響

雙側(cè)卵巢切除后12周后取各組大鼠左側(cè)股骨，采用Western blot檢測大鼠股骨中OPG和RANKL的表達(dá)。結(jié)果如圖2所示：與對照組比較，去卵巢OP模型組大鼠股骨中OPG的表達(dá)顯著降低[（0.68± 0.09）和（0.27±0.04），t=3.82，P＜0.05]，而RANKL的表達(dá)顯著升高[（0.18±0.02）和（0.66±0.09），t=3.91，P＜0.05]；與去卵巢OP模型組比較，NaHS（50、100μmol/ kg）組大鼠股骨中OPG的顯著升高[（0.27±0.04）比（0.48±0.05）和（0.64±0.08），F(xiàn)=4.84，P＜0.05），而RANKL的表達(dá)顯著降低[（0.66±0.09）比（0.37±0.05）和（0.22±0.04），F(xiàn)=5.16，P＜0.05]。

圖2 硫化氫對去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠股骨中護(hù)骨素和細(xì)胞核因子κB受體活化因子配體表達(dá)的影響

3 討論

OP多發(fā)生于絕經(jīng)后女性、老年人以及慢性病患者。OP的主要病理過程是在骨代謝過程中骨形成和骨吸收之間的失衡，導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)的鈣磷代謝失衡，骨質(zhì)丟失和骨密度減少。卵巢切除大鼠是研究PMOP的經(jīng)典動物模型，大鼠切除卵巢后，體內(nèi)雌激素的水平急劇降低，由于雌激素水平降低誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化和增殖，使骨形成減少而骨吸收增加，導(dǎo)致骨小梁數(shù)量減少、骨體積分?jǐn)?shù)百分比降低和骨小梁的厚度變薄，最終引發(fā)OP[7-8]。復(fù)制PMOP動物模型常選擇6～9個(gè)月的雌性大鼠，切除雙側(cè)卵巢，3個(gè)月后可形成OP大鼠模型。由于6～9個(gè)月的雌性大鼠骨的生長進(jìn)入靜止期，骨骺開始閉合，10個(gè)月左右達(dá)到峰值骨量，骨的代謝進(jìn)入一個(gè)相對穩(wěn)定的時(shí)期。切除雌性大鼠卵巢后，使松質(zhì)骨的骨轉(zhuǎn)換加快，骨量減少，骨強(qiáng)度和密度降低，這些特點(diǎn)類似于人絕經(jīng)后的骨丟失導(dǎo)致OP的情況[9]。

骨形成和骨吸收兩者緊密相聯(lián)，骨代謝生化指標(biāo)可反映骨代謝的情況，也反映骨的丟失。骨組織中含有大量的鈣和磷，骨被吸收時(shí)骨鈣和骨磷釋放入血，使血鈣和血磷水平增加，然后鈣可從尿液中排出，使尿鈣水平增加，因此尿鈣、血鈣和血磷水平可反映骨吸收和骨丟失的狀態(tài)。Dpd是骨骼內(nèi)Ⅰ型膠原的重要組成成分，是骨骼的特異性標(biāo)志物，參與骨膠原合成過程中膠原分子間的交叉連接。在骨代謝中，骨溶解使骨膠原蛋白水解，而釋放出Dpd進(jìn)入血液中，最后從腎臟排出。因此尿Dpd水平可反映骨吸收的情況[10]。ALP是評價(jià)骨形成和骨轉(zhuǎn)換最常用的指標(biāo)。血清中ALP大約有50%來源于骨骼，ALP的活性可反映成骨細(xì)胞活性和狀態(tài)，雌激素的減少使其對破骨細(xì)胞的抑制作用解除，骨的吸收增加，隨之骨的形成也增加，導(dǎo)致高轉(zhuǎn)換型OP，ALP值也相應(yīng)增加[11]。本研究中通過切除SD大鼠的雙側(cè)卵巢來模擬PMOP的發(fā)生，在卵巢切除12周后，模型組大鼠與假手術(shù)對照組相比，血清E2水平和BMD降低，骨密度顯著降低，尿鈣、尿Dpd、血清鈣、血清磷和ALP水平明顯增加，說明骨代謝處于高轉(zhuǎn)換狀態(tài)，表明PMOP模型建立成功。

