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(1. 廣西民族大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,廣西南寧 530006; 2. 廣西林產(chǎn)化學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西南寧 530006; 3. 廣西民族大學(xué)海洋與生物技術(shù)學(xué)院,廣西南寧 530006)

寬葉金粟蘭(Chloranthushenryi)為金粟蘭科金粟蘭屬植物,又名四塊瓦、四大天王、大葉及己、四葉細(xì)辛等,產(chǎn)于陜西、甘肅、安徽、浙江、福建、江西、湖南、湖北、廣東、廣西、貴州、四川等地。全草入藥,味辛,性溫,有毒,具祛風(fēng)除濕,活血散瘀,解毒的功效[1]。

藥理實(shí)驗(yàn)研究表明金粟蘭屬植物多具有抗菌、抗腫瘤、抗病毒、抗?jié)?、?zhèn)痛、抗血小板聚集、收縮子宮等活性[2]。目前,研究者已從寬葉金粟蘭中分離出了萜類、香豆素類、甾體及甾體皂苷類等化學(xué)物質(zhì)[3 - 5]。為了更好地開(kāi)發(fā)寬葉金粟蘭,筆者對(duì)其地上部分,即其莖和葉進(jìn)行了化學(xué)成分預(yù)實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)其含有糖類、有機(jī)酸、黃酮類等化學(xué)物質(zhì)。大多數(shù)天然黃酮類化合物都具有顯著的生理活性,如降血壓、降血脂,抗病毒、抗炎、抗氧化、抗菌等作用[6 - 8]。提取黃酮類化合物的方法有很多,最常用的方法有有機(jī)溶劑提取法、超聲波輔助提取法和微波輔助提取法等,而用微波輔助提取寬葉金粟蘭黃酮的文章幾乎未見(jiàn)報(bào)道。本研究采用微波輔助提取法對(duì)寬葉金粟蘭黃酮進(jìn)行提取,并結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)篩選出最佳的工藝條件。同時(shí)通過(guò)對(duì)寬葉金粟蘭黃酮提取物的還原力、DPPH自由基清除率及羥基自由基清除率的測(cè)定,對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行了評(píng)估,以期為寬葉金粟蘭的綜合利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 材料與儀器

寬葉金粟蘭 購(gòu)于廣西玉林中藥材市場(chǎng);蘆丁對(duì)照品,含量98%,批號(hào)100080 - 200707 購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;其余試劑均為分析純;水為超純水。

UV - 1800島津紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 蘇州島津儀器有限公司;XH - MC - 1型祥鵠實(shí)驗(yàn)室微波合成反應(yīng)器 北京祥鵠科技發(fā)展有限公司;PL203電子天平 梅特勒 - 托利多儀器有限公司;SPS401F型電子天平 奧豪斯國(guó)際貿(mào)易有限公司;AJF - 1001 - U型基礎(chǔ)性純水器 艾科浦公司。

1. 2 實(shí)驗(yàn)方法

1. 2. 1 總黃酮提取 將寬葉金粟蘭洗凈烘干,粉碎并過(guò)60目篩,備用。取寬葉金粟蘭粗粉5. 0g,于500mL燒瓶中加入適量乙醇溶液,在60℃恒溫水浴中浸泡1h后,設(shè)微波溫度為60℃,在設(shè)定的實(shí)驗(yàn)條件下(微波時(shí)間、微波功率、液料比和乙醇濃度等),采用微波輔助提取法提取寬葉金粟蘭中總黃酮。提取液經(jīng)活性炭超聲脫色20min后,收集濾液,置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮,再用50%乙醇溶液溶解并定容于100mL的容量瓶中,作為樣品溶液待測(cè)。

1. 2. 2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

1. 2. 2. 1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取蘆丁對(duì)照品18. 1mg,用50%乙醇溶液溶解,定容至100mL搖勻,配成0. 1810mg/mL的蘆丁對(duì)照品溶液,備用。

