黃娟 王荷花 張小驥 潘博宇 陳孝平 吳元欣

（武漢工程大學化工與制藥學院 綠色化工過程教育部重點實驗室，武漢 430073）

人乙醛脫氫酶2的原核表達及其活性的鑒定

黃娟 王荷花 張小驥 潘博宇 陳孝平 吳元欣

（武漢工程大學化工與制藥學院 綠色化工過程教育部重點實驗室，武漢 430073）

商品化的乙醛脫氫酶主要從動物細胞、肝細胞線粒體中提取，其來源受到很大的限制，而且價格昂貴。為了解決乙醛脫氫酶原料有限的問題，利用微生物發(fā)酵法獲取乙醛脫氫酶。 將人乙醛脫氫酶2基因（aldh2）克隆至原核表達載體pET32a中，構建重組載體pET32a-ALDH2。將構建的重組載體轉化大腸桿菌E.coli BL21（DE3），用異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）進行誘導，SDS-PAGE電泳結果顯示目的蛋白得到大量表達；且對誘導表達條件進行優(yōu)化。結果顯示，在37℃，1.0 mmol/L IPTG誘導表達6 h為最優(yōu)表達條件。由于目的蛋白幾乎都是以包涵體形式表達，為了得到有活性的乙醛脫氫酶，對包涵體變性、復性和純化進行了研究。試驗數據顯示，酶的最終得率為14.49 U/L。并通過用Bradford法，測定復性蛋白的濃度約為77 μg/mL，進行活性檢測表明，該復性蛋白具有乙醛脫氫酶活性，酶活性約為1.449 U/mL。通過構建重組載體pET32a-ALDH2和優(yōu)化表達條件，aldh2在原核表達宿主E.coli BL21（DE3）得到大量表達；此外，利用透析復性法得到的復性蛋白酶活性有所提高。

乙醛脫氫酶2 克隆 條件優(yōu)化 酶活鑒定

人體內的乙醛脫氫酶主要有乙醛脫氫酶1（aldh1）和乙醛脫氫酶2（aldh2）兩種，乙醛的氧化主要是依靠二者來完成，而aldh2對乙醛的活性要高出aldh1的50倍［1］。aldh2是乙醛脫氫酶的一

種，是人體酒精代謝的關鍵［2］。它在人體的主要作用是將人體內的酒精代謝后產生的乙醛脫氫氧化為無毒的乙酸，乙酸再進入TCA循環(huán)代謝為二氧化碳和水。在整個代謝過程中，乙醛脫氫酶是限速酶［3］。有研究報道，乙醛對人體有致癌作用，它與人類腫瘤的發(fā)生也有關系［4］。飲酒是食道癌的危險因素之一［5-7］。當人過量飲酒時，酒精的代謝產物乙醛不能及時被氧化，就會在體內積累，容易誘發(fā)肝癌［8］。由于aldh2在代謝乙醛中催化效率最高，所以aldh2在乙醛脫氫酶的研究中受到人們更廣泛的關注。

目前，商品化的乙醛脫氫酶主要是從動物肝臟、肝細胞線粒體中提取，資源很有限且價格昂貴，大規(guī)模生產困難。獲得乙醛脫氫酶比較傳統(tǒng)的方法主要是從微生物體內提取，Zarnt教授［9］利用四氫呋喃甲醇培養(yǎng)基培養(yǎng)Ralstonia eutropha，并分離純化出了乙醛脫氫酶。香港中文大學的Wing-Ping Fong和Ka-Fai Choy教授［10］提出了一種以草魚的內臟為原材料，從其線粒體內分離提取aldh2的方法。該方法對原料進行勻漿混合預處理后依次通過高速離心分離，超濾濃縮并使用柱層析后得到比活為4.46 U/mg的aldh2。為了解決乙醛脫氫酶資源有限的問題，許多科研工作者都試圖從微生物的發(fā)酵來獲取大量的乙醛脫氫酶。黃坤等［11］利用畢氏酵母分泌表達aldh2時，在優(yōu)化的誘導條件下可制備大量aldh2，但由于酵母的生長周期比較長，所以得到的目的蛋白的活性最高只能達到0.115 U/mL。趙錦等［12］也曾嘗試過在酵母中表達乙醛脫氫酶，經分離純化后的乙醛脫氫酶液的酶活為0.994 U/mL。由于受酵母本底表達的影響，導致乙醛脫氫酶的表達量很少，而且表達出來的酶活性較低。