H2S是一種具有臭雞蛋氣味的氣體，同NO和CO一樣，具備作為細(xì)胞間以及細(xì)胞內(nèi)傳遞信息的信使物質(zhì)的基本要求，因此被稱為第三種氣體信號分子。在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)，以L-半胱氨酸為底物，主要由胱硫醚-γ-裂解酶、胱硫醚β合成酶、半胱氨酸轉(zhuǎn)移酶和3-巰基丙酮酸轉(zhuǎn)硫酶等催化產(chǎn)生H2S，這是體內(nèi)H2S的主要來源，被稱為內(nèi)源性H2S。H2S有兩種形式存在于體內(nèi)，既NaHS和氣體H2S。NaHS可溶于水，離解為Na+和HS-，而HS-可與H+可結(jié)合生成H2S，H2S和NaHS之間是一種動態(tài)平衡。由于NaHS比氣體H2S更能夠保證H2S濃度的精確性和穩(wěn)定性，常被作為外源性H2S的供體[12]。H2S廣泛分布于內(nèi)臟、心血管、骨骼和神經(jīng)系統(tǒng)等組織系統(tǒng)中，其生理作用非常廣泛，也參與了多種疾病的發(fā)生發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)H2S通過p38和ERK1/2-MAPK信號通路抑制了雙氧水誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞MC3T3-E1細(xì)胞系的氧化損傷，對成骨細(xì)胞具有保護(hù)作用，增強(qiáng)成骨作用[5-6]。也有研究表明H2S可抑制破骨細(xì)胞的增殖，減弱破骨作用[13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明外源性H2S增加了去卵巢OP模型大鼠的BMD，降低了尿鈣、尿Dpd、血清鈣、血清磷和ALP水平。這些結(jié)果表明表明H2S抑制了卵巢切除誘導(dǎo)的OP發(fā)生，參與骨代謝的調(diào)節(jié)和OP的發(fā)生發(fā)展，因此H2S有望成為OP治療的新途徑和新策略，但其抗OP的機(jī)制還不清楚。

OPG是成骨細(xì)胞分泌的一種蛋白質(zhì)，它屬于腫瘤壞死因子受體超家族的成員。RANKL是OPG的配體，又稱破骨細(xì)胞分化因子，主要由成骨細(xì)胞分泌[14]。OPG/RANKL系統(tǒng)在成骨細(xì)胞刺激破骨細(xì)胞成熟的過程中起著十分重要的作用。RANKL與破骨細(xì)胞表面的RANK結(jié)合，通過激活核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和c-Fos、鈣調(diào)磷蛋白磷酸酶、c-Jun N-末端激酶和p38以及絲氨酸-蘇氨酸激酶Akt/PKB等途徑使破骨細(xì)胞前體分化、存活、發(fā)育為成熟破骨細(xì)胞，促進(jìn)骨的吸收。而OPG，由于其結(jié)構(gòu)與RANK十分相似，從而競爭性抑制RANKL與破骨細(xì)胞膜上的RANK結(jié)合，抑制破骨細(xì)胞前體的分化，抑制成熟破骨細(xì)胞的活化，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞凋亡，抑制骨的吸收[15]。RANKL和OPG的比例決定了破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨質(zhì)吸收的發(fā)生、程度和過程[16]。本研究結(jié)果顯示去卵巢OP大鼠股骨組織中OPG的表達(dá)明顯降低，而RANKL的表達(dá)明顯增加；而外源性H2S供體NaHS（50、100μmol/kg）卻上調(diào)了大鼠股骨組織中OPG的表達(dá)，降低了RANKL的表達(dá)。這些結(jié)果說明外源性H2S抑制去卵巢大鼠中骨吸收，促進(jìn)骨形成，具有抗OP的作用可能是通過調(diào)節(jié)OPG/ RANKL系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的。

總之，外源性H2S抑制了卵巢切除所引起的OP，其作用機(jī)制可能與H2S上調(diào)骨組織中OPG的表達(dá)而降低骨組織中RANKL的表達(dá)有關(guān)。本研究為PMOP的防治提供了新的線索和策略。

[1]Rochefort GY.The osteocyte as a therapeutic target in the treatment ofosteoporosis[J].Ther Adv Musculoskelet Dis，2014，6（3）：79-91.