1. 2. 2. 2 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 取對(duì)照品溶液5. 0mL置于25mL容量瓶中,加入5%的亞硝酸鈉溶液1. 0mL,搖勻,靜置6min,加入10%硝酸鋁溶液1. 0mL,搖勻,靜置6min,加入4%氫氧化鈉溶液10. 0mL,再加入50%乙醇溶液定容,搖勻,放置15min后,用紫外 - 可見(jiàn)分光光度計(jì)在400 ～ 600nm范圍內(nèi)掃描。根據(jù)紫外吸收光譜圖確定檢測(cè)波長(zhǎng)為510nm。

1. 2. 2. 3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密量取0. 1810mg/mL的蘆丁對(duì)照品溶液0. 0、2. 0、4. 0、6. 0、8. 0、10. 0mL分別置于6個(gè)25mL的容量瓶中,按“1. 2. 2. 2”項(xiàng)下方法顯色后,在波長(zhǎng)510nm下測(cè)定吸光度值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1. 2. 3 樣品總黃酮含量的測(cè)定 精密量取樣品溶液1. 0mL置于50mL容量瓶中,加入5%的亞硝酸鈉溶液2. 0mL,搖勻,靜置6min,加入10%硝酸鋁溶液2. 0mL,搖勻,靜置6min,加入4%氫氧化鈉試液20. 0mL,再加入50%乙醇溶液定容,搖勻,放置15min后在510nm處測(cè)定吸光值。利用回歸方程可計(jì)算出總黃酮含量。

1. 2. 4 單因素實(shí)驗(yàn) a. 精密稱取寬葉金粟蘭5份,按料液比1∶ 30,分別添加不同體積分?jǐn)?shù)(40%、50%、60%、70%、80%)的乙醇溶液,60℃水浴浸泡1h,然后以400W的微波功率,60℃的微波溫度,處理15min。b. 精密稱取寬葉金粟蘭5份,按料液比1∶ 30添加60%乙醇溶液,60℃水浴浸泡1h,然后以不同的微波功率(200、300、400、500、600W),60℃的微波溫度,處理15min。c. 精密稱取寬葉金粟蘭6份,按料液比1∶ 30,添加60%乙醇溶液,在60℃水浴浸泡1h,然后以400W的微波功率,60℃的微波溫度,按不同時(shí)間(5、10、15、20、25、30min)處理。d. 精密稱取寬葉金粟蘭5份,分別按不同的料液比(1∶ 20、1∶ 30、1∶ 35、1∶ 40、1∶ 50)添加60%乙醇溶液,在60℃水浴浸泡1h,然后以400W的微波功率,60℃的微波溫度,處理10min。

1. 2. 5 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,以不同乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、微波功率(B)、微波處理時(shí)間(C)、料液比(D)為考察因素,寬葉金粟蘭總黃酮提取率為考察指標(biāo),選用L9(34)正交表設(shè)計(jì),探討最佳提取工藝條件。各因素水平見(jiàn)表1。

1. 2. 6 抗氧化活性測(cè)定

1. 2. 6. 1 清除DPPH自由基能力的測(cè)定 參考文獻(xiàn)[9 - 11]，按最優(yōu)工藝條件提取得的黃酮濃縮物,用50%乙醇溶液溶解并定容于100mL的容量瓶中,得到樣品溶液,測(cè)定其黃酮的質(zhì)量濃度為6. 0mg/mL,再稀釋配制成含黃酮的質(zhì)量濃度為0. 2、0. 3、0. 4、0. 5、0. 6、0. 7、0. 8mg/mL的樣品溶液。在試管中依次加入0. 2mmol/L的DPPH乙醇溶液5. 0mL,再加入5. 0mL不同濃度的樣品溶液。振蕩器混勻后,室溫,避光放置30min后于517nm 下測(cè)定吸光度,計(jì)算清除率。