本研究通過更換表達載體和宿主菌來提高乙醛脫氫酶的表達量，即用原核表達載體pET32a在原核表達宿主E.coli BL21（DE3）中表達乙醛脫氫酶，并對表達條件進行優(yōu)化。由于目標蛋白是以包涵體的形式表達，為了得到有活性的蛋白，所以對包涵體變性、復性和純化，并對復性蛋白的活性進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 高保真酶Pyrobest DNA Polymerase，限制性內切酶Nde I、Pst I、Xho l、Sma I、EcoR V、EcoR I、T4 DNA Ligase、1 kb和500 bp DNA Marker購自TaKaRa公司；質粒小提試劑盒購自天根生物公司；瓊脂糖凝膠、低溶點瓊脂糖凝膠、IPTG、TEMED購自Sigma公司；蛋白分子量標準、丙烯胺購自北京普利萊公司；巰基乙醇、β-NAD、BSA購自Amresco公司；Ni-NTA Agarose購自Invitrogen公司。

1.1.2 菌株、質粒和培養(yǎng)基 用于分子克隆的宿主E.coli DH5α，用于表達的宿主E.coli BL21（DE3）由本實驗室保存。原核克隆載體pBluescriptSKII和原核表達載體pET32a本實驗室保存。帶有aldh2基因的克隆載體pUC57-6His-ALDH2由本實驗室構建保存。LB培養(yǎng)基（胰蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L，氯化鈉10 g/L；固體培養(yǎng)基添加1.5%瓊脂粉）用于大腸桿菌的培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 原核表達載體的構建

1.2.1.1 重組載體pBluescriptSKII-aldh2的構建 以pUC57-6His-aldh2為 模 板，P1（5'-AAACATATGTCAGCCGCCGCCACCCAG-3'），P2（5'-AAACTCGAGTGAGTTCTTCTGAGGCACTTT-3'）為引物，PCR擴增aldh2片段，再用低熔點膠回收目的片段［13］。將堿裂解法［14］提取的質粒pBluescriptSKII用限制性內切酶EcoR V作單酶切后，低熔點膠回收?；厥蘸蟮哪康钠魏洼d體用T4連接酶16℃過夜連接，連接產物轉化E.coli DH5α感受態(tài)細胞，藍白斑篩選重組子［15］。對陽性重組子進行藍白斑初選后，為了進一步確認陽性結果，對其中一個菌做酶切鑒定。

1.2.1.2 表達載體pET32a-aldh2的構建 將質粒pBluescriptSKII-aldh2和表達載體pET32a分別用限制性內切酶Nde 1和Xho I雙酶切，將切下的1 500 bp目的片段和載體pET32a片段用低熔點膠回收后，再用T4連接酶16℃過夜連接，連接產物轉化E.coli DH5α感受態(tài)細胞，轉化的菌種涂于含氨芐青霉素的平板，過夜培養(yǎng)后，挑取單菌落用PCR菌落法［16］篩選重組子，再進行酶切鑒定及DNA測序驗證。

1.2.2 原核表達載體pET32a-aldh2的誘導表達 將陽性克隆接種于LB液體培養(yǎng)基（含50 μg/mL的AMP），37℃過夜培養(yǎng)，用堿裂解法提取質粒。重組