[2]Dodd DZ，RoweDJ.The relationship between postmenopausal osteoporosis and periodontal disease[J].J Dent Hyg，2013，87（6）：336-344.

[3]Thorbjarnardottir T，Olafsdottir EJ，Valdimarsdottir UA，et al.Oral contraceptives，hormone replacement therapy and breast cancer risk：a cohort study of 16 928 women 48 years and older[J].Acta Oncol，2014，53（6）：752-758.

[4]Vacek TP，QipshidzeN，TyagiSC.Hydrogen sulfideand sodium nitroprusside compete to activate/deactivate MMPs in bone tissuehomogenates[J].Vasc Health Risk Manag，2013，9（1）：117-123.

[5]Xu ZS，Wang XY，Xiao DM，etal.Hydrogen sulfide protects MC3T3-E1osteoblastic cellsagainstH2O2-induced oxidative damage-implications for the treatment of osteoporosis[J]. Free Radic Biol Med，2011，50（10）：1314-1323.

[6]Vacek TP，QipshidzeN，TyagiSC.Hydrogensulfideand sodium nitroprusside compete to activate/deactivate MMPs in bone tissuehomogenates[J].Vasc Health Risk Manag，2013，9（1）：117-123.

[7]李義，張建中，宋英.姜黃素對去卵巢骨質(zhì)疏松模型鼠的機(jī)制研究[J].中成藥，2013，35（7）：1359-1362.

[8]陳玲，蔡旺.H13D聯(lián)合Alen對去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨密度及骨生物力學(xué)指標(biāo)的影響[J].山東醫(yī)藥，2013，53（2）：32-34.

[9]張鐵軍，張偉，邊立功，等.白藜蘆醇對去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松癥的保護(hù)作用[J].解剖學(xué)報(bào)，2012，43（5）：679-684.

[10]Kitatani K，Nakatsuka K，Naka H，et al.Clinical usefulness ofmeasurements of urinary deoxypyridinoline（DPD）in patients with postmenopausal osteoporosis receiving intermittent cyclical etidronate：advantage of free form of DPD over total DPD in predicting treatment efficacy[J]. JBone Miner Metab，2003，21（4）：217-224.

[11]Lumachi F，ErmaniM，Camozzi V，et al.Changes of bone formation markers osteocalcin and bone-specific alkaline phosphataseinpostmenopausalwomenwithosteoporosis[J]. Ann N Y Acad Sci，2009，1173（1）：60-63.

[12]Xu DQ，Gao C，Niu W，et al.Sodium hydrosulfide alleviates lung inflammation and cell apoptosis following resuscitated hemorrhagic shock in rats[J].Acta Pharmacol Sin，2013，34（12）：1515-1525.

[13]KurabayashiM.Hydrogen sulfide：a new regulator of osteoclastogenesis[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol，2014，34（3）：471-473.

[14]Guo L，Tang K，Quan Z，et al.Association between seven common OPGgenetic polymorphismsand osteoporosis risk：ameta-analysis[J].DNA Cell Biol，2014，33（1）：29-39.

[15]Yasuda H.RANKL，a necessary chance for clinical application to osteoporosisand cancer-related bonediseases[J]. World JOrthop，2013，4（4）：207-217.

[16]StussM，Rieske P，Cegowska A，etal.AssessmentofOPG/ RANK/RANKL gene expression levels in peripheral blood mononuclear cells（PBMC）after treatmentwith strontium ranelate and ibandronate in patientswith postmenopausal osteoporosis[J].JClin Endocrinol Metab，2013，98（5）：1007-1011.