清除率(%)=[1 - (A1- A2)/A0]×100

接著，徐通理給他細(xì)細(xì)解釋“色即空，空即色”的處世哲學(xué)：他們把人生所需要的能看得見(jiàn)摸得著的東西都?xì)w納為色，把無(wú)求無(wú)欲的崇高的為人道德歸納為空。人只有達(dá)到無(wú)求無(wú)欲這種“空”的境界，才能求得正果而獲得一切。如果只求“色”的東西，求來(lái)求去，越求反而離自己所需的東西越遠(yuǎn)了。接著，老人又說(shuō)，普通人大多一味地只求“色”的東西，這么一味地求下去，就叫作塵緣未了。

式中:A0為DPPH·溶液5. 0mL+無(wú)水乙醇5. 0mL的吸光值;A1為DPPH·溶液5. 0mL+樣品溶液5. 0mL的吸光值;A2為樣品溶液5. 0mL+無(wú)水乙醇5. 0mL的吸光值。

同法以相同濃度的VC做對(duì)照實(shí)驗(yàn),所有測(cè)定平行操作3次,取平均值。

1. 2. 6. 2 清除羥基自由基能力的測(cè)定 參考文獻(xiàn)[12 - 14]，在試管中分別加入2mL pH=7. 4的磷酸鹽緩沖液,0. 3mL 5mmol/L鄰二氮菲溶液,充分混勻后,加入0. 2mL 7. 5mmol/L 硫酸亞鐵溶液,每加一管后立即混勻。然后向其中加入不同黃酮質(zhì)量濃度的樣品溶液,混勻,再加入1%的雙氧水1mL,最后補(bǔ)充體積至8mL。另再做損傷管和未損傷管,其中損傷管中加入1%的雙氧水1mL,未損傷管不加雙氧水,最后補(bǔ)充各管體積至8mL。于37℃下保溫1h,在536nm下測(cè)吸光值。同法以相同濃度的VC做對(duì)照實(shí)驗(yàn),每個(gè)實(shí)驗(yàn)組重復(fù)3次,求得平均值,按下式計(jì)算清除率。

清除率(%)=(A樣- A損)/(A未損- A損)×100

式中:A未損為未損傷管的吸光值;A損為損傷管的吸光值;A樣為加樣品液的吸光值。

1. 2. 6. 3 還原能力的測(cè)定 參考文獻(xiàn)[15 - 17]，分別準(zhǔn)確吸取2. 0mL不同黃酮質(zhì)量濃度的樣品溶液,各加入0. 2mol/L pH6. 8磷酸緩沖液2. 5mL,再加1%的鐵氰化鉀溶液2. 5mL,50℃水浴20min后急速冷卻,加入10%的三氯乙酸溶液2. 5mL,于4000r/min離心10min,取上清液2. 5mL,加蒸餾水2. 5mL,0. 1%的三氯化鐵溶液0. 5mL,混合10min后于700nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以VC作為對(duì)照樣品,每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次后求得平均值,繪制總還原能力變化曲線。

2 結(jié)果與分析

2. 1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以蘆丁質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo),吸光度值(y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,得回歸方程為y=11. 417x -0. 0078,R2=0. 9996;結(jié)果表明蘆丁在0. 01448 ～0. 07240mg/mL范圍內(nèi)與吸光度值呈良好的線性關(guān)系。

2. 2 單因素實(shí)驗(yàn)

2. 2. 1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮得率的影響 由圖1可知,總黃酮的得率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而先上升后下降。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到60%時(shí),總黃酮得率最高,之后開(kāi)始呈下降趨勢(shì)。分析其原因可能是因?yàn)槲锪现械乃肿邮侵饕奈⒉芪照?可以產(chǎn)生大量熱使物料升溫,隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加,水的比例減少了,使物料升溫減慢從而影響了得率。另外高濃度乙醇使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)凝固,黃酮不易溶出。因此,初步確定最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮得率的影響Fig. 1 Effect of ethanol concentration on the yield of total flavonoids

