莢敏，黃培林

(東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210009)

胰腺癌是臨床上常見(jiàn)的且死亡率極高的一種消化系統(tǒng)惡性腫瘤。早在2008年估計(jì)全球范圍內(nèi)胰腺癌發(fā)病即為27.7萬(wàn)例，死亡26.6萬(wàn)例[1]。2007年，中國(guó)腫瘤登記地區(qū)腫瘤發(fā)病與死亡分析報(bào)告顯示：胰腺癌發(fā)病位于第7位，死亡率位居第6位[2]。尋求合適的預(yù)測(cè)診斷分子、研究有效的治療手段一直是目前國(guó)內(nèi)外專(zhuān)家的工作重點(diǎn)。

早在1988年，人們就發(fā)現(xiàn)了原癌基因KRAS和胰腺癌之間的關(guān)系[3]，后續(xù)的大量研究結(jié)果顯示，大多胰腺腫瘤中都存在KRAS基因突變。然而，不論是將KRAS分子作為胰腺癌的特異性生物標(biāo)志物的研究，還是嘗試通過(guò)抑制KRAS分子的活性來(lái)治療腫瘤的研究都均以失敗告終。近年來(lái)，隨著一些新技術(shù)的出現(xiàn)，新的研究結(jié)果提示，過(guò)去我們對(duì)KRAS及胰腺癌的很多認(rèn)識(shí)是不準(zhǔn)確的。那么KRAS與胰腺癌的關(guān)系究竟如何？作者就KRAS基因在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中作用的相關(guān)研究進(jìn)展作一綜述。

1 KRAS基因及其突變

1.1 KRAS基因

KRAS基因?qū)儆赗AS基因家族中一員，含有4個(gè)編碼外顯子和1個(gè)5′端非編碼外顯子，共同編碼含189個(gè)氨基酸的膜結(jié)合型KRAS蛋白[4]。KRAS蛋白通過(guò)與GTP/GDP結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化，形成細(xì)胞內(nèi)一種調(diào)節(jié)“開(kāi)關(guān)”。當(dāng)KRAS蛋白與GDP結(jié)合時(shí)，“開(kāi)關(guān)”關(guān)閉，不能激活下游的信號(hào)通路。而在鳥(niǎo)苷酸交換因子(guanine nucleotide exchange factors，GEFs)的作用下，GTP與GDP發(fā)生交換，形成KRAS- GTP復(fù)合物，此時(shí)則可以激活下游信號(hào)通路，使“開(kāi)關(guān)”處于開(kāi)放狀態(tài)。部分KRAS下游信號(hào)分子同時(shí)還可以促進(jìn)GEFs的轉(zhuǎn)化作用，促進(jìn)KRAS活化，形成一種正循環(huán)。然而KRAS并不總處于開(kāi)放狀態(tài)，KRAS本身具備一定的自限性GTP水解活性，此外，細(xì)胞內(nèi)存在一種GTP酶激活蛋白(GTPase- activating proteins，GAPs)可以激活GTP酶水解GTP為GDP，使“開(kāi)關(guān)”重新關(guān)閉，從而使KRAS活化處于一種動(dòng)態(tài)平衡中[5]。

1.2 KRAS 基因突變

在正常細(xì)胞內(nèi)，KRAS通過(guò)與GTP或GDP與循環(huán)結(jié)合使細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化處于平衡穩(wěn)態(tài)中。但當(dāng)KRAS基因發(fā)生突變時(shí)，特別是KRAS與GAPs蛋白結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生改變時(shí)[6]，GTP水解障礙，KRAS蛋白則一直處于活化狀態(tài)，影響信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，使信號(hào)傳遞通路處于持續(xù)激活狀態(tài)，從而導(dǎo)致細(xì)胞向惡性轉(zhuǎn)化成為癌細(xì)胞[5]。

KRAS基因突變一般發(fā)生在腫瘤惡變的早期[7]，KRAS基因常見(jiàn)的突變位點(diǎn)多在2號(hào)外顯子的第12、13密碼子，且多以點(diǎn)突變形式出現(xiàn)。其常見(jiàn)的3種突變類(lèi)型是GGT>GAT(G12D)、GGT>GTT(G12V)、GGC>GAC9 G13D)[8]。