Effects of extrogenous hydrogen sulfide on the bone m etabolism and expressions of osteoprotegerin and receptor activator of nuclear factor kappa B ligand in ovariectom ized ratsw ith osteoporosis

OU Qiong HUANG Yuliang ZHANG Qunfeng
Department of Gynaecology and Obstetrics,the Second Affiliated Hospital,University of South China,Hu'nan Province, Hengyang 421001,China

Objective To investigate the effect of extrogenous hydrogen sulfide(H2S)on the bonemetabolism and osteoprotegerin/receptor activator of nuclear factor kappa B ligand(OPG/RANKL)expressions in ovariectomized rats with osteoporosis.Methods 50 SD female rats were randomly divided into control group,ovariectomized osteoporosismodel group,and extrogenous H2Sdonator sodium hydrosulfide(NaHS)(10,50,100μmol/kg)treatment group,with 10 rats in each group.After 12 weeks,the levels of urine calcium and deoxypyridinoline(Dpd),serum calcium,serum phosphorus, serum alkaline phosphatase(ALP)and estradiol(E2)weremeasured.Bone mineral density(BMD)wasmeasured by a dual-energy X-ray absorptiometry.The expessions of OPG and RANKL in femur weremeasured by Western blot.Results Compared with the sham control group,the levels of E2in ovariectomized osteoporosismodel group[(76.83±8.12)pmol/L vs(11.05±1.42)pmol/L,t=5.74,P＜0.05]and BMD[(0.25±0.03)g/cm2vs(0.14±0.01)g/cm2,t=3.85,P＜0.05]were significantly decreased,the levels of urine calcium[(0.85±0.08)mg/L vs(1.88±0.21)mg/L,t=4.65,P＜0.05] and Dpd[(14.67±1.28)nmol/mmol vs(22.34±1.75)nmol/mmol，t=3.81，P＜0.05],serum calcium[(0.85±0.08)mg/L vs (1.88±0.21)mg/L,t=4.65,P＜0.05],serum phosphorus[(2.49±0.35)mmol/L vs(4.03±0.59)mmol/L,t=4.31,P＜0.05] and serum ALP[(78.65±5.23)U/L vs(167.35±1.75)U/L,t=4.47,P＜0.05]were significantly increased,the expression of OPG in the ovariectomized osteoporosismodel group was significantly decreased[(0.68±0.09)vs(0.27±0.04),t=3.82, P＜0.05]and the expression of RANKL in the ovariectomized osteoporosis model group was significantly increased [(0.18±0.02)vs(0.66±0.09),t=3.91,P＜0.05]in the ovariectomized osteoporosismodel group.Compared with the ovariectomized osteoporosis model group,the level of BMD in NaHS group(50,100μmol/kg)[(0.14±0.01)g/cm2vs (0.19±0.02)g/cm2and(0.23±0.03)g/cm2，F(xiàn)=6.42，P＜0.05]were significantly increased,the levels of urine calcium [(1.88±0.21)mg/L vs(1.39±0.09)mg/L and(0.97±0.09)mg/L,F=4.67,P＜0.05]and Dpd[(22.34±1.75)nmol/mmol vs (18.43±2.04)nmol/mmol and(15.75±1.14)nmol/mmol,F=3.92,P＜0.05],serum calcium[(4.68±0.52)mmol/L vs(3.98± 0.47)mmol/L and(3.56±0.25)mmol/L,F=3.89,P＜0.05],serum phosphorus[(4.03±0.59)mmol/L vs(3.11±0.42)mmol/L and(2.68±0.26)mmol/L,F=4.23,P＜0.05]and serum ALP[(167.35±1.75)U/L vs(115.69±8.72)U/L and(87.61±9.56)U/L, F=4.15,P＜0.05]were significantly decreased,the expression of OPG in the ovariectomized osteoporosismodel group were significantly up-regulated[(0.27±0.04)vs(0.48±0.05)and(0.64±0.08),F=4.84,P＜0.05]and the expression of RANKL were significantly down-regulated[(0.66±0.09)vs(0.37±0.05)and(0.22±0.04),F=5.16,P＜0.05]in the ovariectomized osteoporosismodel group.Conclusion Extrogenous H2S inhibits the osteoporosis induced by ovariotomy in rats,themechanism may be related to the up-regulation of OPG expression and the down-regulation of RANKL expression induced by H2S.

Hydrogen sulfide;Osteoporosis;Ovariectomized;Osteoprotegerin;Receptor activator of nuclear factor kappa B ligand

R274.9

A

1673-7210（2014）09（c）-0026-05

2014-06-11本文編輯：任念）

歐瓊（1981.9-），女，碩士，主要從事絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的防治研究。