質粒pET32a-aldh2轉化100 μL BL21（DE3）感受態(tài)細胞，構建工程菌。

取1 mL過夜培養(yǎng)的工程菌至100 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃ 200 r/min振蕩培養(yǎng)，待OD600nm=0.5時，分別加入終濃度為0.1、0.5和1.0 mmol/L IPTG，30℃和37℃誘導表達6 h。將菌液離心，棄上清，用PBS緩沖液重懸菌體，在沸水中煮10 min。用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測aldh2是否表達。

1.2.3 乙醛脫氫酶活性的研究

1.2.3.1 收集包涵體 取2 mL過夜培養(yǎng)的工程菌接種于200 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃ 200 r/min振蕩培養(yǎng)，待OD600nm=0.5時，加入IPTG的終濃度為1 mmol/L，37℃誘導表達6 h，收集誘導表達的菌體，離心棄上清，用PBS緩沖液洗滌菌體3次后，20 mL PBS緩沖液重懸細菌，在超聲波破碎儀下破碎25 min（功率300 W，工作2 s，間歇4 s），然后于4℃ 1 200 r/min下離心30 min棄上清，包涵體洗滌緩沖液洗滌兩次后再用蒸餾水洗滌兩次，離心，收集包涵體。

1.2.3.2 包涵體的變性、復性和純化 將收集的包涵體溶于4 mL包涵體溶解緩沖液（8 mol/L脲，50 mmol/L Tris，1 mmol/L EDTA，100 mmol/L NaCl，pH8.0）中，室溫振蕩1 h，離心15 min收集上清。對于變性蛋白的復性，采取了透析復性法：上清放入預先處理好的透析袋中，依次將透析袋放入6、4、3、2以及1 mol/L尿素復性緩沖液中，分別在4℃下透析3 h。最后在PBS緩沖液中過夜透析，收集復性蛋白。由于表達載體pET32a帶有6His融合標簽，所以本試驗用Ni-NTA樹脂純化重組蛋白。將透析復性的蛋白經過預先處理的鎳柱，在4℃下結合1 h，再用不同濃度的咪唑洗脫液洗脫柱子，收集洗脫液（含目的蛋白）做電泳檢測。

1.2.3.3 重組蛋白的酶活檢測 采用考馬斯亮藍法（Bradford法）測定粗酶液中蛋白的含量。由于NAD+、NADH分別在260 nm、340 nm處有最大的吸收峰，故酶、輔酶NAD+和底物在一定條件下反應，通過測定一定時間340 nm吸光度的變化值，可以計算出NAD+轉化為NADH的量，根據酶活的定義計算得到該酶的酶活。酶活性測定方法見文獻［17］，測定體系是對Okibe反應體系［18］的改進，按表1設計酶活測定體系。

表1 酶活測定反應體系

最后加入酶液后，立即混勻，迅速倒入比色皿中，在340 nm處測定光吸收變化值（每分鐘測定一個吸光值）。酶活的定義：最適條件下，每分鐘轉化1 μmol底物為1個活力（U），可得到反應體系里ALDH2的酶活計算公式為：

2 結果

2.1 乙醛脫氫酶2（aldh2）基因的克隆

以pUC57-6His-aldh2為模板，上述設計的P1、P2為引物，擴增aldh2片段，以1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，發(fā)現(xiàn)1 500 bp處有明顯的條帶（圖1），與預期的aldh2基因大小一致。

圖1 aldh2基因擴增產物

2.2 pBluescriptSKII-aldh2重組子的篩選及酶切鑒定

將擴增的aldh2片段和經EcoR V酶切的pBluescriptSKII用低熔點膠回收后，16℃過夜連接，

再將連接產物轉化DH5α感受態(tài)細胞后涂布于有IPTG和X-gal的篩選平板上，過夜培養(yǎng)。挑取白斑分別做兩組酶切，即Sma I單酶切，Nde I和Xho I雙酶切，鑒定為陽性克隆（圖2）。