2 KRAS突變與胰腺癌關(guān)系

研究顯示，幾乎所有的胰腺腫瘤中都存在KRAS突變[9- 10]。然而KRAS與胰腺癌的關(guān)系是復(fù)雜的：一方面并非所有KRAS分子均會(huì)與GTP結(jié)合，即使與GTP結(jié)合也不一定能產(chǎn)生KRAS激活的下游效應(yīng)，其他的因素，例如細(xì)胞內(nèi)部的布局可能會(huì)影響KRAS- GTP與下游效應(yīng)分子的結(jié)合[11]；另一方面，即使KRAS與GTP結(jié)合并激活了下游信號(hào)通路也不一定能夠使胰腺細(xì)胞發(fā)生癌變。很多研究發(fā)現(xiàn)，在健康人的不同器官里，如胰腺、結(jié)腸、肺等都可能存在突變狀態(tài)的KRAS分子[12]。有人認(rèn)為，啟動(dòng)腫瘤的發(fā)生需要KRAS活躍達(dá)到一定程度，來(lái)保證其能激活下游信號(hào)通路[9]。因此，即使KRAS已經(jīng)發(fā)生了突變，還需要有其他因素(內(nèi)源性或外源性的)來(lái)促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。

3 KRAS在胰腺癌發(fā)生中的作用

KRAS突變不僅在腫瘤中存在，隨著年齡的增長(zhǎng)，肺、胰腺、結(jié)腸以及其他正常組織中也會(huì)發(fā)生KRAS突變。既然KRAS突變?nèi)绱顺Ｒ?jiàn)，為什么只有小部分人會(huì)患病呢？一種最新的觀點(diǎn)認(rèn)為，原癌基因KRAS并不總處于激活狀態(tài)[13]。換句話(huà)說(shuō)，僅僅有KRAS基因還不足以使細(xì)胞癌變，還可能需要其他的內(nèi)在或外在的環(huán)境因素來(lái)增加KRAS活動(dòng)閾值，去除腫瘤形成過(guò)程中的障礙。

有人認(rèn)為，上皮生長(zhǎng)因子、炎癥刺激等可以刺激KRAS激活，在KRAS誘導(dǎo)的胰腺癌中扮演重要角色[14]。而非甾體類(lèi)抗炎藥或各類(lèi)抗氧化藥物不僅可以降低腫瘤發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，也能夠抑制KRAS的活性。除此之外，人們還發(fā)現(xiàn)細(xì)胞本身對(duì)高水平KRAS活動(dòng)具有一定的耐受性。KRAS的高表達(dá)壓力可能直接導(dǎo)致細(xì)胞衰老或凋亡[15]。那些能夠抑制細(xì)胞凋亡的因素，如抑癌基因如p16或p53[16]的丟失則可能阻止KRAS高表達(dá)壓力所帶來(lái)的細(xì)胞凋亡，從而最終引起腫瘤的發(fā)生。不過(guò)有一些反對(duì)派也堅(jiān)持認(rèn)為，KRAS本身就能抑制細(xì)胞衰老，抑制p16的表達(dá)[17]。然而不管怎樣，如果沒(méi)有KRAS突變，不論是炎癥狀態(tài)還是抑癌基因丟失本身都不足以直接啟動(dòng)胰腺癌的發(fā)生[18]。由此可見(jiàn)，KRAS在胰腺癌的發(fā)生中至關(guān)重要。

4 KRAS在胰腺癌進(jìn)展中的作用

雖然大量的證據(jù)顯示KRAS在胰腺癌的形成中非常重要，但過(guò)去人們對(duì)KRAS在胰腺癌發(fā)展維持中的作用了解相對(duì)較少。近年來(lái)，隨著胰腺癌基因工程鼠模型的創(chuàng)建，人們對(duì)KRAS在胰腺癌形成中的作用有了進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)。