2. 2. 2 微波功率對(duì)總黃酮得率的影響 由圖2可知,黃酮的得率隨微波功率的增加而逐漸提高,當(dāng)微波功率達(dá)到400W時(shí),總黃酮提取率達(dá)到最大值,之后隨著微波功率的增加,含量呈下降趨勢(shì)。分析其原因,微波功率增大,對(duì)細(xì)胞的破壞力增強(qiáng),細(xì)胞的溶出物增多,黃酮得率增高。但微波功率過(guò)高,會(huì)造成樣品中細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)變性,從而影響黃酮類物質(zhì)的溶出。因此,最佳微波功率選定400W。

圖2 微波功率對(duì)提取效果的影響Fig. 2 Effect of microwave power on extraction

2. 2. 3 微波處理時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響 由圖3可知,黃酮的得率隨微波作用時(shí)間的增加而提高,當(dāng)微波處理時(shí)間達(dá)到10min時(shí),總黃酮得率最高,之后隨著微波處理時(shí)間的增加,呈下降趨勢(shì)。這可能是在一定的功率下微波時(shí)間越長(zhǎng),溫度越高,對(duì)細(xì)胞的破壞就越完全,溶出物也越多,得率呈上升趨勢(shì)。 但過(guò)長(zhǎng)的微波時(shí)間會(huì)導(dǎo)致部分黃酮受熱變質(zhì),黃酮得率反而下降。因此,最佳微波處理時(shí)間初步選定10min。

圖3 微波處理時(shí)間對(duì)提取效果的影響Fig. 3 Effect of microwave time on extraction

2. 2. 4 料液比對(duì)總黃酮得率的影響 由圖4可知,當(dāng)料液比達(dá)到1∶ 30時(shí),總黃酮得率最高,之后隨著溶劑的增加,含量呈下降趨勢(shì)。這是由于增加溶劑量有利于黃酮的溶出,但繼續(xù)加大溶劑量會(huì)影響提取體系的傳熱和傳質(zhì),從而影響黃酮的提取。因此,最佳料液比選定1∶ 30。

圖4 料液比對(duì)總黃酮得率的影響Fig. 4 Effect of solid to liquid ratio on extraction

2. 3 正交實(shí)驗(yàn)

2. 3. 1 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果 正交實(shí)驗(yàn)和方差分析結(jié)果見(jiàn)表2和表3,由極差分析可知各因素對(duì)寬葉金粟蘭總黃酮提取率的影響大小順序依次為:A>C>D>B,即乙醇體積分?jǐn)?shù)和微波處理時(shí)間影響最大,微波功率影響最小;方差分析表明A因素和C因素具有顯著性,是影響提取效果的重要因素。故最佳提取條件為:A3B2C2D2,即乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%、微波功率為300W、微波處理時(shí)間為15min、料液比為1∶ 30。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 The results of orthogonal test method

表3 方差分析結(jié)果Table 3 The results of variance analysis

注：F0.05(2,2)=19. 0；F0.01(2,2)=99. 0。

2. 3. 2 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 按照正交實(shí)驗(yàn)獲得的最優(yōu)組合:即乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%、微波功率為300W、微波處理時(shí)間為15min、料液比為1∶ 30,進(jìn)行微波輔助提取實(shí)驗(yàn),重復(fù)5次平行操作,其總黃酮的平均得率是6. 11%。結(jié)果優(yōu)于正交實(shí)驗(yàn)中的最高得率,表明通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)研究達(dá)到了優(yōu)化目的。

2. 4 寬葉金粟蘭總黃酮體外抗氧化能力

2. 4. 1 清除DPPH自由基的能力 從圖5 可以看出,隨著樣品質(zhì)量濃度的增加(由0. 2 ～ 0. 8 mg/mL),寬葉金粟蘭黃酮對(duì)DPPH自由基的清除率從72. 4% 增加到76. 2%。與同等質(zhì)量濃度的VC相比較,寬葉金粟蘭黃酮對(duì)DPPH自由基的清除率略低于VC的清除率。在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi),VC對(duì)自由基的清除率在77. 8% ～ 85. 3%范圍內(nèi)。