圖2 重組載體pBluescriptSKII-aldh2構建（A）及酶切鑒定圖（B）

2.3 pET32a-aldh2重組子的篩選及酶切鑒定

將用菌落PCR鑒定的陽性重組子pET32a-aldh2分別做兩組酶切，即Pst I單酶切，Nde I和Xho I雙酶切，試驗結果與預期一致，鑒定為陽性克?。▓D3）。將重組子測序，以T7 Promoter Primer為引物。對測序結果進行分析，測得序列與NCBI上公布的aldh2基因序列一致。測序結果表明，aldh2基因已成功構建到pET32a載體上。

圖3 重組載體pET32a-aldh2構建（A）及酶切鑒定圖（B）

2.4 重組蛋白的誘導表達及純化

2.4.1 重組蛋白誘導表達條件的優(yōu)化 分別從溫度和IPTG濃度兩個因素來優(yōu)化表達條件。離心收集菌體，SDS-PAGE檢測分析全菌蛋白的表達，如圖4所示，幾組不同的誘導條件，全菌蛋白中均含有大約為55 kD誘導蛋白，與預期的乙醛脫氫酶的分子量一致。隨著IPTG濃度的增加，乙醛脫氫酶的表達量明顯增多，且37℃表達組明顯優(yōu)于30℃表達組。而且試驗還從誘導時間進行優(yōu)化，在37℃，IPTG濃度為1.0 mmol/L，分別對誘導表達2、4、6和8 h的蛋白進行電泳檢測分析（圖5），隨著誘導時間的增加，蛋白的表達量也隨之增加。

2.4.2 重組蛋白的純化 由于目的蛋白是以包涵體的形式表達，所以要得到具有生物活性的乙醛脫氫酶，需要對包涵體進行變性，復性和純化才能檢測其活性。將收集的包涵體溶于適量包涵體溶解緩沖液后，離心收集上清液，即得到變性的重組蛋白。變性的重組蛋白采用透析復性法復性后，收集復性蛋白。再將復性蛋白經過預先處理的鎳柱，4℃下結合1 h，分別用10、20、40、60、80、100和200 mmol/L 咪唑洗脫液洗柱，并收集洗脫液。如圖6所

示，當咪唑的濃度為60 mmol/L時，目的蛋白開始被洗脫，且隨著咪唑濃度的增加蛋白被大量洗脫。將圖中6-9號的洗脫液合并，得到粗酶液。為除去粗酶液中的鹽離子，將其在60 mmol/L咪唑緩沖液中4℃過夜透析。

圖4 不同誘導表達條件的電泳圖

圖5 不同誘導時間下的蛋白表達量

圖6 目標蛋白在不同濃度咪唑洗脫液中的分布

2.5 重組蛋白的酶活性檢測

試驗對透析復性法得到的重組蛋白進行酶活性測定。在酶活測定體系中，總反應體系為3 mL，加入的酶液為10 μL，每分鐘讀取1次A340，以OD340對反應時間作圖（圖7）。

圖7 蛋白酶活性測定

取反應曲線的5-10 min內，計算每分鐘內OD340的減少值。根據活力單位U的定義（最適條件下，每分鐘轉化1 μmol底物為1個活力單位），計算A340的變化約為0.03 mim-1，則反應體系里ALDH2的酶活為10 μL的原酶液里有0.014 49 U，那么得到粗酶液的酶活為1.449 U/mL。最終得到的粗酶液為2 mL，發(fā)酵液的總體積為200 mL，則酶的最終得率為14.49 U/L，即每單位體積發(fā)酵液中活得的酶活力。