4.1 胰腺癌形成的早期

胰腺癌細(xì)胞的基因組高度不穩(wěn)定，每個(gè)腫瘤的形成都是積累了數(shù)百種突變的結(jié)果[12]。從一個(gè)正常的胰腺細(xì)胞發(fā)展成突變的細(xì)胞需要很多步，每一步都需要基因表達(dá)的改變。顯然，胰腺癌從形成到突變并不是都相同的。早期的人類(lèi)胰腺上皮內(nèi)瘤變內(nèi)存在KRAS突變，通常不伴有其他基因改變[19]，然而，腫瘤的進(jìn)展則需要在抑癌基因例如p16失活的情況下才能發(fā)生。在人體，散在的KRAS突變是可能發(fā)生的，大多情況下這些細(xì)胞會(huì)以凋亡的形式被清除掉，而那些獲得其他突變從而逃逸凋亡的細(xì)胞則發(fā)生癌變。

近年來(lái)，研究者們創(chuàng)建了一種可以逆轉(zhuǎn)胰腺KRAS表達(dá)的老鼠模型，稱(chēng)為KRAS*或iKRAS鼠[20-21]。與常規(guī)表達(dá)內(nèi)源性KRAS蛋白的KC鼠不同，iKRAS鼠并不是從內(nèi)源性KRAS位點(diǎn)表達(dá)KRAS，但其表達(dá)水平卻與內(nèi)源性相當(dāng)。予以iKRAS鼠應(yīng)用蛙皮素(caerulein)可以引起急性胰腺炎，從而形成胰腺上皮內(nèi)瘤變。胰腺內(nèi)廣泛的炎癥可導(dǎo)致胰腺腺管損傷，使腺管向?qū)Ч艿霓D(zhuǎn)化。在正常情況下，胰腺組織修復(fù)隨后迅速進(jìn)行，胰腺將在1周內(nèi)恢復(fù)到正常組織形態(tài)。然而iKRAS鼠的胰腺組織在應(yīng)用蛙皮素后并不能迅速修復(fù)[20，22]，腺管向?qū)Ч苻D(zhuǎn)變形成發(fā)育不良的導(dǎo)管結(jié)構(gòu)，周?chē)鷱V泛纖維化，3周內(nèi)幾乎所有的導(dǎo)管結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出胰腺上皮內(nèi)瘤變的組織結(jié)構(gòu)。

研究發(fā)現(xiàn)，iKRAS鼠需要額外的突變才能從早期的損傷進(jìn)展為腺癌，這也與人類(lèi)胰腺癌的發(fā)展過(guò)程類(lèi)似[23]。在人類(lèi)胰腺腫瘤中通?？梢詸z測(cè)到多重抑癌基因的丟失、失活或者突變。在老鼠中，存在抑癌基因以不同概率散在的丟失，其比率依賴(lài)于炎癥的程度以及KRAS的活動(dòng)水平。例如，在表達(dá)內(nèi)源性KRAS的KC鼠，抑癌基因P53在腫瘤發(fā)展的最后階段突變或者丟失。在表達(dá)高水平KRAS的人造LGL鼠模型中，p16迅速發(fā)生丟失[24]。其可能機(jī)制為，高水平的KRAS為胰腺癌細(xì)胞丟失p16提供一種選擇壓力，從而逃逸KRAS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[15]。

為了探究KRAS信號(hào)在這些改變中的作用，人們研究了在不同階段KRAS表達(dá)失活所帶來(lái)的不同影響。在胰腺上皮內(nèi)瘤變的早期，KRAS失活使發(fā)育不良的導(dǎo)管表達(dá)腺管基因而使導(dǎo)管基因失活，調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞重新分化。如果在胰腺上皮內(nèi)瘤變晚期KRAS失活，細(xì)胞則會(huì)發(fā)生凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，攜帶有p53失活的iKRAS鼠能夠迅速形成胰腺癌，并且伴有高度穿透能力，因此被用來(lái)研究侵襲瘤中KRAS失活帶來(lái)的影響。結(jié)果顯示，此時(shí)KRAS失活則引起腫瘤細(xì)胞增殖、生存能力丟失，從而引發(fā)腫瘤迅速退化[20- 21]。然而，并不是所有的腫瘤細(xì)胞在KRAS失活時(shí)都立即死亡，事實(shí)上有一部分的腫瘤細(xì)胞保持著一種休眠狀態(tài)[25]，一旦KRAS復(fù)活則迅速恢復(fù)生長(zhǎng)，這些休眠細(xì)胞則有可能發(fā)展成為癌干細(xì)胞。這一結(jié)果表明，KRAS不僅在腫瘤形成中重要，在腫瘤的發(fā)展過(guò)程中也同樣重要。