圖5 寬葉金粟蘭黃酮提取物和抗壞血酸對(duì)DPPH自由基的清除作用Fig. 5 Scavenging effect of extract and VC on DPPH radical

2. 4. 2 清除羥基自由基的能力 由圖6可知,兩者對(duì)清除羥基自由基均有較好的量效關(guān)系。當(dāng)提取物的濃度由0. 2mg/mL 增加至0. 8mg/mL 時(shí),其對(duì)羥基自由基的清除率由2. 23% 上升到 100%。在小于0. 5mg/mL的質(zhì)量濃度下,寬葉金粟蘭黃酮的清除羥基自由基能力低于VC;質(zhì)量濃度大于0. 5mg/mL時(shí)清除能力呈逐漸增強(qiáng)趨勢(shì),寬葉金粟蘭黃酮的清除羥基自由基能力明顯高于VC。

圖6 寬葉金粟蘭黃酮提取物和抗壞血酸對(duì)羥自由基的清除作用Fig. 6 Scavenging effect of extract and VC on hydroxyl free radical

2. 4. 3 還原力 由圖7可知,反應(yīng)體系中,寬葉金粟蘭黃酮提取物的樣品溶液與VC的吸光度都隨質(zhì)量濃度的增加而增大,在0. 2 ～ 0. 5mg/mL的濃度下,兩者的還原能力接近且具有相似的上升趨勢(shì);0. 6mg/mL的濃度下兩者還原能力有較大差距;0. 7 ～ 0. 8mg/mL的濃度下還原能力又趨于接近。說(shuō)明寬葉金粟蘭黃酮提取物具有較強(qiáng)的還原能力。

圖7 寬葉金粟蘭黃酮提取物和抗壞血酸的還原能力Fig. 7 Reducing power of extract and VC

3 結(jié)論

3.1本文采用微波輔助提取法探索了各單因素對(duì)寬葉金粟蘭中總黃酮得率的影響,并進(jìn)行了正交實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明,微波輔助提取寬葉金粟蘭總黃酮的最佳工藝條件為:乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、微波功率300W、微波處理15min、料液比為1∶ 30。在上述最佳工藝條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),得到總黃酮得率為6. 11%,結(jié)果高于正交實(shí)驗(yàn)中的最高提取率,表明通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)研究達(dá)到了優(yōu)化目的。微波提取法操作簡(jiǎn)單,可以極大地縮短提取時(shí)間,且能達(dá)到較高的提取效率,是一種較為理想的提取寬葉金粟蘭總黃酮的方法。

3.2體外抗氧化活性實(shí)驗(yàn)表明,寬葉金粟蘭總黃酮具有很強(qiáng)的自由基清除力和還原能力,在一定范圍內(nèi),清除效果隨著質(zhì)量濃度的升高而加強(qiáng),具有明顯的量效關(guān)系。在實(shí)驗(yàn)濃度(0. 2 ～ 0. 8mg/mL)范圍內(nèi),寬葉金粟蘭黃酮對(duì)羥基自由基的清除率可達(dá)到100%,對(duì)DPPH自由基的清除率可達(dá)到76. 2%。與VC相比,寬葉金粟蘭黃酮提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力略低于同質(zhì)量濃度的VC,但其黃酮提取物對(duì)羥基自由基的清除能力與同質(zhì)量濃度的VC相當(dāng),甚至在質(zhì)量濃度較高時(shí),超過(guò)VC。這可能是因?yàn)榻鹚谔m黃酮提取物對(duì)不同的自由基表現(xiàn)的敏感性不同。同時(shí),金粟蘭黃酮提取物還有與VC相當(dāng)?shù)倪€原能力?？偟膩?lái)說(shuō),寬葉金粟蘭黃酮提取物具有較強(qiáng)的抗氧化活性,這預(yù)示著它在醫(yī)學(xué)和人類保健事業(yè)上有著潛在的利用價(jià)值,具有一定的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用前景。

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