3 討論

在大腸桿菌表達系統(tǒng)中，大部分表達載體采用誘導型啟動子控制目的基因的表達。誘導型啟動子能控制基因在特定時期、特定部位表達，這既避免了目的基因在宿主細胞內高表達對宿主細胞生長的影響，又可減少菌體蛋白酶對目標產物的降解。本試驗采用pET32a表達載體，在IPTG誘導下目的蛋白得到大量表達。此外，表達載體上帶有6個組氨酸標簽，有利于下游蛋白的純化。由于目的蛋白是以包涵體形式表達，試驗對包涵體的變性，復性和純化做了研究，并對復性蛋白的酶活性進行鑒定。研究結果有以下兩點：（1）對于重組蛋白的復性，嘗試了稀釋復性法、透析復性法和柱上復性法，但結果顯示透析復性法得到的乙醛脫氫酶活性要高于其他兩種方法。（2）通過酶活性檢測，復性后蛋白的活力為1.449 U/mL，而趙錦等在酵母中表達乙醛脫氫酶，經分離純化后的乙醛脫氫酶液的酶活為0.994 U/mL。本試驗中發(fā)酵液總體積為200 mL，得到的粗酶液為2 mL，則酶的最終得率為14.49 U/L。其他研究人員利用酵母表達并分離純化了乙醛脫氫酶，酶的最終得率僅為11.35 U/L［19］，并且該酶的表達量偏低［11］，可能原因是：（1）酵母表達的外源蛋白在內質網中的聚集造成分泌蛋白減少［20］；（2）

酵母發(fā)酵過程中培養(yǎng)基pH值的變化使得酵母蛋白酶的活性較強，從而導致了外源蛋白的降解［21，22］。本試驗獲得了較高的乙醛脫氫酶的酶活力和表達量，所以運用基因工程表達乙醛脫氫酶，原核表達系統(tǒng)要優(yōu)于酵母表達。但是原核表達乙醛脫氫酶時，雖然優(yōu)化了多種表達條件（如溫度，IPTG濃度，培養(yǎng)時間，振蕩速度等），均無法獲得可溶性的表達產物（結果未展示），而采用變性和復性的技術手段不可避免的導致酶活性的損失和得率的下降。更換表達載體或者進行融合蛋白的表達，可能是解決原核表達乙醛脫氫酶形成包涵體的有效途徑之一。

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（責任編輯 李楠）

Expression and Activity Assay of Human Aldehyde Dehydrogenase2 in Escherichia coli

Huang Juan Wang Hehua Zhang Xiaoji Pan Boyu Chen Xiaoping Wu Yuanxin
（School of Chemical Engineering and Pharmacy，Wuhan Institute of Technology，Key Laboratory for Green Chemical Process of Ministry of Education，Wuhan 430073）

The commercial acetaldehyde dehydrogenase is mainly extracted from animal cell and hepatocellular mitochondria. Source is limited and the cost is high. So the micobiological fermentation was used to obtain large amounts of aldh2, which had been cloned into the expression vector pET32a with 6His tag that was advantageous to purify the recombinant protein by nickel-chelate chromatography, then the recombinant was transformed into E.coli BL21（DE3）. After induced by IPTG, the recombinant protein had been expressed and their molecular masses were determined to be approximately 55 kD by SDS-PAGE. Through the optimization of inducing expression conditions, the results showed that the condition（37℃, 1.0 mmol/L IPTG, induced for 6 h）is the optimal. Because all target protein were almost expressed in the form of inclusion body, the bioactive acetaldehyde dehydrogenase was obtained by means of degeneration, purification and renaturation for the inclusion body, and measured the concentration of the renaturated protein by the Bradford method that was 77 μg/mL. Experimental data showed that the final yield of enzyme was 14.49 U/L. Activity tests showed that the protein has the acetaldehyde dehydrogenase activity of about 1.449 U/ mL. By constructing a recombinant vector pET32a-ALDH2 and optimizing the expression condition, aldh2 in prokaryotic expression host get a lot of expression. In addition, the activity of renaturation protein was improved by the dialysis renaturation method.

aldh2 Cloning Condition optimization Activity assay

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2014.12.034

2014-05-26

國家自然科學基金項目（81172178）

黃娟，女，碩士研究生，研究方向：微生物發(fā)酵及下游產物的分離；E-mail：huangjuan412@foxmail.com

吳元欣，男，博士，教授，研究方向：微生物發(fā)酵及下游產物的分離；E-mail：wyx@mail.wit.edu.cn