4.2 胰腺癌進(jìn)展

胰腺癌的微環(huán)境中包含了廣泛存在的炎癥介質(zhì)，KRAS在腫瘤的免疫炎癥微環(huán)境中同樣發(fā)揮著作用。在胰腺上皮內(nèi)瘤變形成的最早期，損傷誘導(dǎo)間葉來(lái)源的細(xì)胞形成成纖維細(xì)胞和胰島星狀細(xì)胞。胰腺上皮內(nèi)瘤變的形成和進(jìn)展階段則伴隨著免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)[26]，而KRAS的失活則可以解除與胰腺癌相關(guān)的慢性炎癥狀態(tài)。

KRAS可以調(diào)節(jié)維持微環(huán)境介質(zhì)的各種因子，如白細(xì)胞介素-6(interleukin- 6，IL- 6)、前列腺素E[27]，這些因子都以一種KRAS依賴(lài)的形式表達(dá)[20]。炎癥細(xì)胞因子IL-6在胰腺腫瘤中的過(guò)表達(dá)對(duì)于老鼠胰腺上皮內(nèi)瘤變發(fā)展很重要[28]。前列腺素E通過(guò)前列腺素受體4直接作用于星狀細(xì)胞，促進(jìn)基質(zhì)生成[27]。

同樣，浸潤(rùn)在胰腺癌中的免疫細(xì)胞似乎也受KRAS的調(diào)節(jié)。在鼠胰腺癌模型中，胰腺上皮內(nèi)瘤變組織中浸潤(rùn)有多種免疫細(xì)胞，包括抑制免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、骨髓來(lái)源的抑制性細(xì)胞[26]。表達(dá)KRAS的腫瘤通過(guò)旁分泌方式分泌細(xì)胞因子，如粒細(xì)胞集落刺激因子[29]，募集骨髓來(lái)源的抑制細(xì)胞，從而抑制抗腫瘤的免疫反應(yīng)。KRAS失活導(dǎo)致所有的浸潤(rùn)免疫細(xì)胞數(shù)量下降。因此，胰腺癌內(nèi)的炎癥微環(huán)境似乎在以一種胰腺自己的方式受KRAS調(diào)節(jié)，形成一種KRAS-炎癥正反饋機(jī)制。然而還有哪些細(xì)胞、哪些因子參與其中，其作用機(jī)制如何目前并不清楚。

4.3 胰腺癌進(jìn)展

與其他實(shí)體瘤不同，胰腺癌內(nèi)存在大量結(jié)締組織而缺乏血管，形成一種乏氧微環(huán)境[30]。而胰腺癌細(xì)胞似乎可以通過(guò)多種機(jī)制來(lái)適應(yīng)這種低氧環(huán)境。例如通過(guò)改變糖酵解途徑降低其對(duì)Krebs循環(huán)的依賴(lài)來(lái)提高糖代謝[31]。最近也有研究顯示，胰腺癌細(xì)胞也可以通過(guò)控制代謝相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)因子來(lái)適應(yīng)其代謝變化[26]。因此，那些能夠通過(guò)作用于KRAS或其效應(yīng)分子，從而改變腫瘤細(xì)胞代謝或是損傷腫瘤細(xì)胞維持高水平糖酵解能力的藥物，則有望用于治療胰腺癌[32]。

5 結(jié) 語(yǔ)

目前的研究結(jié)果表明，持續(xù)穩(wěn)定高水平KRAS活性對(duì)于胰腺癌的形成是必須的。雖然其中很多具體機(jī)制目前仍不十分清楚，但是，KRAS與胰腺癌發(fā)生、發(fā)展的密切關(guān)系可以為臨床胰腺癌防治新途徑提供理論依據(jù)。例如KRAS受上游信號(hào)調(diào)節(jié)，可通過(guò)調(diào)整飲食或者生活方式預(yù)防炎癥反應(yīng)從而降低激活KRAS的可能性。此外，KRAS失活的研究表明，KRAS激活不僅在腫瘤的形成中非常重要，在腫瘤的發(fā)展維持中同樣必不可少。因此，KRAS將可能成為將來(lái)治療胰腺癌的一個(gè)重要靶點(diǎn)。

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